昆虫细胞--杆状病毒表达系统表达人生长激素的纯化和性质研究

摘要

该实验运用离子交换色谱,疏水相互作用色谱和免疫亲和色谱对昆虫细胞杆状病毒表达系统(Sf9-AcNPV)表达的重组人生长激素(recombinant human Growth Hormine,rhGH)进行了纯化.含有rhGH的昆虫细胞培养液经离心后,以离子交换色谱(GM-52)和疏水相用色谱(Phenyl SepharoseCL-4B)浓缩,有效地去除了杂蛋白,得到rhGH精提品:再经过免疫亲和色谱纯化,得到了高浓度的rhGH.经酶免疫分析,放射免疫分析和Western杂交法分析,证明纯化的rhGH与天然的人生长激素有相同的免疫活力;经SDS凝胶电泳测定其分子量为:22,000道尔顿;等电点聚焦法测定其等电点为:4.9.经丹磺酰氯法测定其N-末端为:苯丙氨酸(Phe),这些性质均与天然的人生长激素相符合.

目录

一前言

二材料和方法

1主要的材料和仪器

2实验方法

2.1蛋白质含量的测定

2.2重组人生长激素的检测

2.3昆虫细胞培养液中重组人生长激素的提取和纯化

2.4疏水层析色谱最佳吸附PH条件的选择

2.5利用疏水层析色谱和离子交换色谱对重组人生长激素进行粗提纯

2.6利用亲和层析纯化重组人生长激素

2.7纯化的重组人生长激素的性质鉴定

三实验结果

3.1.细胞培养液浓缩方法的比较

3.2.PhenylSepharoseCL-4B最佳吸附PH条件

3.3.串联离子交换色谱CM-52和疏水作用色谱PhenylSepharoseCL-4B粗提纯的结果

3.4.亲和层析纯化rhGH的结果

3.4.1抗体偶联的结果

3.4.2亲和层析纯化rhGH的结果

3.4.3终产物的纯度和回收率

3.5.重组人生长激素的性质鉴定

3.5.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

3.5.2rhGH分子量的计算

3.5.3rhGH的等电点聚焦分析

3.5.4rhGH等电点的计算

3.5.5Western杂交鉴定纯化的rhGH

3.5.6DNS-C1鉴定rhGH的N-末端

四分析和讨论

4.1rhGH分离中的几个注意事项

4.2rhGH纯化工艺的设计

4.2.1细胞培养液浓缩方案的选择

4.3酶联免疫方法及其影响因素

4.4rhGH的理化性质鉴定

参考文献

致谢