应用昆虫激素提高昆虫杆状病毒系统外源基因的表达量

摘要

本发明提供一种利用昆虫激素提高昆虫/杆状病毒表达系统外源基因表达效率的方法，包括应用昆虫蜕皮激素(MH)、昆虫保幼激素(JH)及蜕皮激素MH和保幼激素JH的联合使用以提高外源基因和多角体蛋白基因在昆虫/杆状病毒表达系统中的表达效率、以及利用上述激素提高昆虫杆状病毒在昆虫细胞中的复制效率。通过这种方法可以大大提高外源基因和多角体蛋白基因在昆虫/杆状病毒表达系统中的表达效率，增加外源蛋白和多角体病毒粒子产量，节约利用该系统生产各种外源蛋白和母种病毒的生产成本。

说明书

一、技术领域

本发明涉及生物技术基因工程领域，具体涉及应用昆虫激素提高昆虫杆状病毒系统外源基因的表达量。

二、背景技术

目前应用的昆虫杆状病毒表达系统主要有二个，一个为以苜蓿尺蠖夜蛾核型多角体病毒(Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus，AcMNPV)为载体，以秋粘虫(Spodoptera frugiperda，Sf)细胞，菜青虫(Trichopiusta ni，Ai-5)细胞或昆虫为宿主；另一为以家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus，BmNPV)为载体，以家蚕细胞或家蚕虫体及蛹体为表达宿主。两个表达系统都以各自病毒载体的多角体蛋白基因或P10基因或极早期基因IE-1等强启动子为外源基因表达的调控元件，通过将外源目的基因置于强启动子控制之下的重组病毒感染宿主细胞，由重组杆状病毒在宿主和细胞体内进行大量复制，在病毒感染宿主的晚期，外源基因的转录产物大量积累，在较短时间内得到高效表达。且家蚕表达系统是最为安全的I级(农基安审字2000B-03-007)。

杆状病毒基因组的大小在90-230kb左右，其中目前经鉴定已知功能的基因有80多个。杆状病毒科的大多数核型多角体病毒基因组中含有蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因(egt)。在AcMNPV和BmNPV中egt基因编码的EGT酶分子量为60ku，各有506个氨基酸残基组成，两者之间的同源性在95％左右。它能催化昆虫体内尿苷二磷酸葡萄糖与蜕皮甾体化合物之间的糖基转移反应，以蜕皮激素与UDP-葡萄糖为底物，则转移反应的产物为蜕皮激素22-O-β-D-吡喃葡糖苷(O`Reilly et a1.Biotechnology，9：1086-1089，1991)，同时还发现AcMNPV编码的EGT酶不能以22位碳原子上缺少羟基的蜕皮甾体化合物作为底物。

昆虫蜕皮激素和保幼激素是控制虫体发育和变态的主要决定因子，同时亦是触发一系列(set)基因转录翻译调控过程开关的触发器(trigger)。施用蜕皮激素、保幼激素、或蜕皮激素和保幼激素联用亦能增加丝蛋白的合成。向杆状病毒感染的宿主施用昆虫激素，有可能恢复宿主的正常生理平衡和提高蛋白质合成体系的效率，但国内外至今没有具体向受杆状病毒感染的宿主施用昆虫激素的方法。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种应用昆虫激素提高杆状病毒表达系统外源基因表达量的方法，以生产各种基因工程产品应用于农业、医药、卫生、食品、环境、酶制剂工业等领域。

本发明的目的是这样实现的：

将昆虫蜕皮激素(MH)、昆虫保幼激素(JH)及蜕皮激素(MH)和保幼激素(JH)联合使用以提高外源基因和多角体蛋白基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达效率。

所述的杆状病毒是：BmNPV，AcMNPV，ApNPV，BsSNPV，CfMNPV，EoSNPV，HaNPV，HzNPV，LdMNPV，MbMNPV，OpMNPV，SIMNPV，SeMNPV，和TnNPV。

所述的昆虫宿主是：家蚕(Bombyx mori)，野蚕(Bombyx mandarina)，蓖麻蚕(Philosomia cynthia ricini)，樟蚕(Dictyoploca japonica)，樗蚕(Philosamia cynthiapernyi)，柞蚕(Antheraea pernyi)，日本天蚕(Antheraea yamamai)，野天蚕(Antheraeapolyphymus)，苜蓿尺蠖(Autographa californica)，茶尺蠖(Ectropis obliqua)，甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)，斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)，秋粘虫(Spodoptera frugiperda)，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)，行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)，棉铃虫(Heliothisarmigera)，美国棉铃虫(Heliothis zea)，烟青虫(Heliothis assulfa)，烟草夜蛾(Heliothisvirescens)，东方粘虫(Pseudaletia separata)，和舞毒蛾(Lymantria dispar)。

所述的昆虫是家蚕，所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒。

所述的昆虫蜕皮激素是：α-蜕皮素，β-蜕皮素和20，26-二羟基蜕皮酮，植源性的蜕皮甾类化合物，合成蜕皮甾类化合物。所述的昆虫保幼激素是：类萜化合物JH-0(C19保幼激素)，JH-I(C18保幼激素)，JH-II(C17保幼激素)；JH-III(C16保幼激素)及其衍生物738，ZR515，ZR512，ZR619，ZR777。

所述的昆虫激素使用方法是穿刺注射、口食及体表喷洒使用。

所述的昆虫激素使用时间是在家蚕幼虫的五龄期和蛹期。

所述的昆虫蜕皮激素MH使用于家蚕幼虫的用量范围为1～8μg/每头蚕；使用于家蚕蛹的用量范围为1～6μg/每粒蛹；所述的昆虫保幼激素JH使用于家蚕幼虫的浓度范围为25～150ppm体喷；所述的昆虫蜕皮激素MH和保幼激素JH联合使用的用量范围为1～8μg MH/每头和25～150ppm JH体喷。

所述的昆虫蜕皮激素MH使用于家蚕幼虫的最优用量为4μg/每头蚕；使用于家蚕蛹的最优用量为2μg/每粒蛹；所述的昆虫保幼激素JH使用于家蚕幼虫最优浓度为100ppm；所述的昆虫蜕皮激素MH和保幼激素JH联合使用的，最优用量为4μg MH/每头及100ppm的JH体喷。

所述的昆虫蜕皮激素MH使用于家蚕细胞，其添加于细胞培养基中的浓度范围为1～5μg/ml培养基。

本发明的范围并不局限于优化范围，从机理上看可涵盖其它的杆状病毒表达系统和昆虫激素及其衍生物。

本发明通过以下附图和实施作进一步阐述，但并不限制本发明范围。

四、附图说明：图1，部分甾类化合物结构示意图图2，部分保幼激素及其衍生物的结构示意图图3，MH对植酸酶基因表达及病蚕体重的影响图4，不同昆虫激素的施用方法对植酸酶基因表达的影响图5，不同MH用量对家蚕植酸酶基因表达的影响图6，不同MH用量对蚕蛹植酸酶基因表达的影响图7，MH处理后植酸酶基因在蚕体中的表达时相图8，病毒感染后24h后MH处理的病蚕死亡率时相曲线图9，MH处理后感染Wt BmNPV家蚕的多角体数及病蚕体重的时相曲线图10，MH处理对Wt BmNPV在培养的BmN细胞中增殖的影响图11，不同浓度JH处理对植酸酶基因在家蚕中表达及病蚕体重的影响图12，经JH处理后感染Bm-phy的家蚕体重变化时相图13，JH处理下植酸酶基因在家蚕中的表达时相图14，JH处理后Wt BmNPV多角体基因在家蚕中的表达时相图15，JH处理对感染Wt BmNPV家蚕死亡率的影响图16，MH和JH联合处理下植酸酶基因在家蚕中的表达时相图17，MH和JH联合处理对感染Bm-phy家蚕体重的影响图18，MH和JH联合处理下多角体蛋白基因在家蚕中的表达时相图19，MH和JH联合处理对感染Wt BmNPV家蚕体重的影响

五、实施方式实验材料：

1.病毒毒株：携带酸性植酸酶基因的大肠杆菌载体pyy-cl(中国专利，公开号：CN1184156A)由中国农业科学院饲料研究所保存；携带酸性植酸酶基因的重组家蚕核型多角体rBmNPV(phyA2，简码为Bm-phy，中国专利申请号：99103564.X)和实验室家蚕品种JYI及egt基因缺失的家蚕核型多角体病毒Degt(季平等，2000年，病毒学报16(1)：54-59)由中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点开放实验室保存；家蚕细胞株BmN和野生型多角体镇江株(BmNPV-ZJ8)由中国科学院上海生物化学研究所动物病毒实验室提供。

2.家蚕细胞BmN的日常培养按Summers，M.D.等编的《A Manual of Methods forBaculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures》(Texas Agricultural ExperimentStation Bulletin，No.1555，1987)手册进行。

家蚕的饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。

3.细胞培养所用培养基TC-100和胎牛血清(FBS)购自Gibco-BRL公司，其他无机盐等试剂均购自Sigma公司。家蚕BmN细胞所用培养基为含10％胎牛血清的TC-100培养基。

4.昆虫蜕皮激素(Molting hormone，MH，Ecdysone)20-β-羟基蜕皮酮由中国农业科学院蚕业研究所研制；昆虫保幼激素(Juvenile hormone，JH)Z-512由山东农业大学蚕学系崔为正教授合成并提供(崔为正等，蚕业科学22(2)：125-127，1996)。实施例一、施用蜕皮激素对家蚕植酸酶基因表达量病蚕体重的影响

JY品种按常规方法饲育至五龄起蚕，饷食后48h选择平均体重相同的15头家蚕为一组，每头蚕接种1.0×10⁵pfu Bm-phy(5μl接种液含2.0×10⁷pfu/ml的Bm-phy和0.8mg MH/ml)，共12组。待感染Bm-phy的家蚕大部分发病至频死状态时，收集血样保存于-20℃待测定植酸酶活力。通过将MH混于病毒液中一起注射的方法处理家蚕后，平均每头蚕单位体积血淋巴的植酸酶活力比对照高59.80％，体重比对照增重5.2％，经显著性分析，两者的差异达极显(图3)，说明施用4μg的MH后，可显著增加单位体积的表达量，同时增加每头蚕的体重，两者的增加效果相乘，计每头蚕增加表达量为68％左右。实施例二、不同蜕皮激素的使用方法和不同家蚕品种对家蚕植酸酶基因表达量的影响

以高表达品种A1，A15，A16，S16，S17和JY1为实验材料(Zhang，Zhifang et al.，Symposium of the 10^th Gene，Gene families，lszoyme.1999，Beijing)，选择每个品种中体重相近的蚕作实验材料。注射MH的方法为：在含1.0×10⁵pfu的Bm-phy稀释液中加入4μg/头的MH，将此混合液一同注射入蚕体。添食MH的方法为：感染1.0×10⁵Bm-phy后24h，平均每头蚕添食约4μg的MH，即待喷施90ppm MH的桑叶基本食尽后，喂新鲜桑叶。以后按五龄蚕的饲养规程进行。

通过每头蚕添食4μg MH后单位血淋巴体积的植酸酶活力(7个品种平均值)比对照显著高20％，每头蚕体重增加4.7％；而注射MH的单位血淋巴体积的植酸酶活力均比对照显著高34.7％，每头蚕体重比对照增加7.7％(图4)，以上结果说明，用注射MH的方法，无论在单位体积植酸酶表达量的增加还是在病蚕体重的增加方面均优于MH的添食法，同时用注射法比添食MH还少一道工序。说明MH的使用方法以与重组病毒混合后一同注射为好。实施例三、不同MH用量对家蚕植酸酶基因表达量的影响

以JY1品种为材料，正常饲养5龄第二天，注射1.0×10⁵pfu的Bm-phy重组病毒，并在Bm-phy中分别加入2μg、4μg、6μg/头的MH。以3×15头平均体重相近的蚕作为一组实验材料，实验重复三次。收取血样保存于-20℃，并测定植酸酶活力。结果如下：每头蚕分别注射2μg、4μg、6μg MH的单位体积植酸酶的活力均显著高于对照。其中以注射4μg MH的效果最好，单位体积血淋巴植酸酶活力比对照增加52.2％；每头蚕注射6μg MH的效果次之，比对照增加46.7％；而每头注射2μg MH的效果较差，只比对照增加36.6％。注射不同量MH(2μg，4μg，6μg)的病蚕体重分别比对照增加4.71％、3.50％、和1.74％(图5)。从上述结果分析，以每头蚕注射4μg MH的效果为最佳。实施例四、不同MH使用时间对家蚕植酸酶基因表达量及病蚕体重的影响

五龄后第二天的健康蚕儿(JY1品种)，点数平均体重相近的3×15头为一组，每头注射1.0×10⁵pfu的Bm-phy，MH的用量为每头4μg。实验设MH与病毒同时注射为0小时，病毒感染后24小时注射MH为24小时处理组，以后依次为48小时处理组、72小时处理组、96小时处理组和不注射MH的对照组，实验重复三次。至病蚕大部分发病至濒死时取血样，保存于-20℃，测定植酸酶活力。从表一的试验结果可知，MH的使用时间无论从植酸酶的表达效率还是病蚕体重来说均以在重组病毒感染的同时使用MH为好，两者分别比对照增加57％和3.66％，同时亦减少了处理时的用工量。

    表一，不同MH的使用时间对植酸酶表达量的影响(4μg MH/头)

     使用时间    植酸酶增加指数(％)    病蚕体重增加指数(％)

对照             100                   100

0小时            157.0                 103.66

24小时           154.6                 100.78

72小时           149.2                 99.2

96小时           127.5                 97.1实施例五、不同MH的用量对蚕蛹植酸酶基因表达量的影响

以JY1品种为实验材料，按常规饲养方法饲养至上簇，选取健康的蚕蛹100粒为一组，分别在1×10⁵pfu的Bm-phy病毒稀释液中加入2μg、4μg、6μg的MH，不加MH的为对照处理。在病毒感染后60h，每隔12h取样并保存于-20℃，直至病毒感染至蛹死亡为止，测定血淋巴中植酸酶活力，其结果如图6所示：每粒蛹注射2μg MH的蚕蛹单位体积血淋巴中的植酸酶活力在感染后108h时比对照高50.2％，每粒蛹注射4μg MH的酶活力比对照高33.3％，每粒蛹注射6μg MH的比对照高31.0％，说明每头蛹的MH在2μg用量时其植酸酶活力增加效果为最佳。不同MH的用量对蚕蛹植酸酶基因在蛹体中的表达时相曲线如图6所示。实施例六、MH处理后植酸酶基因在蚕体中的表达时相

以JY1品种为实验材料，按常规饲育方法饲养至5龄起蚕第二天，选取健康及平均体重相近的蚕儿100头为一组，注射4μg MH+1.0×10⁵pfu的Bm-phy病毒(MH处理组)，在病毒感染后按60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h的时相取血样和称取病蚕体重并测定酶活力，重复三次。实验结果如图7所示，从图7可知，使用MH后提高了蚕体中的外源植酸酶基因的翻译和表达效率及延长了有效的表达时间。在病毒感染后132h时，其植酸酶活力和病蚕体重分别增加35.1％和6.7％。实施例七、不同MH使用时间对感染重组植酸酶病毒的家蚕半数致死时间的影响

JY1品种的五龄起蚕后二天的健康蚕儿，点数100头为一组，每头注射1.0×10⁵pfu的Bm-phy，MH的用量为每头4μg。实验设MH与病毒同时注射的为0小时，病毒感染后24小时注射MH的为24小时处理组，以后依次为48小时处理组、72小时处理组、96小时处理组及不注射MH的为对照组，至感染后112h病蚕开始死亡时，每隔4小时调查一次死亡率，并计算LT₅₀，实验结果如表二所示，在病毒感染后不同的时间施用MH均能有效地推迟发病死亡时间，不同程度地延长了LT₅₀时间，其中以病毒感染后24h施用MH的效果最佳，LT₅₀延长了8h以上。

  表二，MH使用时间对感染重组植酸酶病毒家蚕的LT₅₀影响

MH施用时间    CK        0h       24h      48h      72h      96h

LT₅₀(h)      115.59    120.4    124.5    119.0    115.6    118.36

MH处理和不经MH处理的感染重组植酸酶后的发病死亡率的时相曲线的比较如图8所示，从于病毒感染后24h施用MH的时相曲线看，4μg MH处理后延缓了病蚕的死亡时间，延长了外源基因在蚕体内的有效表达时间。实施例八、MH处理后野生型家蚕核型多角体病毒感染家蚕后对多角体基因表达量及发病进程的影响

JY1品种的五龄起蚕后二天的健康蚕儿，点数100头为一组，每头注射1.0×10⁵pfu的野生型镇江株核型多角体病毒BmNPVZJ-8株，MH处理为：将MH混和于BmNPVZJ-8的稀释液中(4μg MH+1.0×10⁵pfu/头)一起注射，MH不处理的为对照。病毒感染后60小时开始取血样，以后每隔12或6小时分别取样一次，并计测病蚕体重，样品经超声波破碎细胞后，用血球计数板计数每毫升中的多角体数，直至蚕儿基本死亡为止。

MH处理后，每毫升血淋巴的多角体数在96h时比对照增加39.0％，而病蚕体重比对照增加2％，说明MH处理后，亦能有效地增加单位体积血淋巴中的多角体数目，促进了多角体基因的表达。有关MH处理后与对照的蚕体血淋巴中多角体数目及病蚕体重变化的时相曲线如图9所示。

同样处理的另一批蚕儿，调查MH处理和不处理之间LT₅₀的变化情况，其结果如表三所示。

          表三，MH处理对感染wt BmNPVZJ-8的家蚕LT₅₀的影响

    处理感染后72h病死    亡率(％)感染后84h病死    亡率(％)感染后90h病死    亡率(％)    LT₅₀    CK MH(4μg)    6    2    44.09    35.5    86.6    65.0    85.67    89.90

从上述结果进一步说明MH处理后，有效地增加了蛋白质的表达量和延长了蛋白质有效表达时相。实施例九、经MH处理BmNPV感染的家蚕细胞促进了病毒的复制

尽管在同一实验的相同饲育条件下，MH可以极显著提高病毒基因在家蚕幼虫和蛹体血淋巴中的表达量，但是在不同实验之间，由于受家蚕饲育的营养条件和环境条件的影响，MH对植酸酶基因和多角体蛋白基因表达量提高效果的变动范围较大(30％-60％)。由以上实验结果，能够促进重组病毒植酸酶基因和野生型病毒多角体蛋白基因在多细胞的家蚕幼虫和蛹体血淋巴中的表达量，在单一的家蚕培养细胞中MH也应具有相似的促进效果。为进一步证明MH在蚕体和蛹体中实验结论的可靠性，研究了用MH处理对野生型家蚕核型多角体病毒在培养的BmN细胞中增殖的影响，其结果如图10所示。

在15cm²的细胞培养瓶中，接种适宜密度的BmN细胞，待细胞贴壁后，移去培养基，加入1ml含适量病毒粒子的无血清培养基(MOI＝0.1)，27℃下培养1h，然后移去细胞上层感染液，1ml无血清培养基洗一次，再加入含有3μg/ml MH的正常培养基，27℃下培养3天，收集100μl上清，用终点稀释法测其TCID₅₀。从感染的时相曲线可见：从病毒感染后24h开始，MH处理组与CK之间TCID₅₀开始出现差异，在病毒感染后60-72h，二者的差异最大，该时期MH处理的TCID₅₀是对照处理的3倍左右。实施例十、MH处理后对前胸腺发育的影响

JY1品种按正常饲育至5龄起蚕，设6种处理，其中不作任何处理的对照(CK)、只注射4μg MH的CK-MH、注射1.0×10⁵pfu野生型病毒BmNPV-ZJ8的wt、同时注射4μgMH和1.0×10⁵pfu野生型病毒BmNPV-ZJ8的wt-MH、注射1.0×10⁵pfu将egt基因去除的Degt病毒的DEGT、及同时注射4μg的MH和1.0×10⁵pfu的Degt病毒的处理DEGT-MH。平均孕育温度为24℃，至病毒感染后108h时，按照森精的《家蚕新生物实验》(三省堂，1970)中方法解剖前胸腺。用测微尺统一测量前胸腺后枝的最细部，每种处理至少解剖6个完整的前胸腺。其结果如表四所示。

实验结果表明，健康蚕经MH处理后，由于体内的MH滴度较高，负反馈延缓了自身前胸腺的发育和激素分泌。而野生型BmNPV感染家蚕后，由于BmNPV基因组中的egt基因表达使体内的蜕皮激素失去生理功能，因而使蚕为了维持激素平衡，前胸腺一直处于分泌状态，促进了前胸腺的发育。用野生型BmNPV病毒感染家蚕同时使用MH后，外源的MH补偿了因egt基因表达而失活的MH，因此蚕体内的激素处于较为正常状态，前胸腺形态接近于正常。当蚕感染egt基因缺失的重组病毒DEGT时，由于没有egt基因对蚕体内激素平衡的干扰，所以其形态大致接近于正常。而当DEGT和MH共同作用时，体内过高的MH抑制了蚕体自身前胸腺的分泌功能，而使前胸腺变小。

       表四，MH处理对病毒感染家蚕前胸腺发育的影响

处理          解剖前胸腺数               前胸腺大小(μm)

CK                  6                        65

CK-MH               6                        36.7

Wt                  8                        98.8

Wt-MH               8                        58.8

DEGT                7                        55.7

DEGT-MH             7                        28.6

从上述前胸腺解剖实验证明，MH使用后可以补偿因病毒基因组中egt基因表达导致的MH失活所引起的正常激素平衡状态的破坏，且可通过egt基因失活而提高外源基因的表达量。实施例十一、JH处理对植酸酶基因在家蚕中表达量的影响

植酸酶基因在家蚕五龄幼虫血淋巴中的表达量高低由每头家蚕血淋巴含量和单位血淋巴中植酸酶活力的大小决定，血淋巴的含量一般占家蚕幼虫体重的25％左右。在家蚕五龄幼虫起蚕后48h注射重组杆状病毒，接种24h后体喷50ppm；100ppm；150ppm的保幼激素，调查病蚕体重，收集血样，测定植酸酶的活力。

使用不同浓度外源性昆虫激素JH后，经差异显著性检验，可以显著提高感染重组病毒的家蚕五龄幼虫体重，而且提高了植酸酶基因在家蚕幼虫血淋巴单位体积的表达量。图11以对照的体重和单位血淋巴中植酸酶活力为指数，比较了JH浓度对表达量的影响。在低浓度JH区，随着JH浓度的增加，病蚕体重和植酸酶的表达量均逐渐升高，当JH浓度为100ppm时，二者均达最大值，此后，随着JH浓度的增加，病蚕体重和表达量反而逐渐降低。方差分析和显著性测验结果表明，100ppm的JH处理无论病蚕体重，还是单位血淋巴体积的植酸酶表达量均显著高于对照，由图11可知：经100ppm的JH处理后，病蚕的体重增加了12.4％，每毫升血淋巴中植酸酶的活力单位增加了16.4％，由此可以推算出每条蚕的平均表达量比对照高出30.86％。实施例十二、不同发育阶段施用JH对植酸酶基因在家蚕中表达量及病蚕半致死时间的影响

从五龄起蚕后开始，每隔24h用100ppm的JH体喷饷食后48h感染重组杆状病毒的家蚕，对照区只注射病毒，不做JH处理，充分发病后调查病蚕体重，收集血样并测定植酸酶的活力，同时调查各JH处理时间对病蚕半致死时间的影响。

表五所示：0-72h施用JH，病蚕体重均显著高于对照；96h后施用，则与对照之间没有明显差异。其中，起蚕和起蚕后72h施用JH，病蚕体重较大，极显著高于对照。不同JH使用时间对重组杆状病毒外源植酸酶基因在五龄家蚕幼虫血淋巴中的表达量影响差异不显著，但均显著高于不使用JH的对照。

表五，JH不同使用时间对感染Bm-phy家蚕幼虫体重和表达量的影响

 施用JH时间    平均病蚕    增强倍数    植酸酶平均活    增强倍数

     (h)        体重(g)      (％)        力(U/ml)       (％)

     CK         3.85d        100        177.18a          100

     0          4.26a       110.65      235.18b         132.74

     24         4.06c       105.45      225.80b         127.44

     48         4.08bc      105.57      225.16b         127.08

     72         4.21ab      109.35      224.21b         126.54

     96         3.98cd      103.38      218.65b         123.41

     120        3.88d       100.78      207.21b         116.55

注：小写字母表示5％显著水平；大写字母表示1％显著水平；下同。

从重组病毒感染后96h开始，调查每种处理的病蚕死亡率。试验结果表明(表六)：JH的使用可明显延长病蚕的半致死时间，24h与72h使用JH可使病蚕发病时间较对照延长4h以上；其他时间使用JH均使发病时间延长2-3h左右。

     表六，JH使用时间对感染Bm-phy五龄家蚕幼虫半致死时间的影响

  施用JH时间(h)      不同JH使用时间病蚕死亡率(％)    LT₅₀    116h    120h    124h    0    24    48    72    96    120    CK    25.86    13.46    20.00    21.05    16.67    29.31    42.58    51.72    40.38    70.9    47.37    60.00    65.51    78.25    75.86    82.69    89.09    82.47    85.00    87.93    94    119.77    120.91    118.60    120.30    119.08    118.29    116.83

综合以上试验结果，JH的不同时间使用均可不同程度使病蚕体重增加和延长基因表达时间，与对照相比均可提高外源基因表达量，但相互之间差异不显著，综合以上试验结果认为在家蚕五龄幼虫起蚕或起蚕后72h使用外源性昆虫保幼激素对重组杆状病毒外源基因表达量提高的效果最佳，但从家蚕饲养要求考虑，认为以起蚕后72h施用为为好。实施例十三、JH处理下的植酸酶基因表达时相

在家蚕五龄幼虫起蚕后48h注射重组植酸酶病毒，病毒感染后24h体喷100ppm的JH，从起蚕后60h开始每12h调查病蚕体重，并测定植酸酶活力。由图12可见：病毒感染后84h之前，JH处理病蚕的体重低于对照；之后，JH处理开始高于对照，此时对照区已开始发病，病蚕体重下降，至感染后108h对照病蚕已完全充分发病，而经JH处理则推迟6h。最终充分发病时病蚕体重JH处理较对照高7％左右。由图13可见：病毒感染的前96h，JH处理与对照之间植酸酶基因的表达量差异不显著，甚至JH处理的表达量略低于对照，96h以后，JH处理的表达量开始明显高于对照区，至108h对照已开始大量死亡。从上述表达时相可推知，植酸酶基因的表达量提高主要是通过延长表达时间而起作用的。实施例十四、JH处理对野生型病毒多角体蛋白基因在家蚕中表达时相及半致死时间的影响

利用野生型家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白包埋病毒粒子后形成的多角体数目多少作为标志。调查JH处理对多角体蛋白基因表达量的影响。五龄家蚕幼虫起蚕后48h注射WtBmNPV，起蚕野生型病毒感染24h后体喷100ppm的JH，对照区相应用清水处理。从病毒感染后60h开始收集病蚕血样，经超声波破碎细胞和稀释后，记数多角体数目；从72h开始每6h调查一次病蚕死亡率，试验结果见图14和图15。

由图14可见：在JH处理的前期(病毒感染90h之前)，多角体蛋白基因的表达量与对照没有明显差异。在以后的6h内，二者的多角体数目迅速出现明显差异。至病毒感染96h时，JH处理的每毫升血淋巴多角体数目比对照多角体数目高出35％以上。

由图15可见，JH处理同样可以延长感染wtBmNPV的家蚕五龄幼虫发病时间，使发病时间推迟4h以上(JH：LT₅₀＝89.2h；CK：LT₅₀＝84.8h)。实施例十五、MH和JH配合处理对植酸酶基因表达时相和病蚕体重的影响

五龄起蚕24小时后开始添食MH(4μg/头)，48小时后每头蚕注射5μl含大约1×10⁵pfu病毒粒子的病毒稀释液，72小时后再体喷100ppm的JH，搜集不同发病时间的病蚕血淋巴并称重，血淋巴于-20℃保存以用于植酸酶活性分析。以下的MH和JH配合处理均按此进行。

Bm-phy病毒感染60小时开始，每隔12小时搜集一次病蚕称重并取血淋巴，MH配合JH处理对植酸酶基因表达时相和病蚕体重的影响如16和图17所示。在病毒感染60-96小时之间，处理组和对照组两者的植酸酶活性无明显变化，96小时之后，活性明显高于对照，至病毒感染后132小时活性提高达34％；60-72小时病蚕体重相差不明显，72小时后则略有下降，最大下降达5.6％(病毒感染后132h)。从酶活力的表达时相看，激素处理明显延长了外源基因的有效表达时间。实施例十六、MH和JH配合处理对多角体蛋白基因表达时相和病蚕体重的影响

利用单位体积血淋巴中野生型家蚕核型多角体病毒多角体蛋白包埋病毒粒子后形成的多角体数为参照，观测MH和JH联合处理对多角体蛋白基因表达的影响，结果如图18和图19所示。病毒感染60小时开始搜集病蚕，称重并取血淋巴，经超声波破碎细胞、稀释后用血球计数板计数多角体，72小时以后，每隔6小时取样一次。在整个发病期间，多角体数均高于对照，特别是在84小时后更明显，90小时时最高值比对照高出近25％。然而，由于激素处理后蚕体中多角体形成数目多而导致蚕儿发病加重，以致发病后期病蚕平均体重比对照有明显降低(达15％左右)。实验十七、MH和JH配合处理对半致死时间的影响

表七，MH和JH配合处理对感染Wt BmNPV 五龄家蚕幼虫的影响

    处理       死亡率(％)    LT₅₀  感染后84h  感染后90h    CK  MH+JH    44.09    19.7    86.6    56.8    84.83    88.9

从表七可知，MH和JH联合处理使感染野生型家蚕核型多角体病毒的五龄幼虫发病后期死亡率减少，LT₅₀推迟4小时以上。这对提高外源蛋白的生产和病毒增殖均是有利的。

本发明的应用范围并不限于上述实例，从作用机理上说可提高所有外源基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达效率及杆状病毒的复制效率。