在水性溶剂中贮存蛋白质期间稳定复杂混合物中的蛋白质的方法

摘要

本发明涉及一种在水性溶剂中贮存蛋白质的方法。半胱氨酸的添加延缓了蛋白质活性浓度的降低。该方法适用于在微生物中生产蛋白质。

说明书

本发明涉及在水性溶剂中贮存蛋白质的方法。

蛋白质的SH基或其它氧化敏感性结构的化合态通常对蛋白质的同一性、活性或有效浓度有影响。同一性指蛋白质各自的折叠。活性应当被理解为表示酶活性。蛋白质的有效浓度应当是蛋白质在溶液中所占的比例，它关于生物体内功能正确地折叠。

从文献中得知，通过硫醇试剂(例如2-巯基乙醇或半胱氨酸)的使用可抑制蛋白质的结构修饰氧化作用。

例如，可通过硫醇稳定D-氨基酸氧化酶(DAO)。黄素蛋白DAO催化D-氨基酸的立体有则脱氨基作用而生成相应的α-酮酸和铵[P.Golini等人，酶和微生物技术(Enzyme and Microbial Technology)，17，1995，324～329]。然而，硫醇(例如半胱氨酸)的添加也能降低蛋白质的活性。这种作用也可通过半胱氨酸基的存在来解释。这种情况的一个例子是酰化氨基酸水解酶。酰化氨基酸水解酶是一种每个亚基带有一个Zn2+原子的二聚酶。该酶的每个亚基包含2个半胱氨酸SH基和2个二硫键。SH基的化学修饰(如二硫键的断裂)可导致酶失活。可以证实：通过添加2-巯基乙醇，使酰化氨基酸水解酶的活性降低；然而，通过透析或凝胶过滤除去2-巯基乙醇后，最初的酶活性几乎可完全恢复[W.Krdel和F.Schneider，生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta)445，1976，446～457]。

对半胱氨酸和一些衍生物来说，某些制剂形式和具体应用有可能在一定程度上阐明抗细菌、抗病毒或抗真菌的活性。因此，例如，可以证实：半胱氨酸的添加在一定程度上适合作为抗食物的腐败的保护剂(US 4937085 A)。

采用基因工程方法，有可能在基因修饰微生物[例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)这种细菌]中合成重组蛋白质，例如胰岛素或其前体，还有胰岛素衍生物[它们具有与衍生基因序列(例如人类)不同的氨基酸组成]。

应用表达载体可在微生物中进行重组合成。这些表达载体由载体质粒组成，它们应当包含一条复制所述质粒的控制序列与一个选择基因(尤其是抗生素抗性基因、代谢标记)，其中，在启动子的控制下所述基因中被插入目的蛋白质(例如胰岛素)的基因编码区，所述启动子在选定的微生物中是有活性的(例如，对大肠埃希氏菌来说，是lac启动子)。

一种在基因修饰微生物的协同作用下生产重组蛋白质(例如，尤其是胰岛素；胰岛素衍生物)的方法包括一系列操作步骤，它们彼此相互配合而且必须彼此相互协作。

例如，一种在大肠埃希氏菌中生产人胰岛素的方法可由以下操作步骤来构成。

微生物的发酵-细胞分离-细胞破裂-融合蛋白的分离和中间贮存，半胱氨酸重折叠入暴露二硫桥的天然立体结构中，随后分离不含有用物质的异种蛋白-酶促裂解成精氨酰胰岛素-蛋白质水溶液的初步纯化-第一次层析纯化-酶促裂解成人胰岛素-第二次层析纯化-通过HPLC高度提纯-重结晶-干燥。

采取的大量单独措施通常导致总产率较大的损失，由于在每一步中，选定的操作步骤中的特定产率的损失是不可避免的。

通过优化中间步骤可提高总产率。这样的方法意义相当大，目的在于，可望更经济地利用所应用的资源和减小环境污染。

例如，EP0906918描述了一种改良方法，该方法被用来生产胰岛素的前体或胰岛素衍生物，它们具有在半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐和一种离液助剂存在下正确连接的胱氨酸桥。

胰岛素衍生物是天然胰岛素(即人胰岛素和动物胰岛素)的衍生物。这些胰岛素衍生物与其它相同的天然胰岛素不同之处在于，所述胰岛素衍生物中不存在该天然胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基和/或该天然胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基被另一个基因可编码的氨基酸残基置换了和/或添加了至少一个基因可编码的氨基酸残基。

在蛋白质的贮存过程中，经常发生有效浓度的降低。

由于各种各样的原因，在各步操作之间有必要贮存生产的产品。例如，可能有这种情况，为了接受前面操作步骤中的总量产品，而后续的工业深加工步骤加工能力不足。

中间贮存所需的时间可能长短不一。由于生产能力、协作工业单元的需要、需要输送更多化学品或附件或者其它原因，必要的中间贮存时间可能长达几个星期。

如果从各操作步骤中得到的产品在深加工之前，产品所不可避免的中间贮存过程中出现的活性蛋白质的损失可保持在尽可能严格的范围内，就开辟了一条提高产率的有效途径。

迄今未描述的是半胱氨酸或衍生物的应用，即，用于在从工业生产方法的各操作步骤中得到的不同组成和状态形式的产品(包含生物成分，例如，酶催化剂或基因修饰微生物的参与)的中间贮存过程中控制活性蛋白质的产率损失。这些方法例如可用于胰岛素的制备中。

根据操作步骤而定，需要中间贮存的产品尤其可能包含不同量具有生物性质的复杂大分子(蛋白质、DNA、脂肪)，微生物，缓冲物质和原料。

就从胰岛素生产胰岛素来说，通常，生产工艺旨在制备一种尽可能均一的物质。如果生成的产品必须进行中间贮存，就蛋白质(例如胰岛素)的制备来说，经常会出现该蛋白质有效浓度的损失。

蛋白质的贮存应理解为蛋白质的任何贮存，不管蛋白质存在的容量多少和进行贮存的时间长短，或者进行贮存时的温度条件如何。蛋白质的贮存一般在水溶液中进行。

除了下列组分之外，即，培养规定形式微生物的营养培养基或完全培养基(具体包含碳源或氮源，氨基酸和无机盐和痕量元素，还有不同化学缓冲剂类别的缓冲成分，以及生物源的大分子(例如DNA或脂肪)，蛋白质的水溶液另外还可能包含有机或无机化合物，例如，十二烷基硫酸钠或乙酸钾，还有不同次序的溶剂比例，例如，甲醇或石油醚。

本发明涉及一种在水性溶剂中贮存蛋白质的方法，它包括，通过将半胱氨酸加入水性溶剂中而延缓蛋白质有效浓度的暂时减少。

该方法适合在蛋白质在水溶液中的贮存过程中减缓蛋白质有效浓度暂时降低的稳定化。该方法例如可用于通过微生物的蛋白质生产。适合的微生物实例尤其是细菌(例如大肠埃希氏菌)，酵母[尤其如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(PichiaPastoris)]，还有昆虫细胞。在优选的实施方案中，可应用关于所述蛋白质的诱导表达或组成型表达的表达载体构建物来转化这些微生物。培养这些微生物，而在蛋白质合成后破裂它们。合适的破裂方法主要是所有适于从细菌中释放蛋白质的方法。适用的破裂方法例如有：超声波，使用乙酸钾、十二烷基硫酸钠或溶菌酶的化学法，微生物的加热或者弗氏压碎器。如果要制备的蛋白质被直接分泌入培养基中，就可省去微生物的破裂。原则上，所述方法还适用于挤出的蛋白质。

当微生物被破坏或将蛋白质直接挤出到培养基中时，得到的复杂蛋白质混合物通常在水溶液中。这些蛋白质可溶于其中或以悬浮形式存在。优选将这些蛋白质溶液贮存在0℃～50℃之间或者5℃～30℃之间或者贮存在5℃。为了延迟失活，将半胱氨酸加到该蛋白质混合物中。半胱氨酸在蛋白质混合物中的浓度可在100～500mM之间或者150～220mM之间。优选的添加量是170mM。这样，复杂分子溶液中的蛋白质可贮存几个星期而有效蛋白质浓度仅仅稍微降低。这种方法可用于合成异源蛋白质，特别是在微生物中合成，在它们破裂后接着纯化和可能的复性，优选用于制备胰岛素及其前体。

用于本发明方法中的贮存的蛋白质优选是胰岛素或胰岛素衍生物。

本发明进一步涉及一种制备异源蛋白质的方法，它包括，在转化微生物中表达异源蛋白质或其前体，接着通过本发明的方法贮存所述异源蛋白质。然后，任选将该异源蛋白质或其前体复性，纯化前导序列或者加工，最后，在纯化和分离之后制备而给出所需的产品。合适的异源蛋白质优选是胰岛素或胰岛素衍生物和胰岛素前体。

实施例：

在制备胰岛素的方法的实施中发现了，通过将半胱氨酸加到融合蛋白中，产品在贮存数月后仍保持稳定。相比之下，未经处理的产品仅仅几天后其某些活性就不可逆地降低了。

在如下实施例中应用了人胰岛素和胰岛素衍生物的前体分子。在EP 906 918中通过序列方案公开了结构和氨基酸序列。人胰岛素的前体具有天然人胰岛素的序列。胰岛素衍生物的前体包含A链21位上的甘氨酸(而不是精氨酸)以及B链C末端31和32位上两个精氨酸分子。

根据EP 0 489 780和EP 0 906 918，通过基因修饰大肠埃希氏菌细胞的发酵可制备胰岛素的融合蛋白。这里可得到一种蛋白质的悬浮液，它包含大约20～25％的干物质和40～50％的可折叠胰岛素。

试图通过半胱氨酸使蛋白质稳定化，在20分钟剧烈搅拌过程中，将75kg半胱氨酸盐酸盐×H₂O引入约2500kg该蛋白质悬浮液(相应于一个发酵批次)中。在此过程中，pH从7.0降至2.5。悬浮液从pH为5左右变得很稠到pH为4左右时又变得很容易搅拌。在这些实验条件下，在蛋白质悬浮液中形成了半胱氨酸盐酸盐的浓度为170mM。接着，将该蛋白质悬浮液搅拌60分钟，此后，不需要进一步搅拌可保持它直到完成。实施例1：

为了通过试验证实半胱氨酸的防腐作用，进行了如下实验室试验：

将按EP 906 918制备的人胰岛素的融合蛋白和胰岛素衍生物的融合蛋白在5℃和室温下(当含有或不含半胱氨酸时)贮存达2个月。在试验过程中，从批料中取等分样。通过还原折叠(EP 906 918)将融合蛋白转变为人胰岛素的前原(prepro)形式或胰岛素衍生物的前原形式。往批料中添加形成折叠所需量的半胱氨酸，所述批料已在开始折叠约1小时前被贮存了(不存在半胱氨酸盐酸盐一水合物)。在其它批料(它们包含以防腐剂形式存在的半胱氨酸)中，就没必要这样。

通过HPLC测定了上述反应给出的人胰岛素的前原形式或胰岛素衍生物的前原形式。

HPLC分析：

在95℃下将0.5g蛋白质溶于40毫升含下列组分的溶液达2分钟：6M盐酸胍、50mM tris，pH8.5mM 乙二胺四乙酸盐(EDTA)、1％ 2-巯基乙醇和10mM二硫苏糖醇，接着，在14,000g下离心20min。将0.02ml清亮的上清液加到高压液相层析柱上。

柱：Nucleogel RP 300-5/46(Macherey & Nagel，Aachen，Germany)

梯度：缓冲液A：0.1％三氟乙酸(TFA)

      缓冲液B：0.09％TFA于乙腈中

温度：55℃

总的流动时间：40min。

在相应的流动时间之后由下列量缓冲液B确定梯度：10min 25％，12min 60％，13min 90％，15min 100％。

流量：1ml/min

检测：215nm

实验结果

表1：在5℃贮存人胰岛素的融合蛋白，折叠后的有用物质(mg/l)(有用物质指折叠的人胰岛素)

第1天 1周 2周 4周 8周有半胱氨酸850 831 867 845 825无半胱氨酸879 827 790 712 625表2：在室温下贮存人胰岛素的融合蛋白，折叠后的有用物质(mg/l)第1天 1周 2周 4周 8周有半胱氨酸792 817 800 785 790无半胱氨酸812 654 312 ％* ％**因为有严重的腐败过程，应用是不可能的。表3：在5℃下贮存胰岛素衍生物的融合蛋白，折叠后的有用物质(mg/l)(有用物质指折叠的胰岛素衍生物)第1天 1周 2周 4周 8周有半胱氨酸590 553 540 573 552无半胱氨酸612 580 549 518 404表4：胰岛素衍生物的融合蛋白在室温下贮存，折叠后的有用物质(mg/l)第1天 1周 2周 4周 8周有半胱氨酸643 667 680 649 653无半胱氨酸597 547 420 271 ％**因为有严重的腐败过程，应用是不可能的。

通过添加半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐，贮存时间有可能长达两个月，而没有明显的活性损失。