双链核糖核酸在制备治疗人类柯萨奇病毒感染药物中的应用

摘要

本发明涉及双链核糖核酸(dsRNA)在制备治疗人类柯萨奇病毒感染药物中的应用。本发明在dsRNA技术的基础上,将分子大小分布由沉降系数为≤42s的dsRNA修饰至4－28s左右的失配dsRNA,以改变现有抗病毒药物毒副作用大的缺点,通过对dsRNA的结构的修饰,保留其原有的抗病毒功能,降低毒副作用。本发明可用于治疗包括病毒性心肌炎、肝炎、脑炎等疾病在内的柯萨奇病毒感染。

说明书

发明领域

本发明涉及双链核糖核酸在制备治疗人类柯萨奇病毒感染药物中的应用。

背景技术

双链核糖核酸(dsRNA)的结构是两条单链核糖核酸(RNA)以所谓互补的方式由氢键相连构成的双螺旋结构。dsRNA被预期具抗病毒的生理活性，但我国对dsRNA的研究几乎处于停滞状态，原因是由于原有的核酸类药物明显的毒副作用而限制了它的临床使用。

发明公开

鉴于上述，本发明的目的是为以公知方法制备的dsRNA，找到新的医疗用途。

本发明所制备的核糖核酸是失配dsRNA，其制备方法是以RNA为基体，经退火而成；核酸是核糖等与嘌呤环或嘧啶环相连，两条RNA以所谓互补的方式由氢键相连构成双螺旋结构。

本发明在dsRNA技术的基础上，将分子大小分布由沉降系数为≤42s的dsRNA修饰至4-28s左右的失配dsRNA，以改变现有抗病毒药物毒副作用大的缺点，通过对dsRNA的结构的修饰，保留其原有的抗病毒功能，降低毒副作用，并用于治疗包括病毒性心肌炎、肝炎、脑炎及呼吸道感染等疾病在内的柯萨奇病毒感染。

高分子的dsRNA在体内停留时间很短，可以很快地被RNA酶水解为短的碱基对片段，小的碱基对片段可以在细胞膜间传递，进入细胞内部发挥免疫作用，也可穿过粘膜，对体液、脑组织液等也有免疫作用。

实施发明的最佳方式

在本说明书中，把作为合成dsRNA的多聚肌苷酸称之为“PolyI”，而把多聚胞苷酸称之为“PoltC”。

失配双链核糖核酸的制备工艺(可参照Molecular Pharmacology,12,299-232)：

a．制备修饰的多聚胞苷酸(PolyC)：

取36毫摩尔的胞苷二磷酸、7毫摩尔的尿苷二磷酸、15毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷、2毫克/毫升的多核苷酸磷酸化酶，于37℃下反应4.5小时。反应后的溶液经冷冻干燥，获得的白色固体即为上述的修饰的PolyC。

 b．制备双链核糖核酸产物(dsRNA)：

使用市售的PolyI和PolyC或修饰的PolyC，溶解于50毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷溶液中，使之为10-12毫克/毫升的浓度，于水浴中将温度从室温缓慢地提高到68℃，在68℃下保温约10分钟，放置至其温度降至室温，再于4℃保存。上述溶液经冷冻干燥，获得白色固体，这种物质即为上述的dsRNA。

所述双链核糖核酸是双链的，最好是失配的，PolyI·PolyC_11-32U或称rln·r(C_11-32U)_n。

所述双链核糖核酸可以核糖核酸RNA为对照物，分子量大小分布以沉降系数表示，集中在4S-28S范围内。

所述双链核糖核酸可以核糖核酸RNA为对照物，分子量大小分布以碱基数表示，集中在50-10000的范围内。

柯萨奇病毒的感染在人群中很常见，由此引起的病症多种多样，常见的有急性或慢性心肌炎、流行性胸痛、肝炎、脑炎及呼吸道感染等，孕妇感染后可通过胎盘传播给胎儿，引起胎儿畸形甚至死胎。在新生儿和婴儿中可引起病情危重的广泛性脑炎，常伴心肌炎和肝炎，一旦心脑受到该病毒严重侵害，极易引起死亡。目前，对由柯萨奇病毒引起的疾病的治疗缺乏有效的抑制药物，而传统的化学药物治疗又存在特异性差、且治疗不佳的缺陷，而失配双链核糖核酸可刺激机体产生广谱的内源干扰素及其它免疫因子，干扰病毒合成、改变细胞骨架，促进2’,5’-寡聚腺苷酸合成、激活蛋白激活酶和核糖核酸L酶的活力，以降解进入机体的病毒，提高机体综合免疫能力，保护正常细胞免受病毒感染，达到抑制、治疗恶性病毒性疾病的目的。

我们以实验来说明在对病毒性心肌炎的治疗中使用dsRNA的可能性。实验以柯萨奇病毒细胞为模型，细胞分别感染后，加dsRNA样品、非药物溶液(即样品空白)，经培养3天后，病毒对照的细胞完全被破坏，而感染病毒后加药的细胞生长良好，加非药物溶液的细胞均将近90％死亡。说明柯萨奇病毒感染细胞后加入dsRNA有明显的抑制病毒感染作用。当细胞生长时，感染病毒1小时，分别加入样品l和样品2、空白1和空白2，在37℃条件下孵育72小时，取上清液，再感染正常细胞。在37℃条件下经48小时后染斑，对各样品抑制空斑的作用进行比较，结果表明，样品1和样品2对空斑的形成有明显的抑制作用，与病毒空斑实验的结果相比较，其抑制率分别为74.3％和76.5％。以药物浓度为横坐标，以病毒空斑数量为纵坐标做药物作用浓度曲线，该药物的量效关系表明，样品对病毒的抑制作用随药物浓度增加而增加。

在治疗中，dsRNA的用量最好是：体重约60千克的患者，每周用14-140毫克，治疗7次，一般2-4周为一个疗程，病情严重者需延长时间。dsRNA的剂型可以是注射用针剂、口服药剂及气雾剂，采用静脉、肌肉、皮下注射，也可经鼻咽、口腔给药。

发明效果

失配双链核糖核酸是对毒性较大的抗病毒药物dsRNA进行修饰而研究制备的新型广谱抗病毒材料，通过修饰保留了dsRNA原有的干扰素诱导能力和其它正向生物学特性，而使毒副作用大大降低。因此失配dsRNA是一类低毒、广谱的抗病毒材料，它可以刺激机体产生广谱的内源干扰素及其它免疫因子，干扰病毒合成，改变细胞骨架，促进2’,5’-寡聚腺苷酸合成，激活蛋白激活酶和RNAL酶的活力，以降解进入机体的病毒，提高机体综合免疫能力，保护正常细胞免受病毒感染，达到抑制、治疗恶性病毒性疾病的目的。

本发明对失配dsRNA进行了长期研究，且进行了失配双链核糖核酸对柯萨奇病毒(可导致心肌炎、肝炎等疾病的病毒)感染细胞的抑制作用实验(见报告1)、动物的急性毒性实验(见报告2)，并已得到正向的结果，证明失配dsRNA对由柯萨奇病毒引起的疾病有显著的抑制作用。

报告1--双链核糖核酸对柯萨奇病毒感染细胞的抑制作用

针对易感细胞模型，分别输入病毒感染细胞、正常细胞、空白对照及失配dsRNA，研究并确定药物的对应病毒感染类型和适应症，主要进行以下实验：

1．稳定正常细胞培养

2．病毒感染实验

3．病毒滴度定量

4．病毒空斑形成实验

5．病毒致细胞病变作用

实验结果

1．药物dsRNA样1、样2(S1、S2)对柯萨奇病毒致细胞病变作用的抑制

柯萨奇病毒对照在培养3天后，细胞完全被破坏；感染病毒后加药，细胞生长良好；加非药物溶液(空白基质)细胞均将近90％死亡。

2．药物对空斑形成的抑制

当细胞生长贴壁近时，感染柯萨奇病毒，分别平行加入样品和非药物溶液，培养72小时。取上清液，感染正常细胞。培养后染斑，对各样品抑制空斑的作用进行比较。

结果表明平行样品(S1、S2)对空斑的形成有明显的抑制作用，与病毒空斑实验的结果相比较，其抑制率分别在70％以上。

3．药物作用浓度曲线

以药物浓度为横坐标，以病毒空斑数量为纵坐标做药物作用浓度曲线，可知随药物浓度增加，病毒空斑数量逐渐减少，表明了药物的量效关系，S1、S2对病毒的抑制作用随药物浓度增加而增加。

结论

1．病毒抑制实验显示：柯萨奇病毒感染细胞后，加入dsRNA，有明显的抑制病毒感染作用。

2．dsRNA对病毒的抑制作用有一定的量效关系。

报告2--双链核糖核酸注射液急性毒性实验

剂量：

给小鼠一次大量注射dsRNA注射液，观察急性毒性反应。实验时取18-22g昆明种小鼠20只，雌雄各半，dsRNA注射液给予小鼠一次皮内注射，每只小鼠给予相当于人体推荐用量的1/2剂量，以体重计算，则小鼠给药量相当人体用量的1250-1300倍。给药后，自由进食进水，连续观察14天，记录小鼠的各种表现及死亡情况。

结果：

动物给药后无任何异常表现，未见腹腔刺激症状，观察期内，小鼠活动正常，无稀便、竖毛，眼内无分泌物，20只小鼠无一例死亡。实验前平均体重为19.1±1.2g，14天后平均体重为32.3±2.9g，显示体重正常增长。

结论：

实验结果表明，给小鼠一次皮内注射人体临床推荐用量1000倍以上的dsRNA注射液，连续观察两周，未见任何异常反应，表明本药对小鼠无近期毒性。