一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用

摘要

本发明公开了一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒穿梭表达载体MbBacmid及应用，该Bacmid含有甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组序列，并含有能在大肠杆菌中复制的基因元件。通过供体质粒pFast-Bac？Mbph，外源蛋白基因可快速插入本发明提供的Bacmid上，在包括Sf9、Tn368、high？five？等多种商品化昆虫细胞内进行高效表达。该载体与供体质粒pFast-Bac？Mbph+pie1-cath同源重组，可获得提高杀虫速度的重组病毒MbMNPV-ph+？pie1-cath。本发明提供的表达系统是唯一一个能在多种商品化昆虫细胞中高效表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒穿梭表达载体系统。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种在多种昆虫细胞表达外源蛋 白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid及应用。

背景技术

杆状病毒是杆状病毒科(Baculoviridae)成员的俗称，根据国际病毒分类委员会(ICT V)2012年公布的第9次报告，杆状病毒科分为四个属，分别是甲型杆状病毒属[Alphabacu lovirus，为感染鳞翅目昆虫的核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)]、乙型杆状 病毒属[Betabaculovirus，为感染鳞翅目昆虫的颗粒体病毒(Granulovirus,GV)]、丙型杆状 病毒属(Gammabaculovirus，为感染膜翅目昆虫的NPV)和丁型杆状病毒属(Deltabaculovi rus，为感染双翅目昆虫的NPV)。根据病毒膜融合蛋白和DNA多聚酶蛋白序列特征及病毒 其他特性，甲型杆状病毒属可分为I组和Ⅱ组。

杆状病毒广泛用于农林害虫的生物防治。同时杆状病毒一昆虫(细胞)系统还是十分优良 的真核表达系统，己用于外源基因、诊断试剂和疫苗等的研究和生产。甘蓝夜蛾多粒包埋核 型多角体病毒(Mamestra brassicea multiple nuc1eopolyhedrovirus，MbMNPV)属Ⅱ组甲型杆 状病毒，是一种广谱杆状病毒，可防治32种以上鳞翅目害虫，对重要农业害虫小菜蛾、棉 铃虫、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾、地老虎、粘虫等都具有较好的控制作用。MbMNPV作为杀虫 剂，已获得农药登记，在国内应用面积超过1000万亩。但该病毒的分子生物学基础研究相 对滞后，病毒广谱性的分子机制研究较少，病毒也存在杀虫速度较慢的缺陷，其更大范围应 用仍受到限制。另外，杆状病毒作为一种真核表达系统，不断提高病毒表达系统的表达量一 直是当今生物工程领域的研究热点。对杆状病毒分子生物学的研究，特别是对病毒基因的结 构与功能的研究将有助于揭示病毒的复制和广谱侵染机制，为重组病毒杀虫剂和快速、高效 表达载体的开发和应用奠定基础。

自1983年Smith和Summers首次报道利用Ⅰ组甲型杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体 病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)在草地贪夜蛾细胞 系Sf9细胞中表达人β-干扰素以来，杆状病毒表达载体因其能在昆虫细胞和昆虫幼虫中高效 表达外源基因，且在大多数情况下杆状病毒表达系统具有加工和修饰表达产物的能力，如信 号肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多数表达产物具有很高的生物活性等优点，使其成 为十分重要的真核表达系统。目前应用杆状病毒表达系统己表达了几千种不同来源的外源基 因。

传统的重组杆状病毒构建需要按以下两步进行：首先，重组杆状病毒必须将外源基因克 隆到转移载体质粒的多克隆位点上，通常多克隆位点位于杆状病毒的强启动子控制下。将转 移载体同杆状病毒DNA共转染到昆虫细胞内，经同源重组产生重组病毒，重组率通常在0. 1-1％之间。其次，重组杆状病毒需用空斑法鉴定和纯化重组病毒。由于重组病毒的产生率 低以及空斑纯化法操作复杂、耗时，往往需数月甚至更长的时间才能构建一个完整的重组病 毒。鉴于按传统方法构建杆状病毒表达系统存在上述两个缺陷，Kuckow发明了一种快速、 有效产生重组杆状病毒的方法，即Bac-to-Bac系统，在7天内就可完成一个重组病毒的构 建，并进行外源基因的高效表达。该系统由Bacmid和pFastBac供体质粒两部分组成。Bac mid含有一个低拷贝数的mini-F replicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因的8. 6kb的DNA片段，一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基 因N-末端，该片段的插入并不改变lacZα基因的阅读框。该Bacmid既能在E.coli内复 制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子。pFastBac供体质粒则是由一个mini-Tn7 转位因子组成，在mini-Tn7左右臂之间插入一个庆大霉素抗性基因、一个杆状病毒特异强 启动子、一个多克隆位点和SV₄₀(A)poly信号序列组成的表达框。在辅助质粒提供的转位酶 的作用下，克隆于pFastBac供体质粒多克隆位点的外源基因能转位至Bacmid的mini-attT n7位点上，通过抗生素抗性筛选和蓝白斑筛选鉴定重组Bacmid.随后从E.coli内提取Bac mid DNA转染昆虫细胞进行外源基因表达。该方法具有重组率高、重组病毒筛选方便等优 点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒甘蓝夜 蛾核型多角体病毒Bacmid(本发明或称MbBacmid)。外源蛋白基因可快速插入MbBacmid 上，在包括Sf9、Tn368、high five等多种商品化昆虫细胞内进行高效表达，同时可在p10 或ph启动子调控下表达回复的多角体蛋白，在ph或pe1强启动子的调控下高效表达+eGF P或其他外源基因。重组病毒既可高效表达外源蛋白，又可形成病毒多角体，便于快速分析 鉴定。本发明提供MbBacmid进行重组病毒研究，获得新重组病毒只需要7-15天，大大提 高了利用重组病毒进行病毒基因功能研究的速度，也为构建更为高效快速广谱昆虫病毒杀 虫剂提供了便捷的途径。含甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体的菌株已于2015年4月8日 送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)/ MbBacmid PhP10，保藏编号CCTCC NO:M2015187。地址：中国武汉武汉大学。用LD 培养基培养，培养温度37摄氏度。

本发明的另一个目的在于提供了一种能在多种商品化昆虫细胞上进行外源蛋白表达的 Ⅱ组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种能在多种商品化昆虫细胞上进行外源蛋白表达的Ⅱ组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型 多角体病毒Bacmid，构建方式包括以下步骤：

(1)甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid转移载体pMbTV的构建

一个含有低拷贝数的细菌DNA复制子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一 个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因 N-末端，形成8.6kb的DNA片段。该片段前面加上甘蓝夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基 因上游约2.3kb片段作为上游同源臂，后面加上多角体蛋白基因下游序列约1.3kb作为下游 同源臂，构成转移载体pMbTV。

(2)甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体Mb Bacmid的构建

用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子DNA共转染棉铃虫4龄幼虫，提取BV D NA，电转入大肠杆菌DH10B，挑选单菌落，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内 复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取不同菌落的 Bacmid核酸进行BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、HindⅢ和Pst Ⅰ等内切酶分析，内切酶图谱与野生型 病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid-a1。

用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子核酸共转染甜菜4龄幼虫，提取BV DNA， 电转入大肠杆菌DH10B，挑选单菌落，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形 成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取菌落的Bacmid核 酸进行限制内切酶分析，内切酶图谱与野生型病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载 体MbBacmid-a2。

按MbBacmid-a1和MbBacmid-a2为1:1比例混合转染Sf9昆虫细胞，收集病毒粒子， 提取核酸再转染大肠杆菌DH10B，产生甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体MbBacmid。 提取不同单菌落Bacmid DNA进行454全基因组测序，与公布的基因组全序列进行比对， 基因组序列相一致的菌株鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid。甘蓝夜蛾核型多角体病 毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid转化到Eschrichia coli DHl0B株内，即获得了一株含 甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体的菌株，甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体 MbBacmid转化到Eschrichia coli DHl0B株内，即获得了一株含甘蓝夜蛾核型多角体病毒 表达载体的菌株，该菌株已于2015年4月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命 名：大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)/MbBacmid PhP10，保藏编号CCTCC NO: M2015187。地址：中国武汉武汉大学。

该菌株的生理生化特性与大肠杆菌DH10B相同。

甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid的构建是利用同源重组的 方法将一个含有低拷贝数的细菌DNA-F复制因子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基 因和一个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα 基因N-末端的8.5kb的DNA片段置换到甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组多角体蛋白基因 位点上，因此，所构建的甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBacmid是缺少 多角体蛋白基因的重组病毒，用这种重组病毒感染草地贪夜蛾细胞(Sf9)、粉纹夜蛾细胞(T n368、High five)或美洲棉铃虫细胞(HzAm1)，不能在细胞核内形成包涵体。在利用供体 质粒(MbpFastBac)将外源基因转位到甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体MbBa cmid的转位子插入位点(mini-attTn7)，其DNA转染草地贪夜蛾细胞(Sf9)和其他多种昆虫 细胞后，能形成具有感染性的重组病毒粒子，并能在多角体蛋白基因启动子控制下表达外源 基因。当利用供体质粒将多角体蛋白基因回复到MbBacmid中，并加上p10启动子位点形成 MbBacmid Ph+P10质粒。MbBacmid Ph+P10 DNA转染多种细胞，既可形成多角体，也可 在p10强启动子控制下表达外源蛋白。另外，在回复多角体蛋白基因的MbBacmid中，加上 病毒极早期基因pe1启动子位点形成MbBacmid Ph+Pe1质粒，可在pe1启动子控制的多克 隆位点中插入一些重要功能基因，在病毒复制的极早期就开始表达发挥功能。

一种能在多种商品化昆虫细胞上进行外源蛋白表达的Ⅱ组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型 多角体病毒Bacmid的应用，包括构建不同的供体质粒，以快速获得不同功能的重组病毒。

更具体的方案详见《具体实施方式》。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、解决了Ⅱ组杆状病毒载体不能在多种商品化昆虫细胞上进行蛋白表达和基因操作的 问题

目前国内外能在多种商品化昆虫细胞(Sf9、Tn368、High five等)中进行表达的杆状 病毒Bacmid只有属于Ⅰ组杆状病毒的苜蓿银纹夜峨核型多角体病毒穿梭表达质粒(AcBacmi d)，本发明提供的MbBacmid，使Ⅱ组杆状病毒载体也能在多种商品化昆虫细胞上进行蛋白 表达和基因操作，可以方便地在多种商品化昆虫细胞中对Ⅱ组杆状病毒特异基因功能进行研 究。

2、病毒穿梭表达载体Bacmid克隆在两种以上的宿主昆虫中进行，解决了杆状病毒表 达载体在细胞上构建时容易丢失重要基因的问题，保持了载体基因完整特性。

杆状病毒表达载体的构建，一般都始终在昆虫细胞中进行，但杆状病毒长期在昆虫细胞 中复制，容易出现基因丢失，有的甚至出现多个大片段丢失。为了克服这一障碍，在克隆穿 梭表达载体的过程中，通过微量注射方法，用表达载体和甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组D NA共转染棉铃虫或甜菜夜蛾幼虫，由于甘蓝夜蛾核型多角体病毒对棉铃虫和甜菜夜蛾都具 有很高的感染性，共感染后可在昆虫体内快速形成更多的穿梭表达载体，在两种或两种以上 宿主昆虫中获得穿梭表达载体克隆，从一开始就保持了病毒表达载体基因的完整性。因为一 开始就在昆虫细胞中进行基因工程操作和病毒载体克隆，容易使病毒基因组中的一些重要基 因丢失。

3、将病毒早期基因启动子引入病毒表达载体，可在病毒感染早期表达重要功能蛋白， 也可在哺乳动物细胞中进行蛋白表达。

以前杆状病毒Bacmid供体质粒中使用的启动子一般都是ph、p10、或p6.9等晚期和 极晚期启动子。这些晚期启动子虽然功能较强，但表达时间较晚，对一些有杀虫功能的蛋白， 早期表达可获得更好的功能效果。

本发明构建的供体质粒既有PI0启动子控制下的多克隆位点，又有多角体蛋白启动子 控制下的多克隆位点。其优点是，当外源基因插入到Ph启动子控制下的多克隆位点后，P 10启动子控制下的多克隆位点中仍可插入显色蛋白基因。经转位将外源蛋白基因和显色蛋 白基因同时插入到甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(MbBcmid)中的转位子 插入位点，转染到草地贪夜蛾细胞(Sf9)和其他多种细胞后，既可获得较大的外源蛋白表达 量，也能在光学显微镜或荧光显微镜下观察细胞内是否显色，证明转染获得成功，随后可收 集重组病毒粒子再感染细胞并可进行外源基因表达水平的检测。因此显色蛋白基因的表达可 作为转染成功的重要识别标记。

另外，也可将多角体蛋白基因重新插入到p10启动子下的多克隆位点，在Ph启动子控 制下的多克隆位点中插入外源蛋白基因，所产生的重组病毒是一个不缺失任何基因的重组病 毒，因而该重组病毒不仅能在昆虫细胞内也可在昆虫幼虫内表达外源基因。同时也便于插入 对昆虫有特异性毒杀作用的毒素基因，构建高效、快速的重组病毒杀虫剂。

4.目前在杆状病毒科中仅发现3种广谱核型多角体病毒，分别是甘蓝夜蛾核型多角体 病毒、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和芹菜夜蛾(薄荷灰夜蛾)核型多角体病毒。这三种病 毒中只有甘蓝夜蛾核型多角体病毒属于甲型杆状病毒属Ⅱ组。本发明提供的MbBacmid，是 全球第二种能在多种昆虫细胞上进行基因操作和外源蛋白表达的Bacmid，也是唯一一种能 在多种昆虫细胞中进行外源蛋白表达和进行基因功能研究的Ⅱ组杆状病毒Bacmid。

5.尽管AcMNPV表达载体已用于数千种外源蛋白的表达，但其对特定重要蛋白的表达 量仍不尽人意。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒虽然也是广谱病毒，对40多种鳞翅目昆虫或 昆虫细胞有感染性，但除了粉纹夜蛾、甜菜夜蛾等少数几种昆虫外，它对其他昆虫的毒力不 强。甘蓝夜蛾核型多角体病毒不仅广谱，而且对小菜蛾、棉铃虫、粘虫、小地老虎、黄地老 虎、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾等多种重要农业害虫都有很好的控制作用。由于甘蓝夜蛾核型多角 体病毒有更强的毒力，利用本发明提供的MbBacmid，可在商品化昆虫细胞中获得更大的外 源蛋白表达量。另外，AcMNPV基因组分子大小约为130kb，MbMNPV基因组大小约为1 55kb，后者分子容量更大。利用本发明提供的MbBacmid进行改造后表达外源蛋白，也可获 得更大表达量。

附图说明

图1为MbBacmid和pMbTV转移载体结构示意图。

含有低拷贝数的细菌DNA复制子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个l acZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N- 末端的8.6kb的DNA片段加上多角体蛋白基因(ph)上游臂和下游臂构成MbTV转移载 体，经同源重组，将这个片段置换到甘蓝夜蛾多核型多角体病毒(MbMNPV)基因多角体蛋白 基因(PH)启动子后的位点上，构建既能在昆虫细胞或昆虫体内复制又可在细菌内复制的 甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(MbBacmid)。

具体实施方式

本发明实施例中，所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所用试 剂如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的构建，包括以下 步骤：

(1)、甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid转移载体pMbTV的构建

一个含有低拷贝数的细菌DNA复制子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一 个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因 N-末端，形成8.6kb的DNA片段。该片段前面加上甘蓝夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基 因上游约2.3kb片段作为上游同源臂，后面加上多角体蛋白基因下游序列约1.3kb作为下游 同源臂，构成转移载体pMbTV(图1)。转移载体构建过程为：

首先，根据GeneBank中的甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组序列设计两对引物，扩增用 于同源重组的两个同源臂。引物序列P1:上游同源臂F：5’-GCTCTAGAATATTCCTTCGCTC -3’(下划线部分为Xba Ⅰ酶切位点)，P2:上游同源臂R：5’-CGCGGATCCTCACAATCTT CTACG-3’(下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点)，P3:下游同源臂F：5-’TCCCCCGGGCCTGA GGATAATTAAAACACAAAAATGAT-3’(下划线部分为Sma Ⅰ酶切位点)(斜体字体部分为 Bsu36 Ⅰ酶切位点)，P4:下游同源臂R：5-’CGGGGTACCTGTAAGAGGTCTGTCCAG-3’(下 划线部分为Kpn Ⅰ酶切位点)。

然后，提取野生型MbMNPV(wtMbMNPV)的基因组,用Pl和P2扩增多角体基因的上 游片段,回收PCR产物中的目的条带,用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ对PCR产物和载体pBluescript II KS(+)进行双酶切后连接,筛选出阳性克隆pKS-UP。再用引物P3和P4扩增多角体基因的下 游片段,回收PCR产物中的目的条带,用Sma Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切后克隆到pKS-UP,构建成质 粒pKS-UP-DOWN；将pKS-UP-DOWN用Bsu36I酶切后,SAP去磷酸化,再用Bsu36I内切酶 从质粒pBAC一Bsu36I切下8.6K的带有Kanamycin抗性基因、mini F复制子：attTn7和S V40元件的片段,利用内切酶位点的粘性末端将二者连接起来,Sma Ⅰ酶切鉴定,挑选出正确的 克隆,即转移载体pMbTV。

(2)、甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体Mb Bacmid的构建

使用微量注射方法，用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子DNA共转染棉铃虫4 龄幼虫，由于重组病毒只能产生病毒病毒粒子而不能形成多角体，转染后72小时，收集幼 虫血淋巴，提取BV DNA电转入大肠杆菌DH10B，感受菌接种于含有卡那霉素(50μg/ml) 和四环素(50μg/ml)的LB固体培养基上，37℃，培养12-16小时，挑选单菌落，进行蓝白 斑筛选，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核 型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取不同菌落的Bacmid核酸进行BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、 HindⅢ和Pst Ⅰ等内切酶分析，内切酶图谱与野生型病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜蛾穿梭 表达载体MbBacmid-a1。

使用微量注射方法，用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子核酸共转染甜菜4龄幼 虫，转染后60小时，由于重组病毒只能产生病毒病毒粒子而不能形成多角体，收集转染幼 虫血淋巴，提取BV DNA，电转入大肠杆菌DH10B，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫 细胞内复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取菌落 的Bacmid核酸进行限制内切酶分析，内切酶图谱与野生型病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜 蛾穿梭表达载体MbBacmid-a2。

对两个单菌落进行扩增，分别提取载体核酸，按MbBacmid-a1和MbBacmid-a2为1:1 比例混合转染Sf9昆虫细胞，转染后4-7天收集病毒粒子，提取核酸再转染大肠杆菌DH10 B，在含有同上面相同抗生素的LB固体培养基上，37℃，培养12-16小时，进行蓝白斑 筛选，产生甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体MbBacmid。提取不同单菌落Bacmid D NA进行454全基因组测序，与公布的基因组全序列进行比对，基因组序列相一致的菌株 鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid。甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体 MbBacmid转化到Eschrichia coli DHl0B株内，即获得了一株含甘蓝夜蛾核型多角体病毒 表达载体的菌株，该菌株于2015年4月1日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类 命名：大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)/MbBacmid PhP10，保藏编号：CCTCC NO:M2015187，地址：中国武汉武汉大学。

该载体替换了病毒多角体蛋白基因序列，在宿主和细胞中不产生多角体。

实施例2：

一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的应用，包括以下步骤：

(1)含回复基因PH和病毒早期表达pie1+cath基因的供体质粒的构建

根据甘蓝夜蛾核型多角体病毒的全基因组序列分别设计病毒多角体蛋白基因(包括启动 子序列)、病毒早期基因1启动子序列(pie1)和病毒组织蛋白酶基因cath的引物，引物序列 为:Ph-1:5’-CCGGATCCCTATTAGTAGTAAACTGTATCGTG-3’(下划线为BamH I酶切位 点)，Ph-2:5’-GCGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG-3’(下划线为BstI内切酶位 点)；Pie1-1:5’-AGATGTCCATACCTGTCAGGGAATGC-3’(下划线为Bgl内切酶位点)，Pi e1-2:5’-GGATCCCGAGTTATTAGCGTCATAGCCTTCC-3’(下划线为BamH I内切酶位 点)；Pcath-1：5’-GGAATTCTGTATGCTCGTTACAGTTACAGC-3’(下划线为EcoRI内切酶 位点，Pcath-2:5’-CTCTAGATTGATAACGAGGACCAGACTA-3’(下划线为XbaI内切酶位点。

以甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组核酸为模板，用这些引物对通过PCR方法分别扩增 出包括启动子序列的病毒多角体蛋白基因PH+，早期表达基因ie1启动子序列pie1和病毒组 织蛋白酶基因cath序列。

PCR产物鉴定正确后，按照Promega公司提供的pGEM-T Easy载体产品说明介绍的 方法将多角体蛋白基因Ph(包括启动子序列1050bp)、Pie1(180bp)启动子序列和cath基因 序列克隆到pGEM-T Easy载体上。分别命名为pGEM-T Easypie1、pGEM-T Easy Ph+和p GEM-T Easy cath。将pGEM-T Easy pie1DNA和pGEM-T EasyPh+质粒DNA分别用不 同的内切酶双酶切,然后将切下的多角体基因片段与pGEM-T Easy pie1质粒DNA的线性 化片段进行连接,利用两个酶切片段具有的粘性末端的特性,将两者连接后,转化到DH5α受 体菌,在含有氨卞青霉素的LB平板中筛选插入有pie1启动子序列和多角体基因序列的阳 性克隆,即得到pGEM-T Easy ph+pie1质粒。提取pGEM-T Easy ph+pie1质粒DNA限制 内切酶鉴定正确。

供体质粒的构建以Invitrogen公司的AcMNPV pFastBac^TMDual质粒作为起始质粒,该 质粒包括AcNPV的多角体蛋白基因启动子和p10晚期基因强启动子。两个启动子方向相反 连接，两个启动子后各带有一个多克隆酶切位点(MCS)。首先，分别用两个不同的限制 性内切酶双酶切pFastBacDual质粒，将其中的Ac-p10启动子序列和Ac-pPohl启动子序列 删除，同时，相应地用两个不同内切酶双酶切pGEM-Easy ph+pie1质粒,利用内切酶粘性末 端连接，得到pFast-Bac Mbph+pie1质粒。然后，在pFast-Bac Mbph+pie1质粒pie1启动子 后的多克隆位点上插入cath基因，得到含有多角体蛋白基因和Mb-pie1启动子调控组织蛋 白酶基因序列的供体质粒pFast-Bac Mbph+pie1-cath。

(2)、含有回复基因PH和早期表达cath基因重组病毒MbBacmid-ph+pie1-cath的产 生

用pFast-Bac Mbph+pie1-cath质粒转染含实施例1制备的MbBacmid质粒的大肠杆菌D H10B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大 霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生 素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后， 接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。按常规方法从 培养菌中提取含回复基因ph+和早期表达cath基因的重组病毒MbMNPV-ph+pie1-cath。

(3)、回复基因的表达和检测

提取含回复PH基因和早期表达cath基因的MbBacmid-ph+pie1-cath DNA，按照常规 转染方法，利用脂质体将含有外源基因的质粒MbBacmid-ph+pie1-cath DNA转染到草地 贪夜蛾细胞系Sf9细胞内，28℃培养6-7天，在光学显微镜下检测病毒多角体的形成，在 电子显微镜下观察形成多角体的形态和结构完整。

(4)、生物活性测定

收集病毒多角体计数，按常规方法进行病毒对棉铃虫和甜菜夜蛾的生物活性测定，研究 在极早期基因pie1启动子控制下的早期表达组织蛋白对病毒杀虫活性的促进作用。试验结 果表明，含早期表达v-cath基因的重组甘蓝夜蛾核型多角体病毒感染棉铃虫3龄初幼虫，病 毒杀虫半致死时间(LT₅₀)由116小时缩短到96小时。该重组病毒感染3龄初甜菜夜蛾幼 虫，半致死时间(LT₅₀)由98小时缩短到82小时。

实施例3：

一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的应用，包括以下步骤：

(1)、含回复基因Ph和p10启动子供体质粒pFastBac的构建

利用PCR方法，从病毒基因组中扩增带启动子序列的甘蓝夜蛾核型多角体病毒蛋白基 因，克隆到pGEM T-Easy中，形成pGEM T-Easy PH质粒。同时扩增出病毒p10基因启 动子克隆到pGEM T-Easy中，形成pGEM T-Easy p10质粒。构建根据合适的内切酶位点， 将带启动子的多角体蛋白基因和p10启动子连接起来，形成含PH基因和p10基因双启动子 的片段，构建成含回复基因Ph和p10启动子供体质粒pFastBac。具体方法为：

首先，选择位于多角体基因启始位点上游190bp的一段序列作上游引物和多角体蛋白 基因终止密码下游序列作下游引物,利用wtMbMNPV DNA作模板进行PCR扩增,筛选带 有启动子的多角体基因。同时选择MbMNPV p10启动子上下游一对引物扩增p10启动子 序列。引物序列如下:Ph-1:5’-CGGATCCCTATTAGTAGTAAACTGTATCGTG-3’(下划线为 BamH I酶切位点)，Ph-2:5’-CGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG-3’(下划线为 BstI内切酶位点)；P10-1:5’-CAGATGTCGAAACCTGACAGCGAAACG-3’(下划线为Bgl 内切酶位点)，P10-2:5’-GGATCCCGTGATTATTACGTCGTAGACTTGG-3’(下划线为Bam H I内切酶位点)。

多角体蛋白基因(包括启动子)PCR扩增反应体系为:5μL 10xTaqDNA聚合酶缓冲液, Ph-1引物和Ph-2引物各2.5μL(25pmol),1μL wtMbMNPV DNA,1μL dNTPs(10mmol/L), 1μL TaqDNA聚合酶,37μL ddH2O,总体积为50μL。PCR扩增的循环参数为:94℃变性 45s,58℃退火48s,72℃延长1min共5次循环,再经94℃变性45s,48℃退火48s, 72e延长1min,共25个循环,经30个循环后,72℃延长5min。

P10启动子序列的PCR扩增:除以P10-1和P10-2引物取代Ph-1和Ph-2引物外,其 他条件和上述反应条件一致。

PCR产物鉴定正确后，按照Promega公司提供的pGEM-T Easy载体产品说明介绍的 方法将多角体蛋白基因(包括启动子序列1150bp)或P10(280bp)启动子序列克隆到pGEM- T Easy载体上。利用Bgl II和Pst I限制性内切酶鉴定p10启动子序列在pGEM-T Easy 中的插入方向,选择Bgl II和Pst I酶切位点在同一末端的克隆,命名为pGEM-T Easy p1 0。用BamH I和Pst I限制性内切酶鉴定多角体基因的插入方向,选择BamHI和Pst I酶 切位点分别位于多角体基因片段不同末端的克隆,命名为pGEM-T Easy Ph。将pGEM-T E asy p10 DNA用Bgl Ⅱ和Pst I进行双酶解,用BamHI和Pst I限制性内切酶双酶解pG EM-T Easy Ph质粒DNA,然后将切下的多角体基因片段与pGEM-T Easy p10质粒DNA 的线性化片段进行连接,由于Bgl Ⅱ和BamHI酶切片段具有的粘性末端,两者连接后,转 化到DH5α受体菌,在含有氨卞青霉素的LB平板中筛选插入有p10启动子序列和多角体基 因序列的阳性克隆,即得到pGEM-T Easy PhP10质粒。

供体质粒的构建以Invitrogen公司的AcMNPV pFastBac^TMDual质粒作为起始质粒,该 质粒上含有AcMNPV的多角体蛋白基因启动子和p10基因启动子，两个启动子方向相反， 在两个启动子后各带一个多克隆位点。分别用BamH Ⅰ和Nhe Ⅰ限制性内切酶双酶切pFast BacDual质粒和用BamH Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切pGEM-EasyPhP10质粒。pFastBacDual经双酶 切后可将Ac-p10启动子序列和Ac-pPohl启动子序列去除,而在pGER-EasyPhP10质粒经双 酶切后可得到含有多角体蛋白基因和Mb-p10启动子序列的片段。将两种片断连接后逐构建 成供体质粒pFast-BacMbPhp10。

(2)、含有回复基因PH和p10高效表达启动子MbBacmid Php10的产生

用pFast-BacMbPhP10质粒转染含实施例1制备的MbBacmid质粒的大肠杆菌DH10B 菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大霉素的 LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素的X -的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后，接种 于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。按常规方法提取含 回复基因PH和p10基因启动子的表达载体质粒MbBacmid Ph+p10质粒。

(3)、回复多角体蛋白基因表达和鉴定

提取MbBacmid Ph+p10 DNA，按常规方法转染TN368细胞，28℃培养7天，在光学 显微镜下检测细胞中形成病毒多角体。分离病毒多角体，在电子显微镜下观察，研究回复基 因表达形成多角体的形态和结构，电子显微镜下病毒多角体形态完整，多角体膜完整，表明 回复多角体蛋白基因在昆虫细胞中完整表达。

(4)、表达外源蛋白能力的鉴定

将eGFP基因连接到步骤(1)构建供体质粒的p10启动子后的多克隆位点中，形成pF ast-BacMbPhp10GFP质粒，提取质粒DNA转化含实施例1制备的含MbBacmid质粒的DH 10B菌株，产生MbBacmidPhp10GFP重组病毒。提取重组病毒DNA转染F粉纹夜蛾细胞系 TN368细胞，转染后3-5天，在荧光显微镜下观察，可看到细胞中充满绿色荧光，表明绿 色荧光蛋白外源蛋白可在Mbp10启动子控制下高效表达。转染后6-7天，在普通显微镜下 观察，可看到大量病毒多角体形成，表明在Sf9细胞中，重组病毒多角体蛋白基因也完整表 达。

实施例4：

一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的应用，包括以下步骤：

(1)含ph和p10双启动子供体质粒的构建

根据甘蓝夜蛾核型多角体病毒的全基因组序列分别设计病毒多角体蛋白基因启动子和 病毒p10基因启动子序列引物。Ph-F:5’-CCGGATCCCTATTAGTAGTAAACTGTATCGTG -3’(下划线为BamH I酶切位点)，Ph-R:5’-GCGTATACGTAGCATTAGCACCAGGATTAG -3’(下划线为BstI内切酶位点)；P10-F:5’-CAGATGTCGAAACCTGACAGCGAAACG-3’(下 划线为Bgl内切酶位点)，P10-R:5’-GGATCCCGTGATTATTACGTCGTAGACTTGG-3’(下 划线为BamH I内切酶位点)。以甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组核酸为模板，用这两对引 物通过PCR方法分别扩增出MbMNPV多角体蛋白基因启动子序列和Mbp10启动子序列。

PCR产物鉴定正确后，按照Promega公司提供的pGEM-T Easy载体产品说明介绍的 方法将多角体蛋白基因启动子序列和Mbp10启动子序列克隆到pGEM-T Easy载体上。分 别命名为pGEM-T Easyph和pGEM-T Easy p10。将pGEM-T Easy p10DNA和pGEM-T  Easy ph质粒DNA分别用不同的内切酶双酶切,然后将切下的质粒DNA的线性化片段进 行连接,利用两个酶切片段具有的粘性末端的特性,将两者方向相反连接,转化到DH5α受体 菌,在含有氨卞青霉素的LB平板中筛选插入有p10启动子序列和多角体基因启动子序列 的阳性克隆,得到含双启动子的pGEM-T Easyphp10质粒。

供体质粒的构建以Invitrogen公司的AcMNPV pFastBac^TMDual质粒作为起始质粒,该 质粒包括AcMNPV的多角体蛋白基因启动子和p10晚期基因强启动子。两个启动子方向相 反连接，两个启动子后各带有一个多克隆酶切位点(MCS)。首先，分别用两个不同的限 制性内切酶双酶切pFastBac^TMDual质粒，将其中的Ac-p10启动子序列和Ac-pPohl启动子 序列删除，同时，相应地用两个不同内切酶双酶切pGEM-T Easy php10质粒,得到含有Mb  MNPV多角体蛋白基因启动子和Mb-p10启动子序列的pFast-BacMbphp10质粒。

(2)、含双启动子MbBacmid-php10的产生

用pFastBacMbphp10供体质粒转染含实施例1制备的MbBacmid质粒的大肠杆菌DH1 0B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大霉 素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素 的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后， 接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时，按常规方法从 培养菌中获取含双启动子的MbBacmid-php10，限制内切酶进行鉴定。

(3)、在双启动子下表达两种外源蛋白供体质粒的构建

根据H7N9流感病毒的基因组序列分别设计病毒血凝素酶(H)和基质蛋白1(M1)基 因上下游引物，引物中带特定的内切酶位点。以病毒基因组cDNA为模板，在P3实验室扩 增H和M1片段，分别克隆到PUC19载体上，命名为PUC19-H和PUC19-M1。经转化DH 5α菌扩增后，将H基因片段和M1基因片段分别连接到ph和p10启动子控制下的多克隆位 点上，构成pFastBacMbph-H p10-M1供体质粒。

(4)、在双启动子下表达两种外源蛋白MbBacmid ph-H p10-M1的产生

用pFastBacMbph-H p10-M1供体质粒DNA转染实施例1制备的含MbBacmid质粒的 大肠杆菌DH10B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉 霉素、庆大霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上 述三种抗生素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测 目的基因后，接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。 按常规方法从培养菌中提取在双启动子下表达两种外源蛋白的表达载体质粒MbBacmid ph- H p10-M1。

(5)、双启动子表达载体在昆虫细胞中的表达

提取MbBacmid ph-H p10-M1质粒DNA，按照常规的转染方法，利用脂质体将含有外 源基因的质粒DNA转染到粉纹夜蛾细胞系High five细胞内，28℃培养7天，利用预先 制备的H或M1抗体检测外源蛋白的表达。

(6)、电镜观察

提取表达产物，在电子显微镜下观察，看到明显的约55nm的病毒样颗粒(VLP)。

(7)、表达产物功能验证

利用常规方法，在P3实验室对小鼠进行检测，表达的VLP对H7N9病毒有明显的免 疫功能。

实施例5：

一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Mb Bacmid的应用，包括以下步骤：

(1)、含ph启动子Mb pFastBacMbph供体质粒的构建

根据甘蓝夜蛾核型多角体病毒的全基因组序列设计病毒多角体蛋白基因启动子序列 引物，正向引物:Ph-F:5’-CCGGATCCCTATTAGTAGTAAACTGTATCGTG-3’(下划线为 BamH I酶切位点)，反向引物Ph-R:5’-GCGTATACGTAGCATTAGCACCAGGATTAG-3’ (下划线为BstI内切酶位点)。以甘蓝夜蛾核型多角体病毒基因组核酸为模板，用正反向 引物通过PCR方法扩增出MbMNPV多角体蛋白基因启动子序列。

PCR产物鉴定正确后，按照Promega公司提供的pGEM-T Easy载体产品说明介绍的 方法将多角体蛋白基因启动子序列克隆到pGEM-T Easy载体上。命名为pGEM-T Easy ph。

供体质粒的构建以Invitrogen公司的AcMNPV pFastBac ^TM质粒作为起始质粒，该质 粒以多角体基因启动子启动,含一个多克隆位点(MCS)。首先，分别用两个不同的限制性 内切酶双酶切pFastBac^TM质粒，将其中的Ac-ph启动子序列删除，同时，相应地用两个不 同内切酶双酶切pGEM-T Easy ph质粒,得到含有多角体蛋白基因启动子序列，以内切酶的 粘性末端连接，形成pFast-BacMbph质粒。

(2)、表达外源蛋白供体质粒的构建

克隆eGFP基因，将其连接到pFast-BacMbph多角体蛋白基因启动子控制下的多克隆位 点，形成含外源荧光蛋白基因的供体质粒pFast-BacMbph-GFP。

(3)、表达外源荧光蛋白MbBacmid ph-GFP的产生

用供体质粒pFast-BacMbph-GFP转染含实施例1制备的MbBacmid质粒的大肠杆菌D H10B菌株(CCTCC NO:M2015187)，将受体菌放在l毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大 霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生 素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌落经PCR检测目的基因后， 接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。按常规方法提 取表达外源蛋白的质粒MbBacmid ph-GFP。

(4)、外源蛋白在昆虫细胞中表达

提取MbBacmid ph-GFP质粒DNA，按照常规的转染方法，利用脂质体将含有外源基 因的质粒DNA转染到草地贪细胞系Sf21、Sf9、Tn368或High Five细胞内，28℃培养 5-7天，在荧光显微镜下观察，可看到细胞中充满绿色荧光，GFP蛋白在昆虫细胞中大量表 达。