WK－5344A物质和WK－5344B物质及其生产

摘要

本发明涉及对胆固醇酯转移蛋白有抑制作用的新型物质WK－5344A物质和WK－5344B物质,及其生产方法。在培养基中培养一种属于链霉菌属并具有产生WK－5344A物质和WK－5344B物质的能力的微生物,在培养基中积累WK－5344A物质和WK－5344B物质,然后从该培养基中分离WK－5344A物质和WK－5344B物质。由于该物质显示对胆固醇酯转移蛋白有明显的抑制作用,所以该物质可有效地用于预防和治疗由人体中胆固醇积累引起的疾病。

说明书

                   发明背景

1.发明领域

本发明涉及WK-5344A物质和WK-5344B物质及其生产。更具体而言，本发明涉及对胆固醇酯转移蛋白有抑制作用的新型物质WK-5344A物质和WK-5344B物质及其生产。

2.相关领域描述

由于血管壁中胆固醇积累如成人高血压所致动脉硬化引起的心肌梗死和脑意外，其多种预防性药物已知。包括如，普伐他汀、莫维诺林和氟伐他汀(Endo，A.，医药化学杂志(Journal of MedicinalChemistry)28，401-405，1985和Endo，A.，脂类研究杂志(Journal ofLipid Research)33，1569-1582，1992)。

心肌梗死和脑意外的发作和这些疾病的过程极其复杂。因此，十分需要治疗这些疾病的具有不同作用机制的物质。

最近，由于日常生活中食品的西方化，因血管壁中胆固醇积累引起的心肌梗死和脑意外的死因增加，并成为生活方式相关疾病的问题。大多数胆固醇主要在肝脏和肠中酯化，通过长链脂肪酸形成胆固醇酯，其被分泌到血液中成为乳糜微粒和极低密度脂蛋白的成分，并主要作为低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的成分在血液中循环。

将肝脏胆固醇转运到外周组织中的低密度脂蛋白是刺激动脉硬化的一个危险因素。相反，高密度脂蛋白从外周组织中收集胆固醇，被认为是抑制动脉硬化进展的一个因素。胆固醇酯转移蛋白参与两种脂蛋白间胆固醇酯的交换反应，并参与低密度脂蛋白的成熟。

因此，抑制胆固醇酯转移蛋白功能的物质可减少血液中动脉硬化的危险因素——低密度脂蛋白，而相反，由于可抑制动脉硬化的高密度脂蛋白的增多而产生抗动脉硬化作用，并对这些疾病有效。

                 发明概述与目的

为了发现新型生物活性物质，我们研究了从土壤中分离的微生物的代谢产物，并发现从土壤中新分离的微生物菌株WK5344的培养物产生对胆固醇酯转移蛋白有抑制作用的物质。从该培养物中分离并纯化该胆固醇酯转移蛋白抑制剂后，由于具有这种化学结构的物质尚不清楚，我们将这些物质命名为WK-5344A物质和WK-5344B物质。

本发明即是根据这种了解实现的。

本发明的一个目的在于提供具有下列通式的WK-5344A物质：

本发明的另一个目的在于提供具有下列通式的WK-5344B物质：

本发明的另一目的在于提供一种生产WK-5344A物质和WK-5344B物质或其盐的方法，该方法包括培养一种属于链霉菌属(Streptomyces)并具有产生WK-5344A物质和WK-5344B物质的能力的微生物，在培养物中积累WK-5344A物质和WK-5344B物质，并从该培养物中分离WK-5344A物质和WK-5344B物质。

                   优选实施方案描述

根据本发明的优选实施方案，本发明涉及生产新型物质WK-5344A物质和WK-5344B物质或其盐的方法，其中具有产生WK-5344A物质和WK-5344B物质的能力、属于链霉菌属的微生物是链霉菌属的WK-5344种。本发明进一步涉及一种具有产生WK-5344A物质和WK-5344B物质的能力、属于链霉菌属的微生物，该微生物是链霉菌属的WK-5344(FERM BP-6668)。

具有产生本发明的WK-5344A物质和WK-5344B物质的能力的微生物(下文称为产WK-5344物质微生物)属于链霉菌属，并具有无限制地产生WK-5344A物质和WK-5344B物质的能力。用来产生本发明的WK-5344A物质和WK-5344B物质的优选微生物菌株的例子是链霉菌WK-5344种，它是由本发明者从新收集的土壤中分离的。

该菌株的分类学特征如下。(I)形态学特征

营养菌丝体在多种琼脂培养基上生长良好，未见断裂。气生菌丝体在无机盐-淀粉琼脂和甘油-天冬酰胺琼脂上大量生长，呈白色到灰色。在显微镜下观察，观察到显示20个以上孢子的螺旋和链的气生菌丝体。孢子的形态是大小为1.0×0.5μm的椭圆形。孢子表面多刺。未见菌核、孢子囊和游动孢子。(II)在不同琼脂培养基上的培养特性

根据E.B.Shirling和D.Gottlieb(国际系统细菌学杂志(International Journal of Systematic Bacteriology)16，313，1966)的方法观察到的生产菌株的培养特性如表1所示。

色调的确定参照《色彩调和手册》(Color Harmony Manual)第4版(Container Corporation of America，Chicago，1958)作为标准色，并在括号中表示色调的名称。如未特别说明，下表显示该菌株在不同培养基中27℃培养两周后培养状态的目测结果。表1

蔗糖-硝酸盐琼脂

生长                      良好，淡芥褐色(2ie)

背面                      淡芥褐色-苔绿色(2ie-241g)

气生菌丝体                丰富，灰色(5fe)

可溶性色素                不产生葡萄糖-天冬酰胺琼脂(ISP)

生长                      良好，竹色(2gc)

背面                      竹色(3ie)

气生菌丝体                丰富，雪花石膏色-灰色

可溶性色素                (13ba-5fe)

                          淡黄色(1db)甘油-天冬酰胺琼脂(ISP)

生长                      良好，饼干色(2ec)

背面                      竹色(3ie)

气生菌丝体                丰富，雪花石膏色-灰色

可溶性色素                (13ba-5fe)

                           淡黄色(1db)无机盐-淀粉琼脂(ISP)

生长                       良好，竹色(2gc)

背面                       驼色(3ie)

气生菌丝体                 丰富，灰色(5fe)

可溶性色素                 不产生酪氨酸琼脂(ISP)

生长                       良好，竹色(2gc)

背面                       淡芥褐色-苔绿色(2ie-241g)

气生菌丝体                 丰富，雪花石膏色(5fe)

可溶性色素                 不产生麦片琼脂(ISP)

生长                       适中，竹色-金黄色(2fb-2kb)

背面                       竹色-暗褐色(2fb-2li)

气生菌丝体                 适中，灰色(5fe)

可溶性色素                 香橼色(1gc)酵母膏-麦芽提取物琼脂(ISP)

生长                       良好，竹色(2gc)

背面                       芥子色(2le)

气生菌丝体                 丰富，珍珠灰(13cb)

可溶性色素                 橄榄黄(11e)营养琼脂

生长                       适中，竹色(2gc)

背面                 块金色(2nc)

气生菌丝体           适中，灰色(5fe)

可溶性色素           不产生蛋白胨-酵母膏-铁琼脂(ISP)

生长                 适中，暗金色(2ng)

背面                 淡芥子褐色(2ie)

气生菌丝体           少，白色(a)

可溶性色素           不产生葡萄糖-硝酸盐琼脂(ISP)

生长                 适中，淡芥子褐色(2ie)

背面                 芥子色(2le)

气生菌丝体           适中，白色(a)

可溶性色素           金色(11/21c)甘油苹果酸钙琼脂

生长                 适中，竹色(2gc)

背面                 淡麦色-竹色(2ea-2gc)

气生菌丝体           丰富，珍珠色(3ba)

可溶性色素           香橼色(1gc)葡萄糖-蛋白胨琼脂

生长                 适中，竹色(2gc)

背面                 淡麦色-金黄色(2ea-2kb)

气生菌丝体           少，白色(a)

可溶性色素           不产生(III)生理特性

(1)黑色素

(a)酪氨酸琼脂                  阴性

(b)蛋白胨-酵母膏-铁琼脂        阴性

(c)葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基    阴性

(d)胰蛋白胨-酵母提取液    阴性

(2)酪氨酸酶反应           阴性

(3)硫化氢产生             阴性

(4)硝酸盐还原             阳性

(5)明胶液化(21-23℃)      阴性

(葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基)

(6)淀粉水解               阳性

(7)脱脂乳凝结(37℃)       阴性

(8)脱脂乳胨化(37℃)       阳性

(9)生长温度               9-37℃

(10)碳源的利用(Pridham和Gottlieb培养基)

    利用：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、蜜二糖、甘露醇、鼠李糖、果糖和肌醇。

    略有利用：棉子糖和蔗糖

(11)纤维素分解            阴性(IV)细胞壁组成

细胞壁的二氨基庚二酸是LL型。

该菌株的分类学特征总结如下。

细胞壁中的二氨基庚二酸是LL型。营养菌丝体在多种琼脂培养基上显示良好生长，未见断裂。气生菌丝体的形态为长孢子链螺旋。孢子表面多刺。不同培养特性显示褐色调的营养菌丝体和白色到灰色调的气生菌丝体。在酵母膏-麦芽提取物琼脂培养基、麦片琼脂培养基、葡萄糖-天冬酰胺琼脂培养基、甘油-天冬酰胺琼脂培养基、葡萄糖-硝酸盐琼脂培养基和甘油-苹果酸钙琼脂培养基上可溶性色素形成是黄绿色素。

根据这些观察结果，该菌株确定为是一种属于链霉菌属的菌株，称为链霉菌WK-5344种。

该菌株在1999年3月1日保藏于国际专利保藏单位，国立生命科学和人体技术研究所，位于AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566日本，保藏号为FERMBP-6668。

尽管产WK-5344物质的微生物菌株被作为本发明的优选菌株，但其分类学特征极易突变为微生物的普通特征，并且不稳定。众所周知，也可通过自然突变技术突变，或一般进行的人工突变技术：如紫外线照射、X线照射或使用诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和甲磺酸乙酯进行突变。因此，本发明中能使用能产生WK-5344物质、属于链霉菌属的菌株，包括人工突变体和自然突变体。产WK-5344物质的菌株中包括通过细胞工程技术(如细胞融合和基因操作)突变的菌株。

在本发明的WK-5344A物质和WK-5344B物质的生产中，属于链霉菌属的产WK-5344A物质的微生物在优选的培养基中培养。在该微生物的培养过程中，通常使用用于普通微生物的培养方法。培养基的实例是含有微生物用可同化碳源、微生物用可消化氮源的营养培养基，必要时可添加无机盐。

上述可同化碳源的实例有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、糊精、纤维素、甘油和有机酸，它们单独或结合使用。可消化氮源的实例有有机氮源如蛋白胨、肉膏、酵母提取物、干酵母、大豆粉、玉米浆、棉籽油、酪蛋白、大豆蛋白水解物、氨基酸和尿素，和无机氮源如硝酸盐和氨盐，它们单独或结合使用。

另外，必要时可添加无机盐如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和磷酸盐和重金属盐。在培养基中，可添加刺激该菌株生长及WK-5344A物质和WK-5344B物质产生的痕量氮元素、生长刺激物质或前体。

培养能在有氧条件下进行，如摇瓶培养或通气搅拌培养。培养基的pH优选地为中性条件。对于工业生产，浸没通气是优选的。培养条件可以是20-37℃，通常24-30℃，优选地27℃。液体培养中培养时间一般为2-6天，以积累WK-5344A物质和WK-5344B物质，当达到WK-5344A物质和WK-5344B物质的最大产量时，可终止培养。

为了根据所用菌株类型和外部条件获得优选条件，可调节并选择培养条件如培养基组成、培养温度、搅拌速度和通气量。在液体培养中，如果产生泡沫，可使用消泡剂如硅油、植物油和表面活性剂。

由于培养液或培养菌丝体中含有在培养物中积累的WK-5344A物质和WK-5344B物质，加入助滤剂如硅藻土(Celite)和Hyflosupercell过滤培养物，或离心分离培养液与菌丝体，用有机溶剂抽提，然后浓缩提取液，并分离WK-5344A物质和WK-5344B物质。

从培养滤液中分离WK-5344A物质和WK-5344B物质如下进行：用不与水混溶的有机溶剂如乙酸乙酯、乙酸丁酯和苯抽提培养滤液，真空浓缩提取液获得WK-5344A物质和WK-5344B物质。这种粗物质能用纯化亲脂性物质的已知方法纯化，例如使用载体如硅胶或矾土的柱层析，获得纯化的WK-5344A物质和WK-5344B物质。

为了从菌丝体中分离WK-5344A物质和WK-5344B物质，用可与水混溶的有机溶剂如甲醇抽提菌丝体，真空浓缩提取液，用不与水混溶的有机溶剂如乙酸乙酯、乙酸丁酯或苯抽提浓缩液，并在与以上从培养液中获得的提取液合并或不合并的情况下纯化该提取液，获得WK-5344A物质和WK-5344B物质。

本发明的WK-5344A物质和WK-5344B物质的理化性质描述如下。[I]WK-5344A物质

(1)分子式：C₄₅H₃₀N₃O₁₃Fe[用高分辨率FAB质谱(阳性)，测得m/z877.1203(M＋H)](计算值：877.1206)

(2)分子量：876[经FAB质谱(阳性)测定为m/z877(M＋H)⁺和899(N＋Na)⁺]

(3)旋光率：[α]_D²⁵-3000°(c＝0.01，甲醇)

(4)紫外谱：在甲醇中测定的紫外谱如图1所示。在280、305(肩)、440和690nm周围观察到特异的最高峰。

(5)红外谱：红外谱(KBr压片)如图2所示。λmax^KBrcm^-1：3400、1728、1701、1597、1493、1385、1284、1207和1105。

(6)溶剂中的可溶性：在甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿和二甲亚砜中可溶，不溶于水。

(7)物质性质：中性(8)物质的颜色与形态：绿色粉末(9)质子核磁共振：图3(Varian NMR，在氘甲醇中，400MHz)(10)碳核磁共振：图4(Varian NMR，在氘甲醇中，100MHz)考虑上述理化性质和光谱数据确定WK-5344A物质的结构如下。[II]WK-5344B物质

(1)分子式：C₄₆H₃₀N₃O₁₄Fe[用高分辨率FAB质谱(阳性)，测得m/z905.1151(M＋H)](计算值：905.1155)

(2)分子量：904[经FAB质谱(阳性)测定为m/z905(M＋H)⁺]

(3)旋光率：[α]_D²⁵-3000°(c＝0.01，甲醇)

(4)紫外谱：在甲醇中测定的紫外谱如图5所示。在285、303(肩)、445和698nm周围观察到特异的最高峰。

(5)红外谱：红外谱(KBr压片)如图6所示。λmax^KBrcm^-1：3400、1718、1701、1597、1508、1385、1281、1196和1105。

(6)溶剂中的可溶性：在甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿和二甲亚砜中可溶，不溶于水。

(7)物质性质：中性(8)物质的颜色与形态：绿色粉末(9)质子核磁共振：图7(Varian NMR，在氘甲醇中，400MHz)(10)碳核磁共振：图8(Varian NMR，在氘甲醇中，100MHz)考虑上述理化性质和光谱数据确定WK-5344B物质的结构如下。

如上所述，详细叙述了WK-5344A物质和WK-5344B物质的理化性质，与这些性质相同的化合物未有报道，因此确定WK-5344A物质和WK-5344B物质为新物质。

本发明的WK-5344A物质和WK-5344B物质的生物学性质和抑制活性在下文中说明。(1)对人胆固醇酯转移蛋白的抑制作用

按照Kato等人，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)264，4082-4087，1989所述的方法，用由人血浆制备的粗蛋白测定对胆固醇酯转移蛋白的作用。

合并重建的含有25μl[1-¹⁴C]胆固醇酯的高密度脂蛋白(下文称为HDL)、10μl人源低密度脂蛋白(下文称为LDL)、30μl 7mM 5，5-二硫二硝基苯甲酸，和5μl部分纯化的人胆固醇酯转移蛋白。总共150μl反应混合液在37℃下反应30分钟。

反应后，加入5μl 0.1％硫酸葡聚糖、5μl 6mM MgCl₂和20μl离子强度调节为0.16的磷酸缓冲液，使混合液在冰上20分钟。在4℃下以13000转/分离心该混合液15分钟。收集沉淀的LDL级分。LDL溶解于180μl 0.1N NaOH中，并用液体闪烁计数器测定LDL中转移的胆固醇酯。对于胆固醇酯转移蛋白活性，50％抑制的结果是0.54μg/mlWK-5344A物质，2.0μg/ml WK-5344B物质。

如上文所述，本发明的WK-5344A物质和WK-5344B物质显示对胆固醇酯转移蛋白有明显的抑制作用，并认为可用于预防和治疗由人体中胆固醇积累引起的疾病。

                     附图简述

图1显示本发明的WK-5344A物质的紫外谱(在CH₃OH中)。

图2显示本发明的WK-5344A物质的红外谱(KBr压片)。

图3显示本发明的WK-5344A物质的质子核磁共振谱(CD₃OD)。

图4显示本发明的WK-5344A物质的碳核磁共振谱(CD₃OD)。

图5显示本发明的WK-5344B物质的紫外谱(在CH₃OH中)。

图6显示本发明的WK-5344B物质的红外谱(KBr压片)。

图7显示本发明的WK-5344B物质的质子核磁共振谱(CD₃OD)。

图8显示本发明的WK-5344B物质的碳核磁共振谱(CD₃OD)。

                 发明实施方案详述

下列实施例说明了本发明，但不应看作是限制本发明。

实施例

含有2.4％淀粉、0.5％酵母提取物、0.1％葡萄糖、0.3％蛋白胨、0.3％肉膏和0.4％CaCO₃的100ml培养基(调节为pH7.0)在用棉塞密封的500ml锥形瓶中蒸汽灭菌。待冷却后，向其中无菌接种一接种环在琼脂培养基上生长的链霉菌WK-5344 FERM BP-6668种，并在27℃下振荡培养72小时，获得种子培养液。

含有4.0％可溶性淀粉、2.0％溶剂抽提的烤大豆粉、32μl/l 0.1N硫代硫酸钠、0.05％FeSO₄·7H₂O、0.05％KH₂PO₄和0.03％KCl的培养基(调节为pH6.5)在30升小型发酵罐中蒸汽灭菌。冷却后无菌接种200ml种子培养液，并在250转/分搅拌、10升/分通气下27℃培养96小时。

培养后，离心培养液获得的菌丝体用6升丙酮抽提。真空浓缩提取液除去丙酮，调节为pH5.0，用10升乙酸乙脂抽提，并真空浓缩提取液，获得粗物质9.20克。粗物质在己烷、甲醇和水(40∶19∶1)中分配，收集分配于下层的WK-5344物质，真空浓缩获得粗物质1.29克。将粗物质悬浮于10ml乙腈中，装填于ODS柱(20ml，Senshu Co.，SSC-ODS-7515-12)上，用含0.05％磷酸的乙腈洗脱层析。

合并洗脱的12ml级分，并合并含有活性成分的级分。除去乙腈后，用乙酸乙酯抽提水层级分，并真空干燥，获得粗活性物质157mg。

将157mg粗活性物质溶解于1.57ml甲醇中，装填于ODS柱(147ml，Senshu Co.，SSC-ODS-7515-12)上，用含0.05％磷酸的乙腈逐步洗脱层析。合并洗脱的12ml级分，并合并含有活性成分的级分。除去乙腈后，用乙酸乙酯抽提水层级分，并真空干燥，获得粗活性物质19.5mg。

将19.5mg粗活性物质溶解于0.5ml氯仿中，装填于硅胶柱(126ml，Kiesel gel60)上，用氯仿和甲醇洗脱层析。每一级分分离为12ml。结果，分离到1.69mg WK-5344A物质和1.12mg WK-5344B物质。

                     发明作用

如上所述，在培养基中培养一种属于链霉菌属并具有产生WK-5344A物质和WK-5344B物质的能力的微生物，以在培养物中积累WK-5344A物质和WK-5344B物质。从该培养物中收集WK-5344A物质和WK-5344B物质，获得对胆固醇酯转移蛋白有抑制作用的物质。预计该物质对成人疾病如动脉硬化引起的心肌梗死和脑意外有预防和治疗作用。