应用RP-HPLC技术对昆虫细胞-杆状病毒表达人生长激素的纯化和性质鉴定

摘要

该实验运用离子交换色谱,疏水相互作用色谱和反相高效液相色谱对昆虫细胞杆状病毒表达系统(Sf9-AcNPV)表达的重组人生长激素(recombinant human Growth Hormone,rhGH)进行了纯化.含有rhGH的昆虫细胞培养液经离心超滤浓缩后,以离了交换色谱(CM-52)和疏水相互作用色谱(Phenyl-Sepharose CL-4B)粗提纯,有效的去除了杂蛋白,并使rhGH大大浓缩富集.RP-HPLC中,采用Kromasil C18色谱柱,正丙醇-磷酸钾缓冲液梯度洗脱系统,在35.5﹪正丙醇梯度下,得到有效分离的rhGH.借鉴国外最新报道的累加进样分离法,在分析型RP-HPLC仪上,得到高纯度的rhGH.经酶联免疫分析,放射免疫分析,和Western杂交法分析,证明纯化的rhGH与天然的人生激素有相同的免疫活性;经SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子量为21,500道尔顿;等电点聚焦法测定其等电点为4.9;经丹磺酰氯法测定其N-末端为苯丙氨酸(Phe),与天然人生长激素一致.

目录

文摘

英文文摘

前言

一生长激素的理化性质，生理功能，研究意义

二人生长激素的获得

三高效液相色谱的发展与应用

四运用RP-HPLC从昆虫细胞杆状病毒表达系统分离纯化人生长激素

材料与方法

一材料与试剂

二实验方法

(一)蛋白浓度及rhGH活性的定量检测方法

(二)昆虫细胞培养液中重组人生长激素的提取与纯化

结果与分析

一超滤结果

二疏水路线浓缩的结果

1大孔吸附树脂D3520

2串联离子交换色谱CM-52和疏水作用色谱Sepharose CL-4B对粗提纯的结果

二凝胶过滤路线浓缩的结果

1硫铵沉淀

2凝胶过滤纯化的rhGH的结果

三粗提纯方法的优选

粗提纯方法效率对比表

四HPLC纯化rhGH的结果

1不同洗脱条件的探索

2外标法定量测定rhGH

3终产物的纯度和回收率

五重组人生长激素的性质鉴定

(一)通过SDS-PAGE电泳测定分子量

(二)等电聚焦测定重组生长激素的等电点

(三)重组人生长激素的免疫印迹结果

(四)重组人生长激素的末端分析

讨论

参考文献

致谢