一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法以及用于该方法的莴苣叶绿体DNA片段

摘要

本发明提供了一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法，包括：利用SEQ ID NO：2所示序列或者包括SEQ ID NO：2所示序列3’端的不小于1kb的片段、SEQ ID NO：3所示序列或者包括SEQ ID NO：3所示序列5’端的不小于1kb的片段、外源DNA片段以及一种载体质粒来构建一个重组载体质粒，并使插入到载体质粒上的外源DNA片段位于所述的两个片段之间；利用所构建的重组载体质粒DNA转化莴苣细胞；培养转化的细胞成为植株。本发明还提供了用于该方法的莴苣叶绿体DNA片段。

说明书

本发明涉及一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法以及用于该方法的莴苣叶绿体DNA片段。

几十年来，外源基因向植物核基因组的转化一直是植物基因工程的主要研究方向。然而，随着研究的深入其弊端也日益显现，如细胞核基因组大，背景复杂；导入外源基因位置随机，易引起其它性状变异；外源基因表达效率低，在后代中表达不稳定；对于来自原核生物的基因必须加以修饰和改造等，这些问题严重影响着外源基因转化技术的改进及其在实践中的应用。而外源基因向叶绿体基因组中转化在一定程度上克服了向核基因组中转化的不足，并具有独特的优越性：如叶绿体转基因的拷贝数多，可实现高效表达；原核生物来源的基因，无需改造和修饰就可用于在叶绿体内高效表达；转化体后代的遗传显示母系遗传；不像核转化体，其转化的外源基因可以随花粉扩散，而叶绿体转基因植物具有良好的安全性，同时，外源基因可以在叶绿体基因组定点整合，所以叶绿体转化技术特别适合于对叶菜类植物营养价值的改良和医药工业的农业化。特别是叶绿体可超量表达外源蛋白，因此植物叶绿体有可能成为工业用酶或药用蛋白如等产品的“生物反应器”，使医药工业的产品真正成为“绿色产品”。

但要进行叶绿体遗传操作必须具备两个条件：一是构建植物叶绿体定点转化载体；另一个是最好建立叶片再生的组织培养转化体系。而前者是更为重要的技术环节。要构建合适的叶绿体定点转化载体，首先须选好定位片段，即与叶绿体基因组的同源片段之间发生重组的片段，从而确定外源基因的插入位点。作为定位片段，一般要求具备下面两个条件：一是要有足够的DNA长度，一般为1-2kb，以保证外源DNA的有效整合(Carrer等，Mol Gen Gene，1993，241：49-56；Svab等，Proc NatlAcad Sci USA，1993，90：913-917；Zoubenko等，Nucl Acid Res，1994，22：3819-3824；McBride等，BioTechnol，1995，13：362-365)；二是设计合适的插入位点。外源基因的插入既不能引起原有叶绿体基因组重要序列的丢失，又不至于干扰临近基因的正常功能。为此，人们通常选择基因的间隔区作为插入位点，因为基因的间隔区一般为非功能区。在烟草的叶绿体转化研究中常采用的插入位点在大单拷贝区的rbcL/accD(Carrer等，Mol Gen Gene，1993，241：49-56；Svab等，Proc Natl AcadSci USA，1993，90：913-917；Kota等，Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：1840-1845)、PsbA/trnK(邹林荣等1998，张中林等2000)、和位于反向重复序列区的16S trnV/rps12(Zoubenko等，Nucl Acid Res，1994，22：3819-3824)。为了使外源基因整合进叶绿体基因组后能够高效表达，在构建转化载体时，一般需选用叶绿体来源的强启动子和终止子。最常用的启动子是光系统II作用蛋白基因psbA的启动子和核糖体RNA基因rrn的启动子，而常用的终止子是psbA基因的终止子，从而保证外源基因在受体植物DNA中的正常表达。此外，转化载体还需包含合适抗生素基因，以便对转化体进行有效的筛选。

由于叶绿体定点转化载体中定位片段的确立是以了解叶绿体基因组序列为基础的。而目前仅有少数高等植物的叶绿体序列被全部或部分测定，因此高等植物的叶绿体转化只在这些少数植物叶开展，如烟草(McBride，1995)、拟南芥(Sikdar，1998)、水稻(Khan，1999)和马铃薯(Sidorov，1999)，这其中尤以烟草中的研究为多，工作已从转化简单的报告基因扩展到利用叶绿体转化体系获得抗虫、抗旱、抗除草剂植株、生产生物可降解塑料、乃至工业用酶或药用蛋白等方面。但由于上述植物不适于人类生食，且多含有害物质(如烟草的烟碱、马铃薯的龙葵素等)，所以不能以直接食用方式应用，限制了应用范围。

作为叶菜类的代表，叶用莴苣应是作为叶绿体转化的良好受体材料，它的叶部分占全株的比例大，且可以生食，并由此而称之为生菜，另外生菜含有多种营养物质，叶片薄而脆，品质鲜嫩，味道爽口清鲜，无论生吃、炒食都受到人们的喜爱，不但是西餐做沙拉的主要蔬菜，目前也是中餐家常菜的佳品。所以利用这种植物作为叶绿体基因转化的受体来生产的药物蛋白或疫苗，完全可以直接食用方式利用，这是以往的叶绿体基因转化体系所不具备的优点。

现在已报导的莴苣的核基因转化工程主要在国外，但至今还没有以莴苣叶绿体为对象进行遗传转化的报道，这与莴苣叶绿体的已知序列极少有很大关系，到目前为止有关莴苣叶绿体基因组序列的报告只有三个，登录号分别为AF162208(527bp)、AF162202(350bp)和AF162201(532bp)，这些序列不但长度不足以用于构建相应的叶绿体转化载体的同源片段，而且位点也不适宜。

为建立莴苣叶绿体基因组转化体系，本发明利用分子生物学方法获得了足以进行构建叶绿体载体所必需的莴苣叶绿体DNA片段、并从这些片段的序列信息中分离出用于构建莴苣叶绿体定位转化载体所需的莴苣叶绿体同源重组DNA片段。

本发明的一个目的是提供一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于本发明的方法的莴苣叶绿体DNA片段。

本发明提供了一种向莴苣叶绿体中导入外源DNA的方法，包括：利用SEQ ID NO：2所示序列或者包括SEQ ID NO：2所示序列3’端的不小于1kb的片段、SEQ ID NO：3所示序列或者包括SEQ ID NO：3所示序列5’端的不小于1kb的片段、外源DNA片段以及一种载体质粒来可以用于莴叶绿体基因组定点转化的载体质粒，其特征是外源DNA片段位于所述的两个片段之间；利用所构建的重组载体转化莴苣细胞；培养转化的细胞成为植株。

本发明还提供了一种莴苣叶绿体的DNA片段，它含有SEQ ID NO：2所示全部或部分序列的DNA片段。所述的片段的长度最好不小于1kb。本发明还提供了一种含有SEQ ID NO：3所示全部或部分序列的DNA片段。该片段的长度最好不小于1kb。

本发明所述的莴苣叶绿体DNA片段主要是指psbA基因及其附近的一段DNA序列，即SEQ ID NO：1所示序列的片段。因为没有可供参考的莴苣叶绿体基因组序列，而且莴苣所在的菊科植物的叶绿体基因组序列也鲜有报导，所以为获得上述片段，根据烟草及拟南芥的叶绿体基因组序列设计引物来扩增莴苣叶绿体基因组的DNA，经多个引物组合的PCR扩增，发现根据烟草序列设计的两对引物可成功地扩增出莴苣叶绿体DNA片段。这两段扩增片段拼接后包含了一段连续的莴苣叶绿体基因组DNA序列，即包含trnH和psbA基因的全序列，还包含了基因trnK、rpl2和MatK的部分序列，其全长为3839bp序列。

本发明所描述的同源重组片段是根据SEQ ID NO：1所示序列重新设计引物扩增得到的。该序列中适于作外源DNA片段定点插入的位置是莴苣叶绿体基因组中trnH与psbA基因之间及trnK与psbA之间。由于psbA与trnk基因有可能存在共同转录，所以本发明重点推选trnH与psbA基因间作为外源DNA片段定点插入位置。根据此位点在本发明中提供了相应定位片段：

同源重组片段1：包括莴苣叶绿体基因psbA、trnK和MatK部分片段，序列编号为SEQ ID NO：2；应用时可根据情况在保留其3’端情况下，切除5’端部分片段以便降低分子克隆的操作难度，但为保证同源重组的作用，这一片段在利用时应尽可能大于1000个碱基对。

同源重组片段2：trnH和rpl2部分DNA片段，序列编号为SEQ IDNO：3；该片段还包含了psbA基因的终止序列，但不包括翻译终止密码子。该片段在利用时应接在需要表达的外源基因3’端，以便提供终止序列。同上为克隆及载体构建的方便，可根据情况在保留其SEQ ID NO：3所示序列片段的5’端情况下，即保留片段上psbA的终止子一端，切除3，端部分片段，但为保证同源重组的作用，这一片段在利用时应尽可能大于1000个碱基对。

本发明所述的莴苣叶绿体基因组定点转化表达载体是在普通的克隆质粒基础上构建的，为方便进行载体的构建工作，最好选用较小的克隆质粒进行载体构建，如pUC18/19、pUC118/119或SK系列质粒。本发明所述的莴苣叶绿体基因组定点转化表达载体的特征是含有本发明提供的莴苣叶绿体DNA片段，如利用具有SEQ ID NO：2所示序列，或者包括SEQ ID NO：2所示序列3’端的不小于1kb的片段，利用具有SEQ ID NO：3所示序列的片段，或者包括SEQ ID NO：2所示序列5’端的不小于1kb的片段。这些片段通过DNA重组技术插入到克隆载体的多克隆位点，为达到同源重组，SEQ ID NO：2所示序列的5’端、SEQ ID NO：3所示序列的3’端应与载体质粒相连，而用于转化的外源DNA片段则通过DNA重组方式插入到这两片段之间，即外源DNA片段两端分别与SEQ IDNO：2所示序列的3’端和SEQ ID NO：3所示序列的5’端相连。

外源DNA片段上可包括一个或数个基因或基因片段，为能在叶绿体中表达，它们应具带有叶绿体启动功能的启动子和终止子，需要指出的是SEQ ID NO：3所示序列片段的5’端为莴苣叶绿体基因psbA的终止子，所以靠近SEQ ID NO：3所示序列片段的外源基因的3’端可直接与片段2相连，由SEQ ID NO：3所示序列片段的5端的psbA终止子提供相应的终止序列。

本发明的莴苣叶绿体转化植株是指利用基因枪法或其它直接导入方法，将含有本发明的莴苣叶绿体同源重组片段的载体导入莴苣叶绿体中，通过同源重组，将带有外源基因的外源DNA片段定点插入到莴苣叶绿体基因组中，特别是基因psbA的trnH之间，虽然该载体利用的是莴苣叶绿体DNA的同源片段，但仍可用于亲缘关系较近其它的菊科植物。

在导入的外源DNA片段上可以包括任意目的基因，是尤其是工业及医药用蛋白基因，如酶、药用蛋白及疫苗的基因片段等，这样可以将莴苣作为一个新型的生物反应器生产上述物质，由于莴苣可以生食，所以对表达上述基因产物的莴苣在应用上有巨大优势。

附图简要说明

图1(A)和(B)表示含有本发明的同源重组片段的莴苣叶绿体DNA片段(SEQ ID NO：1)。其中，序列1-692为莴苣叶绿体MatK基因编码区(字母大写)；

序列809-843为莴苣叶绿体trnk基因编码区(字母大写)；序列1069-2130为莴苣叶绿体psbA基因编码区(字母大写)；序列2521-2595为莴苣叶绿体trnH基因编码区(字母大写)；序列2714-3158为莴苣叶绿体rpl2基因外显子编码区(字母大写)；序列3825-3839为莴苣叶绿体rpl2基因部分外显子编码区(字母大写)；以上序列中字母小写的区域为基因编码区外序列。

图2表示本发明的同源重组片段1的序列(SEQ ID NO：2)。

图3表示本发明的同源重组片段2的序列(SEQ ID NO：3)。

图4表示莴苣叶绿体基因组定点转化表达载体质粒图。其中，带阴影的片段为本发明中提到的莴苣叶绿体DNA的同源重组片段。

下文将通过实施例对本发明做进一步说明

实施例1

莴苣叶绿体psbA及其附近片段的获得

1)采用高离子强度、低pH方法提取油菜叶绿体DNA。

取5g莴苣的幼嫩叶片，加入40ml 4℃预冷的Buffer A(25mM EDTA，1.25M NaCl，0.25M抗坏血酸，pH3.6)，高速匀浆数次，至成糊状。浆液用4层医用纱布滤入4个50ml离心管中。4℃ 800g离心8min，弃上清，加入(以下均为每管加入的量)30ml预冷的Buffer B(50mM Tris.HCl，25mM EDTA，1.25M NaCl，10mM β-巯基乙醇，pH8.0)重悬叶绿体。4℃800g离心8min，回收叶绿体颗粒，弃上清，加入30ml预冷的BufferC(150mM NaCl，100mM EDTA，pH8.0)重悬沉淀。4℃1000g离心8min，回收叶绿体，弃上清，加入2ml Buffer D(50mM Tris.Cl，25mM EDTA，pH8.0)重悬沉淀，加入0.5ml 10％Sarcosyl(Buffer配制)和20μlProteinase K(10mg/ml)，于45℃轻摇4-6h。用等体积Tris饱和酚抽提数次，再用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1-2次，至界面干净。上清中加1/10体积3mmol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃过夜。4℃12000g离心15min，回收DNA，溶于500μl TE(pH8.0)中，加入5μl10mg/ml的RNase A，37℃保温1h。用酚、酚/氯仿抽提至界面干净，上清中加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h以上。4℃15000g离心20min，回收DNA。70％乙醇洗涤DNA，真空抽干，溶于50μl TE(pH8.0)放置于-20℃保存待用。

2)莴苣叶绿体DNA的PCR扩增和克隆

参照烟草叶绿体基因序列设计两对引物序列：

P11(118)：ATGCCCTACCTTTGAGTGC

P12(119)：TCCATACCAAGGTTAGCAC

P22(120)：ACTGCTTTAGGTATCAGC

P21(121)：GGGCTATCTTTCAAGTGT

以莴苣叶绿体DNA为模板，分别利用上述两对引物进行扩增，反应体系为50μl：其中dNTPs 100μM，引物各60ng，叶绿体DNA为50-100ng，高保真DNA聚合酶1.25U

PCR扩增程序为：95℃预变性5min→95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸2.5min，共30个循环-72℃延伸10min。

3)扩增片段的克隆及测序列

扩增产物经琼脂糖胶电泳确定，利用引物118和119扩增的产物大小约为1.9kb，利用引物120和121扩增的产物大小约为2.1kb，利用玻璃奶纯化试剂盒对扩增产物的电泳带进行回收，由于是高保真pfu酶扩增的产物，可以直接连接于可产生平端的EcoRV酶酶切的克隆质粒pBluescriptSK上，或将回收产物利用Taq酶和dATP加A尾后，连接于T载体上(按Promage的T载体说明书)，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。对LB(Amp 100mg/L)平板上长出的菌落，提取转化子质粒进行电泳确定。对获得的莴苣叶绿体DNA片段的进行测序。每个克隆分析至少进行了两次独立的测序。序列结果通过NCBI BLAST与已知的其它植物叶绿体DNA序列进行同源性比较，并确定片段上的基因序列情况。

实施例2

莴苣叶绿体DNA同源片段分离及克隆

本实施例中提供的方法是分离发明中提供的两同源重组片段的方法，但并不影响利用本发明提供的序列分离序列上其它可用于重组的DNA片段。

1)叶绿体DNA的提取与纯化：同上

2)叶绿体同源片段的PCR扩增：

根据SEQ ID NO：1的序列设计两个引物，

P11(118)：ATGCCCTACCTTTGAGTGC

P12(PVI)：GGAGTCGACTTTGGTCTTATTGTAATTGTATAGG

P21(121)：GGGCTATCTTTCAAGTGT

P22(VII)：GTGGATCCTTGGGAAAAGAATATATAAACCTC

以莴苣叶绿体DNA为模板，用引物P11和引物P12扩增本发明中SEQ ID NO：3所示序列的片段，即包含莴苣叶绿体基因的rpl2、trnH基因的片段，用引物P21和引物P22扩增SEQ ID NO：2所示序列的片段，即包含莴苣叶绿体基因psbA、rnK和MutK基因的片段。扩增过程中均使用高保真度Pfu DNA聚合酶。

以莴苣叶绿体DNA为模板，分别利用上述两对引物进行扩增，反应体系为50μl：其中dNTPs 100μM，引物各60ng，叶绿体DNA为50-100ng，高保真DNA聚合酶1.25U

PCR扩增程序为：95℃预变性5min→95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸2.5min，共30个循环→72℃延伸10min。

SEQ ID NO：2所示序列的片段利用PstI和BamHI酶切，酶切产物经琼脂糖电泳，切下约1kb片段(实际上是1030bp)，利用玻璃奶DNA回收试剂盒回收片段，回收产物连接于用样酶酶切SK质粒上，得到的质粒为pCTHF1；

扩增得到的SEQ ID NO：3所示序列的DNA片段经HindIII和SalI酶切，酶切产物经琼脂糖电泳，切下约1kb片段(实际上是1087bp)，利用玻璃奶DNA回收试剂盒回收片段，回收产物连接于用样酶酶切处理的pUC18质粒上，即得到含同源片段2的中间质粒pCTHF2；

实施例3

利用本发明提供的莴苣叶绿体DNA序列构建莴苣叶绿体定点转化表达载体-绿色荧光蛋白(GFP)基因的莴苣叶绿体定点转化表达载体的构建。

本实施例是在普通克隆载体pUC-18基础上进行的，选择它的原因是该质粒较小，易于操作，但这不影响利用其它载体质粒如pBluescriptSK质粒。

1)首先将同源重组片段1从质粒pLCTF-1上用EcoRI和BamHI酶切切下，酶切产物经琼脂糖电泳，切下约1kb片段，利用玻璃奶DNA回收试剂盒回收片段，回收产物连接于用样酶酶切的pLCTF-2上，获得质粒pLCTH-A。

2)用BamHI和SalI将莴苣叶绿体基因psbA启动子和GFP基因从pSR21上切下，酶切产物经琼脂糖电泳，切下约0.9kb片段，利用玻璃奶DNA回收试剂盒回收片段，回收产物连接于用样酶酶切的pLCTH-A上，即得到得到带有标记基因GFP的叶绿体转化表达载体质粒pLCTHA-G。利用荧光显微镜在兰光激发下观察，发现转化子菌体发出绿色荧光，而没有导入GFP基因的含质粒pLCTH-A的DH5á菌体及无质粒的DH5á菌体在兰光激发没有绿色荧光发出。

3)用BamHI切割质粒pSZB8，得到筛选标记基因aadA的表达盒(Prrn-aadA-psbA3’)，此表达盒片段经琼脂糖电泳，切下1.3kb片段，利用玻璃奶DNA回收试剂盒回收片段，回收产物连接于用样酶连接插入到经同样酶切的pLCTHA-G上，转化DH5α感受态细菌，取100微升转化的菌源在含壮观霉素(100毫克/升)的LB培养基上涂布，37℃16小时后，长出转化子菌落，挑取菌落于3毫升含壮观霉素(100毫克/升)LB液体培养基进行培养、提取质粒，对质粒用BamHI酶切，经电泳确认所得的转化子插入了筛选标记基因的叶绿体表达盒片段，从而得到最终的载体质粒pLCTA(aadA/GFP)。

由于该载体上的标记GFP基因和筛选标记基因aadA是在两莴苣叶绿体同源重组DNA片段之间，所以借助基因枪等手段将其导入莴苣叶绿体中后，即可通过莴苣叶绿体同源片段与叶绿体上相应片段发生同源重组方式，将GFP及aadA基因插入到叶绿体基因组上这两个片段间，即导入到叶绿体基因组基因trnH和基因psbA之间，而且还不破坏原有叶绿体基因的功能。

实施例4

利用本发明提供的定点转化载体将绿色荧光蛋白(GFP)基因的导入莴苣叶绿体基因组中

1)载体：含GFP基因的莴苣叶绿体定点转化表达载体pLCTA(aadA/GFP)

2)转化受体材料：奶油生菜叶片。用5％的次氯酸钠溶液浸10分钟，再用无菌水洗三次，用镊子撕成1厘米见方大小的叶片，放于MS培养基上以备下一步使用。

3)基因转化：采用基因枪的方法转化莴苣的叶片。首先大量制备高质量的质粒DNA，制备方法为常规方法(见《分子克隆》)，质粒DNA稀释到1μg/μl，以备转化之用。然后按常规方法制备微粒子弹，用Bio-RadPDS-1000/He基因枪对高渗处理4小时的莴苣叶片轰击，再高渗处理16小时，之后转入分化培养基培养2天，再转入含壮观霉素的筛选培养上进行分化和筛选。在筛选培养基上的叶片组织块经过约一个月的培养，大多数叶片发白死去；极度少数能分化出绿色的芽点。继续培养并诱导芽伸长。将芽转化生根培养基，生根，得到完整转化植株。

4)转化体鉴定：

GFP荧光鉴定：用长波紫外灯照射所得到的绿苗，透过绿光滤光片观察能发出绿色荧光的为转基因个体。

PCR扩增鉴定：利用转化载体上叶绿体基因组同源重组片段外的序列引物和转化载体上外源基因即GFP上引物进行PCR扩增，若扩增得到片段，证明外源基因GFP的确是插入到叶绿体基因组中。这里应用的引物序列为：ATGCCCTACCTTTGAGTGC  (见前文中的P11引物)和AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC(GFP基因的5’端)。利用此对引物对转化植株的DNA进行PCR扩增，若扩增得到约2.4kb大小的片段，即表明GFP基因已转化并插入到叶绿体基因组psbA和trnH之间。

5)同质化：

取分子生物学方法证实的转基因植株的叶片进行再分化方法获得同质化的纯合体，在含壮观霉素的筛选培养上筛选培养并诱导芽产生，获得再生的绿苗，接着再取第二次筛选获得的转基因植株(T1代)的叶片进行叶片再生，在筛选培养基上筛选约3个月，获得再生的绿苗。共筛选了四代。经这几轮筛选后转化植株所有叶绿体的基因组上都插入有外源基因，即达到同质化。同质化鉴定可以通过PCR方法，采用根据转化载体同源片段以外叶绿体DNA的序列设计引物进行扩增，若叶绿体基因组中插入位点插入外源基因，由扩增出增大的片段。这里应用的引物序列为：TAAAGCCTTCAATGGTACGCAGTC和CGACGAAACCTAGAAATCGATCACTG(分别来自于SEQ ID NO：1序列上的24-48、3748-3772碱基序列)，扩增体系采用适合于长片段扩增的PCR体系。由于头几次再生得到的转化植株中叶绿体有大量的未转化的DNA分子，所以利用上述引物扩增的检测会发现明亮的3.7kb大小的片段，即在转化体叶绿体的psbA和trnH之间没有外源DNA片段的插入。另外还将扩增得到一个较弱的约6kb大小的片段，这是由于转化的叶绿体基因组中psbA和trnH基因间有一个约2.4kb的外源DNA片段的插入，这种情况表明虽然外源基因已插入到叶绿体基因组中，但仍有大量叶绿体的DNA没有被转化，即仍未达到同质化。若扩增只检测到约6.1kb大小的片段才会表明所有叶绿体的DNA都插入了外源基因片段。