公开/公告号CN1417345A
专利类型发明专利
公开/公告日2003-05-14
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学院大连化学物理研究所;
申请/专利号CN01133410.X
申请日2001-11-06
分类号C12P33/20;
代理机构21001 沈阳晨创科技专利代理有限责任公司;
代理人张晨
地址 116023 辽宁省大连市中山路457号
入库时间 2023-12-17 14:44:30
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-11-01
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12P19/44 授权公告日:20040922 终止日期:20181106 申请日:20011106
专利权的终止
2017-06-30
专利权的转移 IPC(主分类):C12P19/44 登记生效日:20170613 变更前: 变更后: 申请日:20011106
专利申请权、专利权的转移
2008-03-26
专利申请权、专利权的转移(专利权的转移) 变更前: 变更后: 登记生效日:20080222 申请日:20011106
专利申请权、专利权的转移(专利权的转移)
2004-09-22
授权
授权
2003-07-30
实质审查的生效
实质审查的生效
2003-05-14
公开
公开
2002-03-20
实质审查的生效
实质审查的生效
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技术领域:
本发明涉及由人参皂甙制备20-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇(俗称Compound-K,以下简称C-K)的方法,特别是涉及粗蜗牛酶水解制备方法。
背景技术:
人参皂甙C-K是二醇型人参皂甙经口服后在肠道中的代谢产物,研究表明:C-K有抗肿瘤和免疫调节作用、改善微循环作用、调节消化机能、安神、抗衰老、抗紧张、预防消化道溃疡、提高生命质量、增强记忆力和学习能力等多种生物活性。因此,C-K的生产方法备受关注。小桥恭一等〔Chem Pharm Bull 21(3):245-249,1988〕将500mg人参皂甙Rb1和250mg柚皮甙酶溶于32ml磷酸缓冲液(pH4.0,含10%的乙醇)中,于40℃水浴中水解3天;将反应液离心分为沉淀和母液,沉淀溶于3.5ml乙醇中,并与32ml缓冲液和250mg柚皮甙酶一起加入母液中,于40℃水浴中再水解7天。用乙醚萃取反应液,乙醚相蒸干得人参皂甙C-K。母液用正丁醇萃取,正丁醇相经水洗、干燥、蒸干得残余物;残余物经制备TLC分离出C-K;合并C-K得253mg。该法收率高(86%),但有下列缺陷:水解时间长;酶的用量大,并且酶的来源不方便,也不经济;需使用易爆品乙醚萃取,因此,不适于大批量生产。
发明的技术内容:
为了简单、方便、低成本、大批量地制备C-K,本发明提供了一种用酶水解人参皂甙制备C-K的方法,包括水解、收集步骤,其特征在于:用蜗牛酶在缓冲液中水解二醇型人参皂甙,二醇型人参皂甙与蜗牛酶重量比为1∶1~10∶1,pH值在4.0~5.0之间,水解温度30~45℃,水解时间2~3天。
本发明用酶水解人参皂甙制备C-K的方法中,收集过程是:反应沉淀物用水洗涤后,再用乙醇反复洗涤。合并乙醇液蒸干后,收集的残余物即为C-K。
收集过程中反应沉淀物用水反复洗涤后,可将洗液与母液合并,浓缩后再次用于酶水解。
本发明用酶水解人参皂甙制备C-K的方法中,所用蜗牛酶可以为粗蜗牛酶。
粗蜗牛酶水解二醇型人参皂甙的最适温度为40℃,最适pH为4.5,离子强度越低越好,缓冲液的种类对酶活性影响不大;本发明选用pH4.5,离子强度为0.01的磷酸-柠檬酸缓冲液。
本发明用酶水解人参皂甙制备C-K的方法中,反应液中应该加入一定量的有机溶剂,有机溶剂对中间产物起助溶作用,有利于酶水解反应的正常进行。有机溶剂的种类和加入量以不影响酶活性为准。经筛选,以5~15%的乙醇最佳。
本发明用酶水解人参皂甙制备人参皂甙K化合物的方法中,二醇型皂甙与酶的比例以6∶1最为经济;一般地说,水解8小时后,再延长水解时间,C-K的产量增加极少,因此,勿需加长水解时间。
本发明为人参二醇皂甙酶解制备人参皂甙C-K提供了一种来源方便、价格低廉的酶,用该酶制备C-K工艺简单方便、成本低、回收率高。使用本方法制备的C-K含量≥95%,甙元收率≥91%。下面通过实施例详述本发明。
附图说明:
图1为pH对C-K产量的影响;
图2为物料比对C-K产量的影响;
图3为温度对C-K产量的影响;
图4为离子强度对对C-K产量的影响;
图5为C-K产量随时间的变化关系;
图6为缓冲液种类对对C-K产量的影响。
具体实施方式:
实施例1
500mg二醇型人参皂甙,84mg蜗牛酶溶于32ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5,离子强度为0.01,含10%的乙醇)中,于40℃水浴中水解1天;反应液经离心收集沉淀;用水反复洗涤沉淀(10ml×3),洗液与母液合并,浓缩至32ml供再次使用;用乙醇反复洗涤沉淀(10ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得C-K106mg。
实施例2
5mg二醇型人参皂甙,2.5mg蜗牛酶溶于3.2ml pH不同的磷酸-柠檬酸缓冲液(离子强度为0.01,含10%的乙醇)中,于40℃水浴中水解1天;反应液经离心收集沉淀;用水反复洗涤沉淀(1ml×3),洗液与母液合并,浓缩至3.2ml供再次使用;用乙醇反复洗涤沉淀(1ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得C-K产量见图1。
实施例3
二醇型人参皂甙与蜗牛酶按不同比例溶于3.2ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5,离子强度为0.01,含10%的乙醇)中,于40℃水浴中水解1天;反应液经离心收集沉淀;用水反复洗涤沉淀(1ml×3),洗液与母液合并,浓缩至3.2ml供再次使用;用乙醇反复洗涤沉淀(1ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得C-K产量见图2。
实施例4
3mg二醇型人参皂甙,0.5mg蜗牛酶溶于3.2ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5,离子强度为0.01,含10%的乙醇)中,于不同温度的水浴中水解1天;反应液经离心收集沉淀;用水反复洗涤沉淀(1ml×3),洗液与母液合并,浓缩至3.2ml供再次使用;用乙醇反复洗涤沉淀(1ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得C-K产量见图3。
实施例5
3mg二醇型人参皂甙,0.5mg蜗牛酶溶于3.2ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5,含10%的乙醇)中,离子强度变化,于40℃水浴中水解1天;反应液经离心收集沉淀;用水反复洗涤沉淀(1ml×3),洗液与母液合并,浓缩至3.2ml供再次使用;用乙醇反复洗涤沉淀(1ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得C-K产量见图4。
实施例6
3mg二醇型人参皂甙,0.5mg蜗牛酶溶于3.2ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5,离子强度为0.01,含10%的乙醇)中,于40℃水浴中水解;反应液经离心收集沉淀;用水反复洗涤沉淀(1ml×3),洗液与母液合并,浓缩至3.2ml供再次使用;用乙醇反复洗涤沉淀(1ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得C-K,产量与水解时间的关系见图5。
实施例7
3mg二醇型人参皂甙,0.5mg蜗牛酶溶于3.2ml pH4.5离子强度为0.01含10%的乙醇的不同缓冲液中,于40℃水浴中水解8小时;反应液经离心收集沉淀;用水反复洗涤沉淀(1ml×3),洗液与母液合并,浓缩至3.2ml供再次使用;用乙醇反复洗涤沉淀(1ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得C-K产量见图6。其中1为甘氨酸-HCl,2为邻苯二甲酸氢钾-HCl,3为Na2HPO4-柠檬酸,4为柠檬酸-柠檬酸钠,5为醋酸-醋酸钠。
机译: 4-氨基-4,6-二脱氧-α-d-吡喃葡萄糖基-(1-4)-α-d-吡喃葡萄糖基-(1-4)-d-吡喃葡萄糖的N-取代衍生物和4-氨基-4,6 -二甲氧基-α-d-吡喃葡萄糖基-(1-4)-α-d-吡喃葡萄糖基-(1-4)-β-d-吡喃葡萄糖苷及其制备方法
机译: 用三七叶和茎制备20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇(人参皂苷M1)的方法
机译: 用三七叶和茎制备20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇(人参皂苷M1)的方法