公开/公告号CN1408026A
专利类型发明专利
公开/公告日2003-04-02
原文格式PDF
申请/专利权人 拜奥默里克斯股份有限公司;
申请/专利号CN00816733.8
发明设计人 M·戴斯芒思奥克斯;D·蒙盖特;
申请日2000-12-06
分类号C12Q1/04;C12Q1/37;C07C237/20;
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人李华英
地址 法国玛西-勒托勒
入库时间 2023-12-17 14:44:30
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2006-07-05
授权
授权
2003-06-11
实质审查的生效
实质审查的生效
2003-04-02
公开
公开
本发明涉及一种可用于检测β-丙氨酸氨肽酶活性的试验的底物，本发明还涉及含有至少一种该底物的制剂，以及检测菌种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的方法。
多年以来，人们使用特异性的底物以确定微生物特征性的酶活性的存在与否。通过选择特异性的底物，在反应是否发生的基础之上，有可能明确微生物属的特性，或区分某一属中的不同菌株和/或菌种。
合成的酶底物由两个不同部分组成：第一部分是对所测试的酶活性特异性的，下文中称之为靶部分；第二部分作为一个标记，下文中称之为标记部分。
这些特异性的底物可以是荧光的或产色的。实际上，当第二部分即标记部分不再与第一部分即靶部分相联时，它或它与一或多种其他化合物反应的产物会产生荧光或显色(参见以申请人名义提出的专利申请PCT/FR99/00781)。
现有技术未提供任何简单试验来表征菌种铜绿假单胞菌，尽管由于其致病性强，频繁发生广泛扩散及其在许多医院感染中的作用，此菌种仍是最常研究的菌种之一。
根据本发明，提供了一系列基于β-丙氨酸的底物，它们均有助于可靠地检测铜绿假单胞菌。
本发明还涉及含有至少一种该底物的制剂，以及检测铜绿假单胞菌的方法。
当然，β-丙氨酸是一种特征已经非常明确的底物。因此，在Kasafirek，Evzen等标题为“由胰弹性蛋白酶裂解的氨基酸残基在产色底物中的作用”(Role of amino acid residues in chromogenic substratescleaved by pancreatic elastase)，发表在捷克化学通讯集(Collect.Czech.Chem.Commun.)(1987)，52(6)，1625-33的一篇论文中提及了产色底物，如β-丙氨酰对硝基苯胺(合成途径参见1631页)。
上述文献与本发明的区别，对我们而言是基本的区别，在于靶物本身，即我们感兴趣的是铜绿假单胞菌，而不是胰弹性蛋白酶。
在由J.B.Suszkiw，A.S.Brecher发表的一篇论文中，关于“脑氨酰基芳基酰胺酶。可溶性牛酶的进一步纯化以及关于底物特异性和可能的活性位点残基的研究”(Brain Aminoacyl Arylamidase.FurtherPurification of the Soluble Bovine Enzyme and Studies on SubstrateSpecificity and Possible Active-Site Residues)，发表在生物化学(Biochemistry)，vol.9，no.20(1970)，4008-4017页，提出了一种从牛脑组织中纯化可溶性芳基酰胺酶，β-丙氨酸β-萘胺的方法(合成途径参见4010页，第二段)。
在这篇文献中，其靶物也与我们现在提出的完全不同。
为达到此效应，本发明涉及一种由靶部分和标记部分组成的酶底物，水解该底物使标记部分和靶部分分开，所述靶部分对所测定的酶活性是特异性的，其特征在于该靶部分能受来源于至少一个铜绿假单胞菌的β-丙氨酸氨肽酶的作用起反应；而标记部分是显示水解反应是否发生的分子。
根据优选实施方案，靶部分由β-丙氨酸或其衍生物构成，而标记部分是荧光分子或产色分子。
再根据优选实施方案，底物具有下列结构式：
H2N-CH2-CH2-CO-NH-R，
其中，H2N-CH2-CH2-CO-是靶部分，而-NH-R是底物的产色或荧光标记部分。
再根据优选实施方案，标记部分包括下列化合物：
-β-萘胺，
-氨基甲基香豆素，如7-氨基-4-甲基-香豆素，
-氨基苯衍生物，如4-氨基-2，6-二氯苯酚，
-对硝基苯胺，或
-2-氨基-吲哚酚或3-氨基-吲哚酚。
本发明还涉及用于检测至少一个微生物菌株和/或菌种的制剂，其包括至少一种如上所述的底物，加上培养基。
根据修改，用于检测至少一个微生物菌株和/或菌种，或至少两个微生物菌株和/或菌种的制剂，其包含至少一种如上所述的底物，加上至少一种其他底物和培养基。
根据修改，所述培养基包含显色剂。
在这种情况下，培养基中的显色剂是：
-重氮盐，当释放的标记是β-萘胺，或
-3，5-二羟基-2-萘甲酸，当释放的标记部分是氨基苯衍生物。
优选该制剂为液体肉汤或半固体琼脂培养基的形式。
最后，本发明涉及检测菌种铜绿假单胞菌的方法，该方法包括：
-将至少一种能检测β-丙氨酸氨肽酶活性的底物与怀疑含有至少一个铜绿假单胞菌的样本接触，并
-观察颜色反应和/或荧光反应的出现。
根据修改，检测菌种铜绿假单胞菌的方法包括：
-将至少一种能检测β-丙氨酸氨肽酶活性的底物与怀疑含有至少一个铜绿假单胞菌的样本接触，
-将至少一种能检测除β-丙氨酸氨肽酶外某种酶活性的底物与怀疑含有至少一个除铜绿假单胞菌外的微生物的样本接触，这另外的酶活性可区分铜绿假单胞菌和这另外的微生物，并
-观察颜色反应和/或荧光反应的出现。
在上述两个实施例中，培养基均是半固体。
在这种情况下，将某些产物加入培养基，以抑制产生的颜色的扩散。
本发明涉及一个生物学参数的开发利用，其对菌种铜绿假单胞菌的大多数菌株是特异性的，称为β-丙氨酸氨肽酶活性。该活性仅在极少数量的其他菌种中发现。
本发明在于将适合的标记部分与对此酶特异性的靶部分，即β-丙氨酸结合在一起。显示此活性的适合的标记部分已经存在，但迄今未被用于铜绿假单胞菌的检测，因为先前从未描述过此菌种和此酶活性之间的联系。
因此，第一组底物由以萘胺为标记部分的分子组成。结构式之一——对应于底物β-丙氨酰-β-萘胺——是
其中R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8在各自位置代表原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH。β-萘胺能用于检测β-丙氨酸氨肽酶活性，如由Mr.Daniel Monget于1978年7月4日在Universite Claude Bernard-Lyon I工程学博士论文答辩(序号n°297)中所描述的。由于这种类型的分子是无色的，这一组底物的成员必须与某种显色剂，如重氮盐一起使用。
背景技术的第二组底物由标记部分基于氨基甲基香豆素的化合物组成，该标记部分从靶部分释放后，会产生荧光。这一组底物的通式可由下列β-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素的特定结构式推导出：
其中R9、R12、R13、R14和R15在各自位置代表原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH。这一类型的底物不宜在半固体培养基中使用，而更常用于液体肉汤中。
底物的第三组由β-丙氨酰-4-氨基-2，6-二氯苯酚组成，其中标记部分是2，6-二氯氨基苯酚，其具有下列结构式：
其中R16和R17在各自位置代表原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH。这一类型的化合物已经在由本申请人提出的专利申请WO-A-99/51767中涵盖，并需要干显色剂如3，5-二羟基-2-萘甲酸的存在。同一专利申请(WO-A-99/51767)还显示了有可能使用其他化合物，其中两个氯原子以及羟基基团在各自位置被原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH取代。
底物的第四组是基于β-丙氨酰对硝基苯胺及其衍生物，其中对硝基苯胺作为标记部分。这一类型底物的通式是：
其中R18、R19、R20和R21在各自位置代表原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH。该产物无须任何显色剂的存在。
在第五组底物中，2-氨基-吲哚或3-氨基-吲哚作为标记部分。这些底物拥有下列结构式：对于2-氨基-吲哚：
而对于3-氨基-吲哚：
这些底物都是产色的，而区别于产生荧光的第二组，并且都对应能用于鉴别铜绿假单胞菌β-丙氨酸氨肽酶活性的化合物。这一参数能用于清楚地将该病原体与其他临床上密切相关的革兰氏阴性杆菌菌种区别开来。1°)所用底物：
所用的酶底物具有下列结构式：
H2N-CH2-CH2-CO-NH-R，
其中H2N-CH2-CH2-COOH是β-丙氨酸，即底物的靶部分；而NH2-R是产色的，即所述底物的标记部分。
测试了四种底物，对应上面提到的前四组底物。它们是：
-β-丙氨酰-β-萘胺，Bachem company的市售产品编号K1035(Bubendorf，Switzerland)，
-β-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素，Bachem company的市售产品编号I1030(Bubendorf，Switzerland)，
-β-丙氨酰-4-氨基-2，6-二氯苯酚，其合成途径在下面给出，和
-β-丙氨酰对硝基苯胺，其合成途径在下面给出。
β-丙氨酰-4-氨基-2，6-二氯苯酚是从N-叔丁氧基羧基-β-丙氨酸(1.89g，10mmol)合成的。将N-叔丁氧基羧基-β-丙氨酸溶于无水四氢呋喃(HPLC级，30ml)中。将所得溶液在冰-盐浴中冷却至0℃，然后加入N-甲基吗啉(2.02g，20mmol)。在缓慢地加入氯甲酸异丁酯(2.74g，20mmol)之前将温度降至-10℃以下，在加入过程中，不让温度升至-8℃以上。然后向所得无水悬浮液中，加入4-氨基-2，6-二氯苯酚(1.78g，10mmol)溶于二甲基甲酰胺的冷溶液，并用N-甲基吗啉(4.08g，40mmol)处理，以释放游离碱。在上述加入操作之前将该溶液置于室温以下保存。所得反应混合物在冰-盐浴中搅拌1小时，然后在室温下再搅拌5小时。薄层层析显示几乎100％转化为酰胺。将悬浮液过滤以除去N-甲基吗啉盐酸盐，并加入四氢呋喃洗涤残余物。接下来，用旋转式蒸发器除去四氢呋喃和部分二甲基甲酰胺，将所得溶液倾入冰水中，并剧烈振荡。回收灰色的沉淀物，彻底洗净，在30-40℃下置于真空烘箱中干燥。从甲醇与少许加入的水中再结晶后，产量为1.72g小的白色结晶。该产物是N-a-t-BOC-β-丙氨酰-4-氨基-2，6-二氯苯酚，随后将其溶于最小可能体积的盐酸饱和的乙酸乙酯。置于约16℃2小时后，将该粘性溶液温和地倾入250ml无水乙醚中。4小时后，用真空过滤回收粉状固体，然后在乙醚中洗涤。最后将产物在真空干燥器中干燥，贮存在密闭容器中，避免吸潮。
β-丙氨酰对硝基苯胺按下列途径合成。将2.76克(g)，i.e.20毫摩尔(mmol)的4-硝基苯胺振动溶解于预先冷却至-12℃的40毫升(ml)干吡啶中。平行地将三氯化磷(1ml再度蒸馏了的)加入12ml吡啶(温度也在-12℃)中。然后将该两种溶液冷却至-16℃，边振动边将含三氯化磷的溶液加入含硝基苯胺的溶液。混合在-14℃和-16℃之间的温度下进行至少30分钟(min)，再在室温下重复同样的时间。接下来，在至少5分钟内将干苄氧基羰基-β-丙氨酸(20mmol，即4.46g)逐步加入所得溶液，充分搅拌。在30和40℃之间持续搅拌14小时(h)。随后将温度升至50℃，再继续搅拌8小时。稀释样本的薄层层析显示大部分起始物质已转化成β-氨酰基衍生物。在50℃用旋转式蒸发器除去吡啶，残余的粘性的油与碎冰和乙醇一起剧烈振荡。这样就产生一种黄色固体，其中部分沉积在容器壁上，其余的形成晶体物质。将固体回收、抽滤并用水洗涤。将产物风干，从热乙醇中再结晶。干产物重4.3g，用硅胶板(用乙酸乙酯-甲苯作为溶剂)进行薄层层析(TLC)显示产物是纯的。收率为62.7％。然后去除存在于苄氧基羰基-β-丙氨酰对硝基苯胺中的由苄氧基羰基构成的保护。为此，在搅拌下将2.15g该物质溶于最小可能体积的热冰醋酸。当混合物冷却至25℃以后，在搅拌下加入等体积的30％氢溴酸的冰醋酸溶液。1小时30分钟后，将所得粘性溶液缓缓倾入400ml无水乙醚，并剧烈充分搅拌。过滤所得的白色悬浮液，用数等分的无水醚洗涤残余物，然后置于真空干燥器内过夜干燥。产量为1.50g溴盐形式的β-丙氨酰对硝基苯胺。2°)用不同的酶底物检测β-丙氨酸氨肽酶的酶活性
A-测试β-丙氨酰-β-萘胺及其靶部分的选择性：
在β-丙氨酰-β-萘胺的存在下，用来自bioMérieux(La Balme，France)的APIZYM-型的试条测试一些菌种(总计每种5株，除非另外指定)。用悬于磷酸缓冲液(0.01M，pH7.5)中的密度为4 McFarland单位(McF)的细菌悬液进行试验。关于McFarland标度，它是测量细菌密度的单位，4 McF相当于每毫升12.108个细菌。对每一株测试菌株，向试条上的每一孔加入80微升相应悬液。将试条在37℃温育4小时。加入一滴获自bioMérieux的ZYMB(坚牢蓝BB，一种重氮盐)(产品编号70480)，以检测β-丙氨酸氨肽酶的存在。如果反应是阳性的，溶液变成橙色。测试结果如下。下列菌种都呈阴性结果，即在下列菌种中未检测到β-丙氨酸氨肽酶活性：
-大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，
-志贺氏属(Shigella spp.)(4株)，
-索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)，
-迟钝爱德华氏菌(Edwarsiella tarda)(2株)，
-猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)，
-伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)，
-沙门氏菌属(Salmonella spp.)，
-甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)，
-鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum)(3株)，
-猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella arizonae)，
-弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，
-差异柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus)，
-肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniae，spp.pneumoniae)，
-肺炎克雷伯氏菌产酸亚种(Klebsiella pneumoniae，spp.oxytoca)，
-肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiella ozaenae)，
-肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚种(Klebsiella rhinoscleromatis)(3株)，
-蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)，
-产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，
-阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，
-阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，
-日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)，
-粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，
-气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)，
-居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)，
-普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)，
-普通变形菌(Proteus vulgaris)，
-奇异变形菌(Proteus mirabilis)，
-摩氏变形菌(Proteus morganii)，
-雷氏普罗威登斯菌(Proteus rettgeri)，
-产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)，
-斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)，
-小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，
-假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)，
-恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，
-食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)，
-睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，
-产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，
-施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，
-腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)，
-嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，
-缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)，
-泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)，
-皮氏拉斯通氏菌(Ralstonia picketti)，
-浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)，
-栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)，
-少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)，
-多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)，
-粪产碱菌(Alcaligenes faecalis/odorans)，
-木糖氧化产碱菌反硝化亚种(Achromobacter xylosoxidans spp.denitrificans)，
-木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种(Achromobacter xylosoxidans spp.xylosoxidans)，
-支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，
-解脲寡源杆菌(Oligella ureolytica)(2株)，
-CDC IV C2，
-嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，
-类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)，
-解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)，
-副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(4株)，
-脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)，
-短隐杆菌(Empedobacter brevis)(3株)，
-大比目鱼金黄杆菌(Chryseobacterium balustinum)(1株)，
-产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium indologenes)，
-有毒威克斯氏菌(Weeksella virosa)(4株)，
-类香味菌属(Myroides spp.)，
-鸡巴斯德氏菌(Pasteurella gallinarum)(1株)，
-多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，
-侵肺巴斯德氏菌(Pasteurella pneumotropica)(4株)，
-脲放线杆菌(Actinobacillus ureae)(1株)，
-溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)，
-产气巴斯德氏菌(Pasteurella aerogenes)，
-巴斯德菌属某些种(proches de Pasteurella)(4株)，
-苯丙酮酸嗜冷杆菌(Psychrobacter phenylpyruvicus)(4株)，
-Moraxella paraphenylpyruvica(3株)，
-腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata)(4株)，
-腔隙莫拉氏菌液化亚种(Moraxella lac.sp.liquefaciens)(7株)，
-不液化莫拉氏菌(Moraxella non liquefaciens)(13株)，
-牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)(4株)，
-奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)(18株)，和
-放线杆菌属(Actinobacillus spp.)
与此相比，下列菌种都呈阳性结果，即在下列菌种中检出β-丙氨酸氨肽酶活性：
-液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，
-铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，
-荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，
-洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，
-门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)，和
-人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)。
CDC是疾病控制中心(Center for Disease Control)的首字母缩略词。CDC分类涉及未指定种名的细菌群。
因此，底物β-丙氨酰-β-萘胺，尤其是其靶部分β-丙氨酸，具有高度选择性，在测试的79个菌种中仅发现6个菌种(即仅7.1％)具有β-丙氨酸氨肽酶活性。
在半固体培养基上，由于其菌落呈绿色(由于产生绿脓菌荧光素)，很容易将铜绿假单胞菌与其他5个呈阳性结果的菌种区别开来。
B-测试底物β-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素，并评价其检测铜绿假单胞菌菌株的有效性：
按下列方法测试底物β-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素。用下列bioMérieux(法国)的培养基分离菌株：
-哥伦比亚羊血培养基(Columbia Sheep’s Blood)，
-胰胨豆胨加羊血培养基(Trypticase Soy with Sheep’s Blood)，和
-麦康凯培养基(MacConkey)(用于分离肠杆菌)。
用Vitek 2卡(注册商标，bioMérieux，Saint Louis，Missouri，美国)对密度调节至0.375和0.750McF之间的细菌悬液进行试验。
下面的表1显示了在对上一部分涉及的部分菌种，以及其他一些菌种(如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi))进行测试时底物的有效性。
可用一些简单的试验，如精氨酸水解试验或乙酰胺试验区别铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)。
因此，底物β-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素在检测下列菌种时特别有效；
-人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)，阳性结果的百分比为100％，
-铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，阳性结果的百分比为97.8％，
和
-门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)，阳性结果的百分比为100％。
对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的有效性特别受人关注，因为总共测试了137株。有3株呈阴性结果或临界结果的原因是种内的生物变异。
发现其他菌种的部分菌株能水解β-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素，即：
-皮氏拉斯通氏菌(Ralstonia pickettii)，阳性结果的百分比为20％，和
-紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)，阳性结果的百分比为10％。
C-测试底物β-丙氨酰-4-氨基-2，6-二氯苯酚，并评价其检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株的有效性：
在哥伦比亚羊血(Columbia Sheep’s Blood)琼脂培养基上分离出菌落后，用Vitek2卡(注册商标，bioMérieux，Saint Louis，Missouri，美国)在含有底物β-丙氨酰-4-氨基-2，6-二氯苯酚以及3，5-二羟基-2-萘甲酸和蛋白胨，缓冲至pH8.5的肉汤中测试菌株。所用细菌悬液的密度为0.5McF，悬于生理盐水中(4.5g NaCl/升)。温育22到24小时后，肉眼判读结果。这些试验的结果如下面表2所示：
用此底物，β-丙氨酰-4-氨基-2，6-二氯苯酚，对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、液化沙雷氏菌(Serratla Hquefaclens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的结果仍是显著的，而对门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)和人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)也还可以。因此将此底物与另一个可能把铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)与其他呈阳性反应的微生物区分开的底物(见第三段)相结合会有帮助。很难解释在荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)中观察到的模式，可能是由于方法学的问题或此种内的遗传变异性。
此外，应注意到，聚乙烯丙酮酸(PVP)的存在会加深阳性反应的颜色。
D-测试底物β-丙氨酰对硝基苯胺：
使用与前C段中描述的基本相同的方法，只是在19小时后肉眼判读结果。所用底物是β-丙氨酰对硝基苯胺。结果总结于下面的表3。
这些结果显示得非常清楚，能容易地将铜绿假单胞菌与其他不具有β-丙氨酸氨肽酶活性的菌种区分开。
所以，设计带有由β-丙氨酸构成的靶部分的底物以检测β-丙氨酸氨肽酶活性，对于检测铜绿假单胞菌是很理想的，此底物还能检出少数其他菌种(液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质假单胞菌(Pseudomonas marcescens)、门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)和人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi))，它们在测试样本中远不如铜绿假单胞菌常见。因此，检出此酶活性最常与所测试的生物物质中存在铜绿假单胞菌有关。然而也有可能——如下一段中将要描述的——将铜绿假单胞菌与这些具有β-丙氨酸氨肽酶活性的其他任何菌种区分开来。3°)同时使用两种酶底物测定两种不同的酶活性，其中之一是β-丙氨酸氨肽酶活性：
使用两种底物测定两种不同的酶活性特别有用。例如，这两种不同的活性可以是β-葡糖苷酶和β-丙氨酸氨肽酶的活性。
如第二章中的实施例A所述，两个不同的菌种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)均表达β-丙氨酸氨肽酶活性。但是可以通过测定β-葡糖苷酶活性来区分这两个菌种，其仅在门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)中表达。这一活性，例如，可用底物6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷测定，该底物可从Biosynth(Staad，Switzerland)获得。
可在半固体培养基上区分这两个菌种，如下所述：
在胰胨豆胨琼脂中添加下列成分：
-200mg 6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷，
-50mg β-丙氨酰-N，N’-二甲基-对苯二胺，和
-15mg 3，5-二羟基-2-萘甲酸。
将培养基倾出，并如下接种：
-10个平皿接种对应5株铜绿假单胞菌和5株门多萨假单胞菌的纯培养物，
-2个平皿接种两个菌株的混合物，一个是铜绿假单胞菌，另一个是门多萨假单胞菌。
将培养皿置于35-37℃温育。温育18-24小时后，记录菌落的颜色。带有蓝晕的蓝色菌落对应铜绿假单胞菌，它只表达丙氨酸氨肽酶活性；带有蓝晕的紫色菌落对应门多萨假单胞菌，它同时表达β-丙氨酸氨肽酶和β-葡糖苷酶活性。
因此，即使在同一标本中混合在一起，也能在同一半固体培养基上容易地区分这两个不同的菌种。这个例子说明可以在同一反应培养基中将对不同酶活性特异性的不同底物混合在一起，包括根据本发明的这一种，以鉴定铜绿假单胞菌。
机译： 酶底物，允许检测至少一种菌株和/或一种微生物的组合物以及用于检测细菌种的铜绿假单胞菌的方法
机译： 用于检测铜绿假单胞菌的新型酶促底物，包含其的组合物和用于检测所述种的方法
机译： 用于检测铜绿假单胞菌的新型酶促底物，包含其的组合物和用于检测所述种的方法
