由海绵分离的包括Asmarine A和B的细胞毒性生物碱衍生物

摘要

从海绵Raspailia物种分离了新型细胞毒性生物碱Asmarine A和B。已经在NMR数据的基础上建立了这些化合物的结构并通过X－射线分析予以证实。同时还要求对化合物(I)或(II)的权益进行保护,其中R

说明书

本发明涉及从海绵Raspailia物种分离的新型细胞毒性生物碱Asmarine A和B。

发明背景

海洋生物，特别是软珊瑚、海绵和被囊动物，产生许多次级代谢物并显示不同水平的生物活性(参考资料1)。这些代谢物中的一个家族是二萜生物碱家族；1984年(参考资料2)报道了四个Agelasines。的结构：

我们已经从海绵Raspailia物种分离出与该agelasine家族有关的新型细胞毒性二萜生物碱。

发明简述

本发明提供了或者具有结构式(I)，或者具有结构式(II)的新型二萜生物碱：(I)                                  (II)其中R¹代表氢原子或低级烷基或低级链烷酰基；R²代表氢原子或低级烷基；R³或者是含有一个或多个异戊二烯单位的烷基或环烷基，或者是一个单萜或倍半萜烯或二萜基团；R⁴和R⁵代表氢原子或低级烷基；R⁶代表低级烷基；X代表F或Cl或Br或I。

在结构式(I)和(II)的基团的定义中，所述低级烷基以及低级链烷酰基的低级烷基部分是指含有1到6个碳原子的直链或分支烷基基团，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基和己基。

更具体地说，本发明涉及从海绵Raspailia物种提取和分离出的Asmarine A和Asmarine B。这些化合物的结构如下所示：Asmarine A                          Asmarine B所显示的立体化学在两种情况下都是相对构型。

Asmarine A和Asmarine B显示出抗肿瘤活性。具体地说，Asmarine A和Asmarine B显示出针对来自人类实体瘤(如人肺癌、人结肠癌和人黑素癌)的细胞系的抗肿瘤活性，并且相似地对其它肿瘤细胞系，如白血病和淋巴瘤有效。

本发明还提供治疗罹患恶性肿瘤的哺乳动物的方法，所述恶性肿瘤对具有结构式(I)或结构式(II)的化合物敏感，该方法包括给予治疗有效量的具有结构式(I)或结构式(II)的化合物，或其药用组合物。

本发明还提供了含有具有结构式(I)或结构式(II)的化合物作为活性成分的药用组合物，以及制备这些药用组合物的方法。

本发明的又一方面是制备化合物Asmarine A和Asmarine B的方法，该方法包括从海绵Raspailia物种的提取和分离。

药用组合物的例子包括任何适合口服给予、局部给予或胃肠外给予而配制的固体(片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂等)或液体(溶液、悬浮液或乳液)，它们可以仅含有纯化合物或与任何载体或其它药物学上有活性的化合物组合。当胃肠外给予时，这些组合物必须是无菌的。

含有具有结构式(I)或结构式(II)的化合物的药用组合物的正确剂量将根据药物制剂、使用方法以及要治疗的具体部位、宿主和肿瘤而变化。其它因素应该考虑在内，如年龄、体重、性别、食谱、给药时间、排泄率、宿主的疾病状况、联合用药情况、反应敏感性和疾病的严重程度。在最大耐受剂量内，可以持续或定期给药。抗肿瘤活性

在含有Earle’s平衡盐、2.0mM L-谷氨酸、非必需氨基酸、不含碳酸氢钠的Eagle’s极限必需培养基(EMEM/neaa)中，添加10％胎牛血清(FCS)、10^-2M碳酸氢钠和0，1g/L青霉素-G+链霉素硫酸盐，维持细胞处于对数生长期。

使用Bergeron等人(参考资料3)描述的方法的修改形式，已经执行了一个筛选程序来确定和比较这些化合物的抗肿瘤活性。所使用的抗肿瘤细胞是P-388(得自DBA/2小鼠的淋巴样肿瘤的悬浮培养物)、A-549(人肺癌的单层培养物)、HT-29(人结肠癌的单层培养物)和MEL-28(人黑素癌的单层培养物)。

将P-388细胞以1×10⁴每孔接种到16mm孔中1ml等分的含有指定浓度药物的MEM 5FCS中。接种另外一组不含药物的培养物作为对照生长，以确保所述细胞维持在指数生长期。所有测定都一式两份进行。在37℃、10％CO₂、98％湿度空气中孵育三天后，通过比较有药物的孔中的生长和对照孔中的生长，确定大致的IC₅₀。

将A-549、HT-29以及MEL-28细胞以2×10⁴个细胞每孔接种到16mm孔中1ml等分的含有指定浓度药物的MEM 10FCS中。接种另外一组不含药物的培养物作为对照生长，以确保所述细胞维持在指数生长期。所有测定都一式两份进行。在37℃、10％CO₂、98％湿度空气中孵育三天后，用0.1％结晶紫染色这些孔。通过比较有药物的孔中的生长和对照孔中的生长，确定大致的IC₅₀。

使用细胞系P-388、A-549、HT-29以及MEL-28对Asmarine A和Asmarine B的体外细胞毒性测定的结果在下表中给出：

                         IC₅₀(μM)

            P-388     A-549     HT-29     MEL-28Asmarine A      1.18      1.18      1.18      1.18Asmarine B      0.24      0.12      0.12      0.24提取和分离

在一台EIMS质谱仪上记录低分辨率质谱。在一台Bruker ARX-500波谱仪上记录¹H和¹³C-NMR波谱。根据TMS(δ＝0ppm)报告所有化学位移。

Raspailia物种(Rob Van Soest)，(寻常海绵纲异固海绵目Raspailiidea科)是由SCUBA于1997年5月在Dahlak Archipelago，Eritrea潜水到23.5m的深度采集到的。一个参考样品保藏在Tel Aviv大学(ET-388)。将所述海绵当场冰冻起来。使用2倍乙酸乙酯提取冻干的海绵(20gr)，蒸发后得到1.2g棕色胶。将此棕色胶通过Kupchon分级分离到四个部分中：己烷、四氯化碳、氯仿和水。CHCl₃和CCl₄部分是相似的。将这两个部分合并，在sephadex LH-20柱上进行层析，使用MeOH∶CHCl₃(1∶1)洗脱后，产生五个组分。使用同样的溶剂系统将组分(3-5)在sephadex LH-20上进一步反复层析，得到作为固体的Asmarine A(100mg)，mp＝232℃，m/z+＝423(C₂₅H₃₇N₅O)，(100％)188(C₈H₆N₅O⁺)，[α]_D²⁰＋55°(c＝0.5，CHCl₃)，IR 3400，2928，1600，1553，1451，1400，1388，900cm^-1，该Asmarine A的结构由X-射线分析证实。使用同样的溶剂还分离了作为油状物的Asmarine B(120mg)，m/z⁺＝423(C₂₅H₃₇N₅O)，(100％)188(C₈H₆N₅O⁺)，[α]_D²⁰＋60°(c＝0.5，CHCl₃)，IR 3400，2927，1606，1553，1451，1404，1388，900cm^-1。

Asmarine A和B的NMR数据见于下表：在所有情况下溶剂都是CHCl₃，并且根据TMS(δ＝0ppm)报告所有化学位移。

             δ_C               δ_H    C No. Asmarine A  Asmarine B  Asmarine A  Asmarine B    1    21.82t    21.17t  1.70d，1H  1.45m，1H  1.82m，2H    2    28.56t    24.13t  1.85brd，1H  1.21m，1H  1.75m，1H  1.60m，1H    3    33.20t    31.65t  2.25dt，1H  2.05dd，1H  2.45m，1H  2.12m，1H    4    160.59s    153.65s    5    40.05s    39.35s    6    37.24t    38.12t  1.50m，2H  2.10t，1H  1.20t，1H    7    27.36t    27.22t  1.45m，2H  1.54m，1H  1.20m，1H    8    36.68d    38.12d  1.37m，1H  1.35m，1H    9    39.26s    40.54s    10    48.62d    46.56d  1.05d，1H  1.39m，1H    11    31.23t    31.05t  1.55dt，1H  1.25m，1H  1.59m，1H  1.30t，1H    12    33.01t    31.55t  1.95dt，1H  1.43m，1H  1.95dt，1H  1.55m，1H    13    64.20s    64.95s    14    36.68t    36.40t  2.50dt，1H  2.15dd，1H  2.55m，1H  2.25m，1H    15    42.30t    42.33t  4.25dt，1H  4.20dd，1H  4.30t，2H    16    21.75q    23.09q  1.44s，3H  1.49s，3H    17    15.93q    15.84q  0.70d，3H  0.74d，3H    18    102.45t    105.69t  4.60s，2H  4.70d，2H    19    20.08q    32.87q  1.00s，3H  1.11s，3H    20    18.28q    19.85q  0.65s，3H  0.82s，3H    2’    151.68d    151.64d  8.50s，1H  8.50d，1H    4’    149.00s    149.57s    5’    109.31s    109.32s    6’    158.70s    158.38s    8’    143.10d    143.32d  7.95s，1H  7.95s，1H

参考资料1.Faulkner，D.Nat.Prod.Rep.1997，14，259-302以及其中的参考资  料。2.Nakamura，H.等人。Tetrahedron Lert.1984，25，2989-2992。3.Raymond J.Bergeron，Paul F.Cavanaugh，Jr.，Steven J.Kline，Robert  G.Hughes，Jr.，Gray T.和Carl W.Porter。亚精胺儿茶酚酰胺  catecholamide铁螯合剂的抗肿瘤和抗疱疹活性。Biochem.Bioph.  Res.Comm.1984，121，848-85。