中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹PCR/RFLP分子鉴定方法及试剂盒

摘要

本发明涉及水产养殖中河蟹苗种和种蟹鉴定的技术领域,是一种用于鉴别中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹的PCR/RFLP分子鉴定方法及该方法所使用的试剂盒。鉴定方法包括聚合酶链反应、限制性酶切反应和电泳检测。试剂盒中包括一对聚合酶链反应引物、一种DNA限制性内切酶和标准图谱。本发明的优点在于:本发明可解决水产养殖中河蟹苗种和种蟹鉴定的难题,提供一种准确鉴别中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹的分子鉴定试剂盒。本发明对于从事河蟹养殖、蟹种培育部门快速、准确地鉴定河蟹苗种和种蟹是十分必要的。对于打击蟹苗引种中以南方合浦蟹苗充当中华绒螯蟹蟹苗的假冒伪劣行为,促进河蟹养殖业的发展是十分有效的。

说明书

本发明涉及水产养殖中河蟹苗种和种蟹鉴定的技术领域，是一种用于鉴别中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹的PCR/RFLP分子鉴定方法及该方法所使用的试剂盒。鉴定方法包括聚合酶链反应、限制性酶切反应和电泳检测。试剂盒中包括一对聚合酶链反应引物、一种DNA限制性内切酶和标准图谱。

中国大陆北起辽宁，南至福建沿海各水系的绒螯蟹是日本绒螯蟹(Eriocheir japonicus)的2个亚种：中华绒螯蟹(E.j.sinensis)和合浦绒螯蟹(E.j.hepuensis)。其中，分布于长江水系的中华绒螯蟹是中国的水产珍品，又名河蟹、大闸蟹、毛蟹，以其个体大、品质优，被誉为最具有发展前景的增养殖品种。在养殖中发现，采自不同水域的绒螯蟹生长差异显著，其生长速度受到外界环境条件的影响及内在遗传因素的制约，严重影响了生产效益。如何鉴定中华绒螯蟹种源，仍是养殖业的一个难题。急需要一种采用分子遗传标记技术的新方法来解决这一难题。国外Stepien et al.(1999)成功地运用部分基因片段的PCR/RFLP标记，对软体动物双壳类4个近缘种的幼体进行快速鉴别(Stepien，C.A.，Allyson，N.H.，and Skidmore，J.L 1999.Diagnosticgenetic markers and evolutionary relationships among invasive dreissenoid andcorbiculoid bivalves in North America：phyligenetic signal from mitochondrial16S rDNA.Molecular Phylogenetics and Evolution 13(1)：31-49)。但这种鉴别对于不同的物种，其用于鉴别的聚合酶链式反应的引物、酶切位点和鉴别方法都不一样。

本发明的目的是提供一种准确鉴别河蟹苗种和种蟹中的中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹的PCR/RFLP分子鉴定试剂盒，包括一对聚合酶链反应引物、一种DNA限制性内切酶酶切位点及其鉴定方法。

本发明的实施方案如下：首先从各水系绒螯蟹样品中提取总DNA，设计一对PCR引物，用PCR方法扩增一段基因片段，经过纯化后，对基因片段进行DNA序列测定，建立各水系绒螯蟹的DNA序列数据库。在比较数据库DNA序列的基础上，针对中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹的序列差异，选择设计合适的DNA限制性内切酶酶切位点，通过聚合酶链反应产物的限制性酶切片段长度差异，达到快速、准确鉴别中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹的目的。对需要鉴定的蟹苗或种蟹采取DNA样品，在给定的PCR条件下，用本发明的一对鉴定引物(IHX01-L和IHX01-H)，受试样品都能够扩增出一段基因片段，在用DNA限制性内切酶DraI对受试样品的PCR扩增片段进行酶切后，通过脂糖凝胶电泳检测，只有在中华绒螯蟹中，能够产生长度为293bp酶切片段，而在合浦绒螯蟹中，则产生长度为188bp酶切片段。当受试样品经用本鉴定试剂盒进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确鉴定样品是中华绒螯蟹或是合浦绒螯蟹。本发明设计的对蟹苗或成蟹进行PCR/RFLP分子鉴定的方法是采用下列步骤：

a、DNA的提取：按常规进行，用无离子水将受试样品DNA的浓度调节至0.1-0.3μg/μL；

b、扩增DNA片段，即进行聚合酶链反应，用于聚合酶链反应的引物DNA序列有1对：

IHX01-L：5’GGGTAACTGAGCAAAGGTAGCATAAT3’

IHX01-H：5’GAAAGAAGATAGAGGTCGCAAACT3’；

c、加入限制性内切酶DraI进行酶切，进行酶切的限制性内切酶的酶切位点为：

d、电泳；

e、与标准图谱对比：如具有293bp酶切片段，则受试样品为中华绒螯蟹；如具有188bp酶切片段，则受试样品为合浦绒螯蟹。

以上步骤更具体的方案是：

a、DNA的提取：按常规进行，用无离子水将受试样品DNA的浓度调节至0.1-0.3μg/μL；

b、聚合酶链反应：

①聚合酶链反应液：反应体积以30μL为参考，各种物品的用量分别为：

   PCR混合液          10μL

   受试样品DNA模板    1-2μL

   Taq DNA聚合酶      1U(0.2μL)

   无离子水           补齐至30μL

   混匀后，高速离心数秒；

PCR混合液：每10μL PCR混合液中，含有引物IHX01-L、引物IHX01-H各1μL(引物浓度用无离子水调节至10pmol/μL)；10×Taq DNA聚合酶缓冲液4μL；MgCl₂(25mM)3μL；dNTP(2mM)1μL；

 ②PCR反应条件：PCR反应在PCR仪上进行，反应条件为：

   95℃预变性4分钟，然后按以下条件进行30次循环反应：

   变性94℃       40秒

   复性55-56℃    30-40秒

   延伸72℃       40-60秒

 循环结束后在72℃保持10分钟补齐，反应结束后在4℃保存。

 ③PCR产物的电泳检测：取上述反应液5-10μL，与2-3μL载样缓  冲液混合，用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)电泳检测扩  增结果，各种受试样品均能够检测出一条大小约为400bp的DNA条带；

   c、聚合酶链产物的限制性内切酶酶切反应：

   DNA限制性内切酶酶切反应：反应液参考体积为20μL，其中各种

   物品的用量分别为：

     PCR产物                         10μL

     10×限制性内切酶中性盐度缓冲液  2μL

     限制性内切酶DraI                2～4U

     无离子水                        补齐至20

   将反应液置于37℃保温4小时，反应结束后置于65℃水浴10min，

使酶失活。

d、电泳观察鉴定结果：酶切产物用2-2.5％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)，在65V电压下电泳1-2hr，观察电泳条带；

e、与标准图谱对比，使用DNA限制性内切酶DraI对聚合酶链反应产物进行酶切，产生对中华绒螯蟹和合浦绒螯蟹具有特异鉴别性的酶切片段长度差异，在中华绒螯蟹样品中产生长度为293bp的酶切片段；在合浦绒螯蟹样品中，则产生长度为188 bp的酶切片段。如具有293bp酶切片段，则受试样品为中华绒螯蟹；如具有188 bp酶切片段，则受试样品为合浦绒螯蟹。两种标准样品的酶切片段长度差异如图1所示。

实施上述各步骤所使用的PCR/RFLP分子鉴定试剂盒中包括有：用于聚合酶链反应的引物或含有该引物的混合液，DNA限制性内切酶DraI，标准图谱。其中用于聚合酶链反应的1对引物DNA序列为：

IHX01-L：5’GGGTAACTGAGCAAAGGTAGCATAAT3’

IHX01-H：5’GAAAGAAGATAGAGGTCGCAAACT3’

用全自动合成仪按上述引物的DNA序列进行合成，即可得到引物的白色粉末结晶。

本发明的优点在于：本发明可解决水产养殖中河蟹苗种和种蟹鉴定的难题，提供一种准确鉴别中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹的分子鉴定试剂盒。本发明对于从事河蟹养殖、蟹种培育部门快速、准确地鉴定河蟹苗种和种蟹是十分必要的。对于打击蟹苗引种中以南方合浦蟹苗充当中华绒螯蟹蟹苗的假冒伪劣行为，促进河蟹养殖业的发展是十分有效的。

现结合附图与实施例作进一步说明。

图1为中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹标准样品的PCR/RFLP分子鉴定标准：A带型为中华绒螯蟹，具有293bp酶切片段；B带型为合浦绒螯蟹，具有188bp酶切片段；M为DNA分子量标记。

实施例1(提取总DNA、设计PCR引物、对基因片段进行DNA序列测定以及建立各水系绒螯蟹的DNA序列数据库，均为本发明的基础工作。本发明的使用者只需按实施例实施即可)：采用PCR/RFLP分子鉴定试剂盒，按照下列步骤对受试样品进行PCR/RFLP鉴别：

a、DNA的提取：按常规进行，用无离子水将受试样品DNA的浓度调  节0.1-0.3μ/μL。

b、聚合酶链反应：

①聚合酶链反应液：反应体积以30μL为参考，各种物品的用量分别

  为：

    PCR混合液               10μL

    受试样品DNA模板         1～2μL

    Taq DNA聚合酶           1U(0.2μL)

    无离子水                补齐至30μL

    混匀后，高速离心数秒。

    PCR混合液：每10μL PCR混合液中，含有IHX01-L、IHX01-H  各1μL(引物浓度用无离子水调节至10pmol/μL)；10×Taq DNA聚  合酶缓冲液4μL；MgCl₂(25mM)3μL；dNTP(2mM)1μL。

②PCR反应条件：PCR反应在PCR仪上进行，反应条件为：

  95℃预变性4分钟，然后按以下条件进行30次循环反应：

  变性94℃        40秒

  复性55～56℃    30～40秒

  延伸72℃        40～60秒

    循环结束后在72℃保持10分钟补齐，

    反应结束后在4℃保存。

③PCR产物的电泳检测：取上述反应液5-10μL，与2-3μL载样缓

冲液混合，用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)电泳检测扩增结果，各种受试样品均能够检测出一条大小约为400bp的DNA条带。

c、聚合酶链产物的DNA限制性内切酶酶切反应：反应液参考体积为20μL，其中各种物品的用量分别为：

     PCR产物                         10μL

     10×限制性内切酶中性盐度缓冲液  2μL

     限制性内切酶DraI                2～4U

     无离子水                        补齐至20μL

     将反应液置于37℃保温4小时，反应结束后置于65℃水浴10  min，使酶失活。

d、电泳观察鉴定结果：酶切产物用2-2.5％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)，在65V电压下电泳1-2hr，观察电泳条带。

e、与标准图谱对比，使用DNA限制性内切酶DraI对聚合酶链反应产物进行酶切，产生对中华绒螯蟹和合浦绒螯蟹具有特异鉴别性的酶切片段长度差异，在中华绒螯蟹样品中产生长度为293bp的酶切片段；在合浦绒螯蟹样品中，则产生长度为188bp的酶切片段。如具有293bp酶切片段，则受试样品为中华绒螯蟹；如具有188bp酶切片段，则受试样品为合浦绒螯蟹。

两种标准样品的酶切片段长度差异如图1所示。