N－葡萄糖基－N－二硫代羧酸－L－氨基酸钠盐在铂驱排中的应用

摘要

本发明涉及下面通式的化合物在含铂化疗药物治疗肿瘤时作为缓解铂毒性的解毒剂的应用:其中R选自H、CH3、CH2C6H5、CH(OH)CH3和CH2SH。

说明书

发明领域

本发明涉及N-葡萄糖基-N-二硫代羧酸-L-氨基酸钠盐在铂驱排中的应用。

技术领域

顺铂是临床公认的优秀抗肿瘤药物之一，对头颈部和生殖系统的肿瘤具有独特疗效，显示疗效好、完全缓解率和见效快三大特点。与其它抗肿瘤药物一样，顺铂也显示明确的毒性，例如对肾脏、胃肠道、骨髓、神经和耳均有毒性作用。其中以肾脏毒性最甚。初疗程，患者肾损伤的发生率即可高达33％。多疗程可高达75％(Lippman AJ，Helson C，and Helson L，et al，Clinical trails of ciso diamminedichloroplatinum，CancerChemother Rep，1973，57，191-200；Stark JJ，and Howell SB，Nepherotoxicity of cisplatumn(II)dichlodoiamine，clin pharmacolTher，1978，23(4)，461-465)。顺铂在临床的常用剂量一般是一个疗程50-100mg/m²bsa.，为了减轻副作用，兼用水化和甘露醇利尿措施。即使如此，仍有大约20％的患者会产生程度不等的肾功能损害。顺铂的毒性严重地限制了它在临床上的应用范围。(Powis G，and Hacker MP，The Toxicityof anticancer drugs，Bergman Press，New York，1990，82-105；Ueda H，Sugijama K，and Yokota M，et al，Reduction of cisplatino toxicity andlethality and lethality by sodium malate in mice，Biol Phamm Bull，1998，21(1)，34-43)。顺铂的肾脏毒性主要表现为急慢性肾功能衰竭、多尿、低渗尿和电解质紊乱，等等。大鼠类动物由顺铂造成的肾损伤主要部位为近端小管S₃段。人由顺铂造成的肾损伤主要部位是在远端小管(Doyen DC，Levi J，and Jacobs C，et al，Mechanism of cisplatin nephorotoxicity：II.morphologic observations，J.Pharmacol.Ther. 1980，213(3)，551-556)。为了克服顺铂的毒性，扩大顺铂在肿瘤化疗的应用范围，探索了各种解毒措施。例如大量输注生理盐水或甘露醇利尿，输注高渗盐水，使用STS，GSH，WR-2721，丙磺舒和DDTC等化学保护剂(Lithest CL，Alteration in the toxicity of cis-di-chlorodiammine platinum as afunction of NaCl concentration in the vehicle of administration，Toxicol Apple Pharmacology，1981，61，99-108；Ozols RE，Cordon BJ，andJacob J，et al，High-dose cisplatin in hyper-tonic saline，Ann InterMed，1984，100，19-24；Howell SB，Pfeifle CE and Wung WE，et al，Iateraperitoneal cis-diainmine dichloroplatinum with sys-temic thiosulfuteprotection，Cancer Res，1983，43，1426-1431；Plaxe S，Fredolo J andKim S.et al，Phase I trial of cisplatin in combination withglatathione，Gynecol Oncol，1994，55，82-86；Ramnath N，LoRusso P，and Simon M，et al，Phase II evaluation of cisplatin and WR-2721 forrefractory metasfatic breast cancer，Am J Clin Oncol，1997，20(4)，368-372；Jacobs C，Kaubisch S，Halsey J，et al，The use of probenecidas a chemo protector against cisplatin nephrotoxicity，Cancer，1991，67，1518-1524；Gandara DR，Naches WA，and Adel Son MD，et al，Randomized placebo-controlled multimember evaluation ofdiethyldithiocarbamate for chemo protection against ciplatin inducedtoxicities，J Clin Oncol，1995，13(2)，490-496)。这些措施几乎于事无补。寻找有效的顺铂解毒剂一直是肿瘤化疗药物研究的兴趣之一。

本发明的目的提供下式的N-葡萄糖基-N-二硫代羧基-L-氨基酸钠盐作为含铂化疗药物，尤其顺铂的解毒剂的应用。

其中R选自H、CH₃、CH₂C₆H₅、CH(OH)CH₃和CH₂SH。

该类化合物的制备方法公开在彭师奇、王超、赵明等的中国专利ZL951063413(驱镉药物及它们的合成方法和应用)以及Wang Chao，Peng ShiQi等，synthesis of Novel Chelating Agents and Their effect of CadmiumDecorproation，Chem，Res Toxicol，1999，12(4)，331-334中，在该专利中同时公开了该类化合物作为驱镉药物的应用。

本发明针对顺铂的严重肾毒性以及通式所示的化合物对重金属中毒的缓解作用，采用协同用药方案，探索通式所示的化合物在肿瘤化疗中的应用。

本发明对肿瘤接种24小时后的小鼠进行顺铂治疗，给药后第二天即可引起血尿素、血肌酐、肌酐清除率、尿钠排泄，以及尿渗透压明显改变，其中尿钠排泄、肌酐清除率和血尿素氮的改变与对照组呈非常显著差异(P＜0.001)。顺铂治疗四天后，肾损害最明显，可观察到血尿素氮、血肌酐和尿蛋白排泄大幅度上升并达到峰值；尿钠排泄、尿渗透压和肌酐清除率大幅度降低。这些指标与对照组呈非常显著性差异(P＜0.01至0.001)。顺铂治疗6天后，肾损害症状减轻，血尿素氮、血肌酐和尿蛋白排泄回落，肌酐清除率稍稍恢复，尿钠排泄和尿渗透压仍保持低水平。顺铂治疗8天后肾功能开始恢复，尿蛋白排泄、尿钠排泄和肌酐清除率恢复至正常水平，血尿素氮和肌酐清除率与正常值相比仍有显著性差异(P＜0.01至0.001)，尿渗透压仍保持非常低的水平。

本发明发现，在顺铂治疗肿瘤接种小鼠的同时给予本发明所述的通式化合物，四天后不出现肾损伤。若在顺铂治疗肿瘤接种小鼠24小时后再用本发明所述的通式化合物处理，四天后可见一定程度的肾损害。本发明发现，同时用顺铂和本发明所述的通式化合物治疗肿瘤接种小鼠，以及用顺铂治疗肿瘤接种小鼠24小时后再用本发明所述的通式化合物处理，都有明显的治疗作用，本发明所述通式化合物不影响顺铂的疗效。

为了阐明本发明，下面用实施例详细解释本发明的技术关键，应当指出的是，这些实施例完全是例证性的，它们对本发明没有任何意义的限制。

实施方式

实验一 肿瘤治疗试验

一、肿瘤接种

(1)超净台用紫外线灯照射20分钟；

(2)将已灭菌的试管、吸管、剪刀、镊子、酒精灯及灭菌生理盐水置于超净台内；

(3)取腹腔接种S₁₈₀腹水瘤第八天的昆明种小鼠一只，脱颈椎处死，用75％酒精消毒后置于超净台内，用小镊子夹起腹部中线偏右的皮肤并用小剪刀剪一小口至可见乳白色腹水流出。将吸管由开口处轻轻插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水加到装有约3ml灭菌生理盐水的20ml的试管中，使体积增至约10ml。用吸管轻轻吹气，使腹水与生理盐水混匀。试管加盖，1000转/分离心5分钟。弃去上清液后，加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀浮起，试管加盖，1000转/分离心5分钟，弃去上清液。试管底部有的乳白色的胶状物。腹水中若混有血液，离心后上清液里会出现一条红色竖线，可用吸管轻轻吸出弃去。

(4)往试管底部的乳白色胶状物中加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀浮起。取100ul该悬浮液加至9.9ml灭菌生理盐水中，混匀，得100倍稀释液，混匀，加盖，放入冰中待用。

(5)取100ul上面的瘤细胞稀释液置入Eppendoff小管中，加100ul台盼兰染液，混匀。取少许该混匀液加至计数板的计数池内，于显微镜下计算4个大格中被染上蓝色的存活瘤细胞的个数。按下式计算原液中的存活瘤细胞数：

(6)将原液中的存活瘤细胞稀释成2.0×10⁷个/ml，用于接种。

(7)在无菌条件下用1ml腹水瘤细胞接种液，用2％碘酒棉球和75％酒精棉球在昆明种小鼠右侧腹下消毒。并注入0.2ml瘤细胞液，缓缓抽出针头。按此方法给每批40只昆明种小鼠接种，随机分为4组，放入动物室饲养。

二、治疗剂配制

(1)顺铂注射液的配制：临用前在适宜的容器中将20mg顺铂粉剂与20ml灭菌生理盐水混合，使充分溶解，用注射器吸取10ml顺铂溶液，弃去。往容器中用注射器加入10ml灭菌生理盐水，将剩余的溶液稀释成浓度为0.5mg/ml的顺铂注射液。

(2)通式化合物注射液的配制：临用前准确称取其中R为CH₂SH的通式化合物的灭菌生理盐水，使溶解成浓度为8.44mg/ml的注射液。

三、肿瘤的治疗

肿瘤接种24小时后，各组小鼠分别进行处理。

(1)空白对照组：肿瘤接种昆明种小鼠的右侧腹腔和左侧腹腔各注射灭菌生理盐水10ml/kg.bw。

(2)顺铂治疗组：肿瘤接种昆明种小鼠的右侧腹腔注射顺铂注射液10ml/kg.bw，左侧腹腔注射灭菌生理盐水10ml/kg.bw。

(3)顺铂治疗同时通式化合物解毒组：肿瘤接种昆明种小鼠的右侧腹腔注射顺铂注射液10ml/kg.bw，左侧腹腔注射通式化合物注射液10ml/kg.bw。

(4)顺铂治疗24小时后通式化合物解毒组：肿瘤接种昆明种小鼠的右侧腹腔注射顺铂注射液10ml/kg.bw，24小时后左侧腹腔注射通式化合物注射液10ml/kg.bw。

各组小鼠正常饲养，15天后各组荷瘤小鼠处死，取瘤称重，按下式计算抑瘤率。

获得的数据以(x±sx)表示，组间用样本均数比较，t检验。所述肿瘤治疗实验重复2次。

结果见表1。

表1 通式化合物对顺铂治疗作用的影响*

实验No.空白对照组顺铂治疗组顺铂治疗同时通式化合物保护组顺铂治疗24小时后通式化合物保护组第一次实验接种小鼠瘤重    (g)1.10±0.44 0.54±0.18 0.59±0.016 0.64±0.18重复实验接种小鼠瘤重2.08±0.44 1.09±0.35 0.94±0.34 0.97±0.36第一次实验肿瘤生长抑制率  (％)  0.0  48.2 46.5 47.1重复实验肿瘤生长抑制率  0.0  47.6 54.8 53.4

*n均为10；所有组与空白对照组相比均有非常显著差异，P＜0.001，顺铂治疗并用通式化合物保护组与单纯顺铂治疗组相比没有显著差异，P＞0.05

表1的数据说明，顺铂可用有效地抑制接种S₁₈₀腹水瘤小鼠的肿瘤生长，与空白对照组相比，小鼠瘤重显示非常显著的差异(P＜0.001)。顺铂治疗的同时或24小时之后使用通式化合物辅助治疗，不会影响顺铂的疗效，小鼠瘤重不显示显著差异(P＞0.05)。

用本发明通式化合物的其它化合物进行同样的实验，取得了类似的结果。

实验二 顺铂对健康大鼠肾功能的损伤

(1)顺铂注射液的配制

临用前20mg顺铂数值剂用20ml灭菌生理盐水溶解，配制成浓度为1mg/ml的注射液待用。

(2)实验动物处置

80只体重250g左右的Wistar大鼠饲养1周适应环境后，随机分为8组，其中2-1，4-1，6-1和8-1组大鼠腹腔注射顺铂注射液6ml/kg.bw；2-2，4-2，6-2和8-2组大鼠腹腔注射灭菌生理盐水6ml/kg.bw。2-1和2-2组腹腔注射2天后处死，4-1和4-2组腹腔注射4天后处死，6-1和6-2组腹腔注射6天后处死，8-1和8-2组腹腔注射8天后处死。各组大鼠处死前均取6小时尿液。

各组大鼠取尿之后腹腔注射2％戊巴比妥纳(40ml/kg.bw)麻醉，开胸，用注射器直接刺入右心室内取约5ml血装入试管于4℃冰箱中放置待用。摘取肝和肾，剥除包膜及周围结缔组织，用去离子水冲洗4次后用滤纸吸干，称重，置-25℃冰箱待用。    

(3)尿样处置

收集到的尿样用ERMA Clnal折射仪测定尿渗透压，用Na⁺/K⁺/Cl^-分析仪测定尿钠，用考马斯亮兰(朱忠勇主编，实用医学检验学，人民军医出版社，北京，1992，940)测定尿蛋白，用饱和苦味酸法(湖南医学院第二附属检验科编，临床生经检验，湖南科学技术出版社，长沙，1983，417)。结果见表2。

表2 顺铂对健康大鼠尿液生化指标的影响

检测指标空白对照组/顺铂治疗组第0天第2天第4天第6天第8天尿钠排泄(umol/100g.h)37.0/37.040.0/23.930.0/19.839.5/13.60.0/48.3尿蛋白排泄(g/g.肌酐)1.2/1.22.0/2.821.9/6.32.5/2.61.8/2.2尿渗透压(mosm/L)1800.0/1800.01398.1/880.51125.4/716.41240.6/651.41130.6/780.1肌酐清除率(ml/min)0.73/0.730.87/0.480.82/0.220.83/0.341.02/0.85

(4)血样处置

收集到的血样于4℃冰箱放置4小时后2000转/分离心制备血清。得到的血清用全自动生化分析仪测定血清尿素氮和血清肌酐，结果见表3。

表3 顺铂对健康大鼠血液生化指标的影响

检测指标空白对照组/顺铂治疗组第0天第2天第4天第6天第8天血清尿素氮(mmol/L)8.0/8.05.3/9.26.0/43.95.9/15.34.0/14.0血清肌酐(umol/L)54.8/54.845.6/72.052.8/220.857.6/100.848.0/72.0

实验三 通式化合物对铂的健康大鼠肾操作伤的保护作用

(1)顺铂注射液按试验二的方法配制。

(2)通式化合物注射液的配制：临用前准确称取R为CH₂SH通式化合物适量，用灭菌生理盐水配成浓度为16.875mg/ml的溶液。

(3)10％甲醛溶液的配制：10ml甲醛用蒸馏水稀释至100ml，待用。

(4)动物处置：110只体重250g左右的Wister大鼠饲养1周，适度环境后随机分为11组，其中4-1和6-1组为空白对照组，左侧腹腔注射来灭菌生理盐水6m/Kg.bw；4-2组和6-2组左侧腹腔注射顺铂溶液6ml/Kg.bw；4-3组和6-3组左侧腹腔注射顺铂注射液6ml/Kg.bw后右侧腹腔立即注射通式化合物注射液6ml/Kg.bw；4-4组和6-4组左侧腹腔注射顺铂注射液6ml/Kg.bw 24小时后，右侧腹腔注射通式化合物注射液6ml/Kg.bw；4-5组和6-5组左侧腹腔注射顺铂注射液6ml/Kg.bw72小时后，右侧腹腔注射通式化合物注射液6ml/Kg.bw；4-6组左侧腹腔注射通式化合物注射液6ml/Kg.bw。4-1至4-6组4天后处死取样，6-1至6-5组6天后处死。

(5)样本采集：抽血后立即摘取右侧肾脏，冲洗干净后用不锈钢刀片切成1.0×0.2×0.5cm³的小块，置10％甲醛溶液中固定。

(6)病理切片按文献(邹万忠主编，肾脏病理与临床，湖南科学技术出版社，长沙，1993，4-13)制作。

(7)采集的样品按实施例4的操作检测，4天后处死取样的结果见表4-7。

表4、通式化合物对单次顺铂治疗治疗铂在组织蓄积(ug/g组织)的影响

组别血液中铂肝中铂肾中铂空白对照0.14±0.031.52±0.541.04±0.56顺铂治疗组0.34±0.18*4.01±1.24**11.92±0.34***顺铂与通式化合物同时治疗组0.18±0.135.44±0.52#***17.64±9.47***顺铂治疗24小时后用通式化合物0.08±0.09*5.36±1.11***10.71±0.95#***

*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01；***与空白对照组比较，P＜0.001；#与顺铂治疗组比较，P＜0.05

表5 顺铂治疗4天后通式化合物对铂致大鼠肾髓质区组织变化的影响

组织学变化空白对照组顺铂组顺铂与通式化合物同时治疗组顺铂治疗24小时后通式化合物治疗组顺铂治疗72小时后通式化合物治疗组通式化合物组细胞肿胀-+++++++++-胞浆亏损-++-++++-细胞致密性退化-++++++-水肿性退化-++++++-细胞核致密化-+++-+++-边界染色质-+++-+++++-小管扩大-+++-++++-腔中蛋白管型化-++++-++++++-腔表层表皮细胞-+++-++++-

-代表未观察到；+代表稍许；++代表中度；+++代表严重；++++代表很严重

表6、顺铂治疗4天后通式化合物对铂致血液中微量元素的影响

组别PFeCu ZnCaMg空白对照24.19±2.860.33±0.060.20±0.030.22±0.0617.29±0.754.63±0.43顺铂治疗组21.96±4.000.48±0.08**0.25±0.03*0.18±0.0716.63±1.966.52±0.84**顺铂与通式化合物同时治疗21.47±6.80.39±0.00.27±0.05*0.18±0.0516.84±1.893.79±0.29**###顺铂治疗24小时后通式化合物治疗25.84±3.480.64±0.40.34±0.05**##0.32±0.07*#18.85±0.755.49±0.66*通式化合物组28.96±2.77*0.47±0.12*0.21±0.010.24±0.0517.54±0.294.35±0.58**

*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01；#与顺铂组比较，P＜0.05；##与顺铂组比较，P＜0.01

表7 顺铂治疗4天后通式化合物对铂致肝微量元素(ug/g湿组织)的影响

组别CaMgFeCuZnMn空白对照35.57±4.35184.64±9.9841.45±9.983.28±0.6425.24±2.871.58±0.50顺铂治疗组31.52±4.03173.50±23.3053.27±7.88**3.12±0.3422.63±3.551.48±0.25顺铂与通式化合物同时治疗32.64±2.37179.08±10.0638.36±5.73.79±0.27**24.18±1.921.27±0.38顺铂治疗24小时后通式化合物治疗40.31±5.98*190.18±1 1.0751.993±13.74**3.71±0.6624.86±2.001.21±0.32通式化合物组38.36±8.99183.87±17.3340.39±23.844.15±0.43**24.05±3.251.82±0.17

*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01。

表7 顺铂治疗4天通式化合物对铂致肾微量元素(ug/g湿组织)的影向

组别CaMgFeCuZnMn空白对照51.44±2.12169.09±21.5227.20±3.473.54±0.316.73±1.900.71±0.13顺铂治疗组52.34±8.44109.53±15.75***26.76±4.092.80±0.35**19.36±4.140.68±0.10顺铂与通式化合物同时治疗52.21±2.25163.78±8.30###35.37±8.795.34±0.60***###20.48±1.10**0.98±0.26#顺铂治疗24小时后通式化合物治疗50.17±3.17141.98±7.73*##31.89±7.613.84±0.26###21.43±1.06**0.81±0.28通式化合物组51.37±1.78156.81±9.57###27.07±5.013.86±0.38###17.74±1.250.63±0.04

*与空白对照比较，P＜0.05；**与空白对照组比较P＜0.01；***与空白对照组比较P＜0.001。

从本实验的上述结果可以看出，本发明通式化合物可以减少铂在组织中的蓄积，促进铂从肾脏排出，降低铂对肾组织的毒性作用，从而验证了本发明通式化合物作为铂解毒剂的效果。