新的来自嗜线虫致病杆菌的杀虫毒素以及编码此毒素的核酸序列

摘要

本发明公开了分离自嗜线虫致病杆菌,波氏致病杆菌以及发光光杆状菌的新的核酸序列,其表达产生新的杀虫毒素。本发明进一步公开了含有能够防治害虫的杀虫毒素的组合物和制剂。本发明进一步描述了生产该毒素的方法以及该核苷酸序列的使用的方法,例如在微生物中防治害虫或在转基因植物中赋予昆虫抗性的方法。

说明书

本发明涉及来自嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)、波氏致病杆菌(Xenorhabdus poinarii)以及发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)的新的毒素，其表达产生所述毒素的核酸序列，以及产生和使用毒素以及相应的核酸序列防治昆虫的方法。

害虫是农作物减产的主要原因。仅在美国每年由各种害虫引起的损失大约为77亿美元。除了农作物遭受的损失外，害虫也是菜农、果农以及花农的一个负担，并且它们也是花匠和家庭业主所讨厌的东西。

害虫主要通过化学杀虫剂的高强度应用被防治，化学杀虫剂通过抑制昆虫生长，阻止昆虫进食或繁殖，或杀死昆虫来起作用。好的昆虫防治因此可以被获得，但是这些化学制剂有时也影响其它有益的昆虫。化学杀虫剂的广泛应用产生的另一个问题是抗性昆虫变种的出现。不同的抗性管理策略可部分缓和这种现象，但是可供选择的害虫防治剂的需求仍呈现上升的势头，生物害虫防治剂，例如苏云金牙孢杆菌表达的杀虫毒素如δ-内毒素，在应用方面产生了令人满意的结果，提供了对化学杀虫剂的替代或补充。最近，编码这些δ-内毒素的基因被分离出来并且它们在异源宿主中的表达显示出其提供了另一种防治经济重要害虫的工具。特别地，杀虫毒素在转基因植物中的表达，例如苏云金牙孢杆菌δ-内毒素，提供了有效的抗选择害虫的保护，并且表达这些毒素的转基因植物已被商品化，允许农民减少化学杀虫剂的应用。然而，即使在这种情况下，抗性仍存在一种发展的可能，并且仅有一小部分的特定的害虫是可防治的。所以，长期期望但是仍没有满足的需要是新的且能有效的给农民带来经济利益以及环保上可接受的昆虫防治剂。

本发明满足了长期存在的对新昆虫防治剂的需求。特别是针对经济重要害虫以及有效控制对已存在的昆虫防治剂有抗性的害虫的防治剂的需求。此外，将对环境的负担减少到最小的杀虫剂是所期望的。

在新的昆虫防治剂的研究中，对来自Heterorhabdus与Steinemema属的线虫的一定的种特别感兴趣，因为它们的杀虫特性。它们杀死昆虫的幼虫及其用死幼虫作为食物的后代。实际上，它们的杀虫活性取决于生活在线虫中的共生细菌。这些共生细菌为Heterorhabdus情况下的光杆状菌属以及Steinernema情况下的致病杆菌属。

本发明涉及分离自嗜线虫致病杆菌的核苷酸序列，以及与其基本上相似的核苷酸序列，它们的表达产生了对经济重要害虫特别是植物害虫有较高毒性的杀虫毒素。本发明进一步提供了来自于该核苷酸序列表达产生的杀虫毒素，以及含有能够抑制害虫生存能力，生长或繁殖，或降低农作物的与害虫相关的损失的组合物和制剂。本发明进一步提供了一种生产毒素的方法以及利用核苷酸例如在微生物中防治害虫或在转基因植物中赋予害虫抗性的方法，以及使用毒素与含有毒素的组合物和制剂的方法例如应用该毒素，组合物和制剂到昆虫感染区或者预防处理昆虫易感区或以植物对赋予保护或对害虫的抗性。

新的毒素对小菜蛾(Plutella xylostella)(菱形斑纹蛾(diamonback moth))具有非常高的杀虫作用，小菜蛾是经济上重要的害虫。毒素可被用于多种昆虫防治的策略，产生对环境有最小影响的最大效率。

一方面，本发明提供了一种分离的核苷酸分子，包括：(a)一个基本上相似于选自含有下述序列的组的核苷酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14；或(b)一个与(a)的核苷酸序列同类编码的核苷酸序列；其中所述核酸分子的表达产生至少一种有抗害虫活性的毒素。在此方面的一个实施方案中，核苷酸序列与基本上相似于SEQ IDNO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14的核苷酸同类编码。优选的核苷酸序列基本上相似于SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14的核苷酸。更优选的核苷酸序列编码选自含有SEQID NO:2,3,5,7,9,11,13,以及15的氨基酸序列。最优选的，核苷酸序列含有SEQ ID NO:1核苷酸的569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:12,或SEQ ID NO:14。在另一个实施方案中，核苷酸序列含有包含在pClB9369(NRRL B-21883)中的大约3.0 kb DNA片段。

根据一个优选的实施方案，来自本发明核苷酸分子的表达的毒素具有抗小菜蛾的活性。

另一方面，本发明提供了一个分离的核酸分子，其含有一个20,25,30,35,40,45,或50(优选的20)碱基对核苷酸部分在序列上等同于选自含有下述序列的组的核苷酸序列的分别连续的20,25,30,35,40,45,或50(优选的20)碱基对核苷酸部分：SEQ ID NO:1的569-979核苷酸SEQ ID NO:1的1045-2334核苷酸，SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,和SEQ ID NO:14，其中上述核酸分子表达产生至少一种有抗害虫活性的毒素。

本发明也提供了一个嵌合基因，其包括有效的连接于本发明的核酸分子的异源启动子序列。另外，本发明提供了含有此嵌合基因的重组载体。进一步，本发明提供了一个含有该嵌合基因的宿主细胞。根据本发明的这个方面，宿主细胞可以是一个细菌细胞，一个酵母细胞，或者一个植物细胞，优选的是植物细胞。更进一步，本发明提供了含有这个植物细胞的植物。优选的植物为玉米。

在另一方面，本发明提供了由本发明DNA分子表达产生的毒素。根据优选的实施方案，本发明的毒素具有抗小菜蛾的活性。

在一个实施方案中，毒素由命名为NRRL保藏号为B-21883的大肠杆菌(E.coli)菌株产生。

在另一个实施方案中，本发明的毒素含有选自包括SEQ ID NO:2,3,5,7,9,11,13,以及15的组的氨基酸序列。

本发明也提供了一种组合物，其含有杀虫有效量的本发明的毒素。在另一方面，本发明提供了一种产生有抗昆虫活性的毒素的方法，包括：(a)获得含有一个嵌合基因的宿主细胞，嵌合基因本身含有一段与本发明的核酸分子有效连接的异源启动子序列；以及(b)核酸分子在细胞中表达，其产生至少一种有效抗昆虫的毒素。

进一步，本发明提供一种产生抗昆虫植物的方法，包括导入本发明的核酸分子到植物中，其中的核酸分子在植物中以对防治昆虫的有效量进行表达。根据优选的实施方案，昆虫为小菜蛾。

进一步的，本发明提供了一种防治昆虫的方法，包括向昆虫给药有效量的本发明的毒素。在一个优选的实施方案中，昆虫为小菜蛾。优选地，毒素口服给药于昆虫。

本发明的另一方面，提供了诱变本发明的核酸分子的方法，其中的核酸分子被切割成所需大小的双链随机片段的群体，包括：(a)加入双链随机片段群一个或多个单或双链寡核苷酸，其中的寡核苷酸各含有一个与双链模板多核苷酸同一性的区域以及一个异源区域；(b)使产生的双链随机片段与寡核苷酸的混合物变性为单链片段；(c)用聚合酶培育产生的单链片段群，其在导致在同一性区域的单链片段退火形成退火片段配对的条件下进行，该同一性区对于一个对中的一个成员启动另一个的复制是充分的，因此形成一个诱变的双链多核苷酸；以及(d)重复第二和第三步至少2个进一步的循环，其中在进一步循环的第二步中所得的混合物包括上一个循环中第三步中的诱变的双链多核苷酸，并且其中在进一步的循环中形成进一步诱变的双链多核苷酸。

本发明的其它方面以及优点对于本领域的技术人员来说通过发明的说明书以及非限制实施例将变得更加清楚。

定义

本发明毒素的“活性”是指毒素作为口服活性昆虫防治剂，有毒效，或能够中断或制止昆虫的进食，其可能会或可能不会引起昆虫的死亡。当本发明的毒素给药于昆虫时，结果典型地为昆虫死亡，或昆虫不进食使得毒素对昆虫可得到的来源。

“结合/有效连接”是指两个核酸序列是结构或功能上相关的。例如，如果两个序列是有效连接或位于某一位置，使得此调控DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，则该启动子或调控DNA序列被称为“结合”于编码RNA或蛋白的DNA序列。

“嵌合基因”是一个重组核酸序列，其中启动子或调控核酸序列是有效连接于或结合于一个编码mRNA或表达为蛋白质的核酸序列，从而此调控核酸序列能够调控被结合的核酸序列的转录或表达。嵌合基因的调控核酸序列在自然条件下通常不与被结合的核酸序列有效连接。

“编码序列”是一个被转录为RNA例如mRNA,rRNA,tRNA,snRNA,有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地，RNA然后在生物体中被翻译产生蛋白质。

“防治”昆虫是指通过毒素影响抑制害虫生存，生长，进食，和/或繁殖的能力，或降低农作物的与昆虫有关的损失。“防治”昆虫可意味或可能不意味杀死昆虫，尽管优选地指杀死昆虫。

“给药”一种毒素是指用毒素接触昆虫，产生毒效并且防治昆虫。毒素可以通过许多公认的方式给药，例如通过昆虫口服摄取或通过转基因植物表达，配制的蛋白组合物，可喷雾蛋白组合物，饵料基质，或任意其它的本领域公认的毒素给药系统来接触昆虫。

此处所用的“表达盒”是指一个能够在适当的宿主细胞中指导表达特定核苷酸序列的核酸序列，包括一个有效连接于与终止信号有效相连的目的核苷酸序列的启动子。其也典型地包括核苷酸序列合适翻译所需要的序列。包括目的核苷酸序列的表达盒可能是嵌合的，意味着至少其组分之一与其它组分的至少一种是异源的。表达盒也可能为自然产生的但以一种对异源表达有用的重组方式被获得。然而，典型地，表达盒与宿主是异源的，即，表达盒的特定的核酸序列在宿主细胞中并不天然的产生并且必须通过转化被导入宿主细胞或宿主细胞的祖先。表达盒中核苷酸序列的表达可在组成型或诱导型启动子的调控下进行，诱导型启动子只有当宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时才启动转录。在多细胞的生物中，例如植物中，启动子可以是对特定的组织，或器官，或发育阶段具有特异性。

“基因”是一个被定义的区域，其位于染色体组中并且除了上述的编码核酸序列外，包括其它的基本调节的，负责编码部分的转录和翻译的表达调控的核酸序列。一个基因也可包括其它的5’与3’非翻译序列和终止序列。可能存在的其它元件是例如内含子。

“目的基因”指任意基因，其被给药到植物中，赋予植物所期望的特征例如抗生素抗性，病毒抗性，昆虫抗性，疾病抗性，或其它害虫的抗性，除草剂耐性，改良的营养值，工业过程中改良的特性或改变的生殖能力。“目的基因”也可是被给药到植物中用于植物中商业上有价值的酶或代谢产物的生产的。

“异源”核酸序列是一个与其被导入的宿主细胞不是天然结合的核酸序列，包括天然产生的核酸序列的非天然产生的多拷贝。

“同源”核酸序列是一个与其被导入的宿主细胞天然结合的核酸序列。

“同源重组”是同源核酸分子间的核酸片段的相互交换。

“杀虫的”被定义为能够防治昆虫优选通过杀死昆虫的毒性的生物活性。

当核酸序列编码的多肽与所引用的核酸序列编码的多肽具有相同的氨基酸序列时，核酸序列与所引用的核酸序列“同类编码”。

“分离的”核酸分子或分离的酶是一个核酸分子或酶，其通过人工从其天然环境中脱离而存在并因此并非是天然产物。分离的核酸或酶可以以纯化了的形式存在或存在于非天然的环境中，例如，一个重组宿主细胞中。

“核酸分子”或 “核酸序列”是可从任意来源分离的单链或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明的上下文中，核酸分子优选为DNA的片段。

“ORF”是开放阅读框架。

“植物”是指在任意发育阶段的任意植物，特别是指种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理的一个单位，包括一个原生质体和一个细胞壁。植物细胞可以为分离的单细胞或一个培养的细胞的形式，或作为较高等有组织的单元例如，植物组织，植物器官，或整个植物的一部分。

“植物细胞培养”是指植物单位例如原生质体，细胞培养物细胞，植物组织中的细胞，花粉，花粉管，原卵，胚囊，合子，以及不同发育阶段的胚的培养。

“植物材料”是指花瓣，茎，根，花或花的部件，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细胞或组织培养物，或任意植物产物的其它部分。

“植物器官”是植物的显著的和明显的结构以及分化的部分，例如根，茎，叶，花芽，或胚。

此处所用的“植物组织”是指组成结构和功能单位的一组植物细胞。植物或栽培中的植物的任意组织被包括在内。此术语包括，但不限于，整个植物，植物器官，植物种子，组织培养物以及组成结构和/或功能单位的任意植物细胞组。此术语联合，或缺失上述的或以其它方式包含在此定义内的任何特定类型的植物组织的应用并不排除任意其它的植物组织类型。

“启动子”是编码区上游的非翻译DNA序列，其含有RNA聚合酶Ⅱ的连接位点并且启动DNA的转录。启动子区域也可包括其它充当基因表达调节子的元件。

“原生质体”是没有细胞壁或仅有部分细胞壁的分离的植物细胞。

“调控元件”是指涉及调控核苷酸序列表达的序列。调控元件含有一个与目的核苷酸序列有效相连的启动子以及终止信号。其也典型地包括核苷酸序列的合适翻译所需要的序列。

在最广义上，术语“基本上相似”当被用于指核苷酸序列时，是指一个对应于引用的核苷酸序列的核苷酸序列，其中对应的序列编码的多肽基本上与被所引用的核苷酸序列编码的多肽具有相同的结构和功能，例如，仅氨基酸的变化并不影响产生多肽的功能。理想的基本上相似的核苷酸序列编码由所引用的核苷酸序列编码的多肽。基本上相似的核苷酸序列与所引用的核苷酸序列之间的同一性的百分比理想地为至少为80％，更理想地至少为85％，优选为至少90％，较优选为至少95％，更优选的为至少99％。“基本上相似”于所引用的核苷酸序列的核苷酸序列在50℃ 7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5 M NaPO₄,1 mM EDTA中，在50℃用2×SSC,0.1％SDS洗涤杂交于所引用的核苷酸序列，较理想的在50℃ 7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5 M NaPO₄,1 mM EDTA中，在50℃用1×SSC,0.1％SDS洗涤杂交于所引用的核苷酸序列，更理想的在50℃ 7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5 M NaPO₄,1 mM EDTA中，在50℃用0.5×SSC,0.1％SDS洗涤杂交于所引用的核苷酸序列，优选的在50℃7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5 M NaPO₄,1 mM EDTA中，在50℃用0.1×SSC,0.1％SDS洗涤杂交于所引用的核苷酸序列，较优选的在50℃7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5 M NaPO₄,1 mMEDTA中，在65℃用0.1×SSC,0.1％SDS洗涤杂交于所引用的核苷酸序列。

“合成的”是指核苷酸序列含有并不在天然序列中存在的结构特征。例如，一个人工的具有更接近地类似的G+C含量以及双子叶和/或单子叶基因的正常密码子分布的序列被称为合成的。

“转化”是将异源核酸导入宿主细胞或生物的过程。特定地，“转化”指DNA分子稳定整合到目的生物的染色体组中。

“转化/转基因/重组”是指宿主生物例如细菌或植物被导入了异源核酸分子。核酸分子可被稳定地整合到宿主的染色体组中或核酸分子也可作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以自主复制。转化的细胞，组织，或植物可以理解不仅包含转化过程的终产物，而且包括其转基因的子代。“非转化的”，“非转基因的”， 或“非重组的”宿主是指不含有异源核酸分子的野生型的生物，例如，细菌或植物。

核苷酸通过下述标准的缩写的其碱基被显示：

腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶[T]，以及鸟嘌呤(G)。氨基酸同样通过下述标准的缩写被显示：丙氨酸(Ala；A)，精氨酸(Arg；R)，天冬酰胺(Asn；N)，天门冬氨酸(Asp；D)，半胱氨酸(Cys；C)，谷酰胺(GIn；Q)，谷氨酸(Glu；E)，甘氨酸(Gly；G)，组氨酸(His；H)，异亮氨酸(IIe；I)，亮氨酸(Leu；L)，赖氨酸(Lys；K)，甲硫氨酸(Met；M)，苯丙氨酸(Phe；F)，脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)，苏氨酸(Thr；T)，色氨酸(Trp；W)，酪氨酸(Tyr；Y)，以及缬氨酸(Val；V)。此外，(Xaa；X)代表任意的氨基酸。

序列表中的序列的简要描述

SEQ ID NO:1是包含在嗜线虫致病杆菌克隆pCIB9369中的大约3.0 kb DNA片段的序列，其在特定核苷酸位置含有下列ORF：

名称    起始    终点

orfi    569     979

orf2    1045    2334

SEQ ID NO:2为克隆pCIB9369的orf1编码的～15 kDa蛋白的序列。

SEQ ID NO:3为克隆pCIB9369的orf2编码的～47.7 kDa保幼激素酯酶样蛋白的序列。

SEQ ID NO:4为嗜线虫致病杆菌克隆pCIB9381的orf1的序列。

SEQ ID NO:5为克隆pCIB9381的orf1编码的蛋白的序列。

SEQ ID NO:6嗜线虫致病杆菌克隆pCIB9381的orf2的DNA序列。

SEQ ID NO:7为克隆pCIB9381的orf2编码的保幼激素酯酶样蛋白的序列。

SEQ ID NO:8为波氏致病杆菌克隆pCIB9354的orf1的DNA序列。

SEQ ID NO:9为克隆pCIB9354的orf1编码的蛋白的序列。

SEQ ID NO:10为波氏致病杆菌克隆pCIB9354的orf2的DNA序列。

SEQ ID NO:11为pCIB9354的orf2编码的保幼激素酯酶样蛋白的序列。

SEQ ID NO:12发光光杆状菌克隆pC1B9383-21的orf1的DNA序列。

SEQ ID NO:13为克隆pCIB9383-21的orf1编码的蛋白的序列。

SEQ ID NO:14为发光光杆状菌克隆pCIB9383-2的orf2的DNA序列。

SEQ ID NO:15为克隆pCIB9383-21的orf2编码的保幼激素样酯酶蛋白的序列。

保藏

下述的材料依照布达佩斯条约规定的用于专利程序目的的国际认可的微生物保藏，被保藏在Agricultural Research Service，专利培养物保藏中心(NRRL)，1815北方大学街，Peoria,Illinois61604。所有对保藏材料可得性的限制在被授予专利权的基础上将被不能变更的除去。

 克隆         登记号        保藏日期

pCIB9369    NRRL B-21883    1997,11月12

pCIB9354    NRRL B-30109    1999,2月25

pCIB9381    NRRL B-30110    1999,2月25

pCIB9383-21 NRRL B-30111    1999,2月25

其表达产生杀虫毒素的新的核酸序列

本发明涉及表达产生新的毒素的核苷酸序列，并且涉及防治害虫的毒素的生产和使用。核苷酸序列从嗜线虫致病杆菌，波氏致病杆菌以及发光光杆状菌，肠杆菌家族的成员中分离到。致病杆菌是Steinemema属线虫的共生菌。光杆菌属是Heterorhabditis属线虫的共生菌。线虫定居于昆虫的幼虫中，将其杀死，并且它们的后代以死幼虫为食。杀昆虫剂活性实际上由共生的致病杆菌与光杆菌属菌产生。发明人是第一个分离出本发明核酸序列的人。本发明的核酸序列的表达产生了可以用于防治鳞翅目昆虫例如小菜蛾(菱形斑纹蛾)的毒素。

克隆pCIB9369中的本发明的核酸序列特征为大约3.0 kb的DNA片段，其依照专利保藏的布达佩斯条约以登记号为NRRL B-21883保藏。此DNA片段的序列存在于SEQ ID NO:1中。两个开放阅读框架(ORF)存在于SEQ ID NO:1中(分别为核苷酸569-979以及核苷酸1045-2334)，编码预测大小为15 kDa和47.7 kDa的蛋白(分别为SEQ ID NO:2和3)。该两个ORF被排列在一个操纵子样结构中。通过使用UWGCG Blast和Gap program对与每一ORF显示同源的已知序列的研究并未显示出任何的与ORF#1有效的匹配并且显示出ORF#2与苏云金芽孢杆菌cry3A蛋白之间21％的同一性，其在本领域被认为是不显著的。通过Blast program进行的对pCIB9369的ORF#2编码的蛋白的Gap分析表明与保幼激素酯酶相关蛋白有30.6％AA同一性和44.1％AA相似性(GenBank登记号2921553；Henikoff等.，PNAS USA 89:10915-10919(1992))。本发明的核苷酸序列也与已知的编码杀虫毒素toxb4的嗜线虫致病杆菌序列(WO 95/00647)进行了比较，但是没有发现显著的同源性。3.0 kb DNA片段也与公开在WO98/08388的核苷酸序列进行了比较。使用UWGCG Gap program,22个来自描述在WO 98/08388的38.2 kb DNA片段的各60个核苷酸(60-mers)的序列被比较于本发明3.0 kb DNA片段。在38.2 kb DNA片段的碱基1处开始的第一60-mer核苷酸序列而其它60-mers的核苷酸序列位于大约有2.0 kb的间隔。22个序列中的每一个及其互补序列被检测。本发明3.0 kb DNA片段与这些60-mers的一个之间的同一性的最高百分比为53％，其并非显著的同源。此外，38.2 kb序列的5个不同DNA片段通过Southern印迹分析与本发明的3.0 kb片段杂交被检测。没有阳性的杂交信号出现。

pCIB9381，pCIB9354，以及pCIB9383-21的核苷酸序列在每一个克隆中也显示出两个开放阅读框架。在pCIB9381和pCIB9383-21中的两个ORF的核苷酸序列与pCIB9369中的有较高的同源性。因此，pCIB9381和pCIB9383-21的ORF#2蛋白与pCIB9369的ORF#2蛋白一样与保幼激素酯酶相关蛋白有基本上相同的同源性。pCIB9354的ORF#1的核苷酸序列与pCIB9369的ORF#1的核苷酸序列有77％的同一性，并且pCIB9354的ORF#2的核苷酸序列与pCIB9369的ORF#2的核苷酸序列有79％的同一性。pCIB9354的ORF#2蛋白也具有与保幼激素酯酶-相关的蛋白的同源性(29.2％AA同一性与42.2％AA相似性)。

在一个优选的实施方案中，发明包括一个基本上相似于SEQ IDNO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14的核苷酸序列，其表达产生一种杀虫毒素。本发明也包括一个含有本发明的核酸序列的重组载体。在该载体中，核酸序列优选包含在含有调控元件的表达盒中，其中的调控元件用于在能够表达核苷酸序列的宿主细胞中的核苷酸序列的表达。此调控元件通常含有启动子和终止信号且优选含有允许由本发明的核酸序列编码的多肽有效翻译的元件。含有核酸序列的载体通常能够在特定宿主细胞中复制，优选的为染色体外分子，并且因此被用在宿主细胞中扩增本发明的核酸序列。在一个实施方案中，用于此载体的宿主细胞为微生物，例如细菌，特别的为E.coli。在另一个实施例中，此重组载体的宿主细胞为内寄生菌或体表寄生菌。此载体的优选宿主细胞为真核细胞，例如酵母，植物细胞，或昆虫细胞。植物细胞例如玉米细胞为最优选的细胞，在另一个优选的实施方案中，此载体为病毒载体并被用于特定的宿主细胞中的核苷酸序列的复制，例如昆虫细胞或植物细胞中。重组载体也用于转化本发明的核苷酸序列到宿主细胞中，由此核苷酸序列被稳定地整合到宿主细胞的DNA中。在一个实施方案中，宿主细胞为原核细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如酵母细胞，昆虫细胞，或植物细胞。在一个最优选的实施方案中，宿主细胞为植物细胞，例如玉米细胞。

本发明的核苷酸可通过下面描述的实施方案中的技术被分离，或用描述在序列表中的序列作为基础构建PCR引物进行PCR来分离。例如，具有SEQ ID NO:1的orf1的大约第一个和最后20-25个连续核苷酸的序列的寡核苷酸(例如.，SEQ ID NO:1的核苷酸569-588和核苷酸957-976)可被用作PCR引物来扩增直接来自来源菌株(嗜线虫致病杆菌菌株ATCC 19061)的orf1编码序列(SEQ ID NO:1的核苷酸569-976)。本发明的其它基因序列同样地也可通过用描述于序列表的编码序列的末端作为PCR引物的基础从各自的来源菌株被PCR扩增。

在另一个优选的实施方案中，杀虫毒素含有至少一种由本发明的核苷酸序列编码的多肽。根据本发明的杀虫毒素的分子量通过大小分级实验测得大于6000。在用蛋白酶K处理后，在昆虫生物鉴定中仅观察到极微小的杀虫生物活性的减少，此表明杀虫毒素对蛋白酶K处理基本上是有抗性的。杀虫毒素在22℃或4℃贮藏2周后保持其杀虫活性。在被冻干且22℃贮藏2周后仍保持其杀虫活性。杀虫毒素在60℃温育5分钟后仍然具有活性，但是其在100℃或80℃温育5分钟后失去了杀虫活性。

在进一步的实施方案中，本发明的核苷酸序列可通过在已知的体外重组或DNA改组技术中引入随机突变被修饰。此技术被描述在Stemmer等人.，Nature 370:389-391(1994)以及US专利5,605,793上，其引入本发明作为参考。无数的核苷酸序列的突变拷贝在本发明的起始核苷酸序列的基础上产生，带有改良特性例如增加杀虫活性，增强稳定性，或不同的目标害虫的特异性或范围的变体被回复。该方法包括从含有本发明的核苷酸序列的模板双链多核苷酸形成一个诱变的双链多核苷酸，其中的模板双链多核苷酸被切割成所期望大小的双链随机片段，并且包括加入一或多种单链或双链寡核苷酸到双链随机片段的所得的群体中的步骤，其中所述的寡核苷酸含有一个与双链模板多核苷酸相同性的区域和一个异源的区域；变性产生的双链随机片段与寡核苷酸的混合物成单链片段；在导致所述单链片段在所述的相同性区域退火的条件下用聚合酶温育单链片段的生成群体形成退火片段的配对，所述的相同性区域对于一个配对的一个成员启动另一个的复制是足够的，因此形成了一个诱变的双链多核苷酸；以及重复第二和第三步骤至少2个进一步循环，其中进一步循环的第二步生成的混合物包括上一个循环的第三步生成的诱变的双链多核苷酸，并且进一步的循环生成形成进一步诱变双链多核苷酸。在一个优选的实施方案中，单种双链随机片段在双链随机片段的群体中的浓度少于总DNA重的1％。在一个进一步的实施方案中，模板双链多核苷酸含有至少100种多核苷酸，在另一个优选的实施方案中，双链随机片段的大小为从5 bp到5 kb。在一个进一步优选的实施方案中，该方法的第四步包括重复第二和第三步至少10个循环。

核苷酸序列在异源微生物宿主中的表达

作为生物昆虫防治剂，杀虫毒素通过核苷酸序列在能够表达核苷酸的异源宿主细胞中的表达被产生。在第一个实施方案中，在其染色体中含有至少一个本发明核苷酸序列的修饰的嗜线虫致病杆菌，波氏致病杆菌或发光光杆状菌细胞被描述。这些修饰包括已存在的调控元件的突变或缺失，其导致核苷酸序列的改变的表达，或调控核苷酸序列表达的新调控元件的插入。在另一个实施方案中，通过插入到染色体中或通过导入含有核苷酸序列的染色体外复制分子，一个或多个核苷酸序列的额外的拷贝被加到嗜线虫致病杆菌，波氏致病杆菌，或发光光杆状菌中。

在另一个实施方案中，至少一个本发明的核苷酸序列被插到适当的含有一个启动子和终止信号的表达盒中。核苷酸序列的表达是连续的，或一个对不同类型的刺激应答来启动转录的诱导启动子被使用。在一个优选的实施方案中，在其中毒素被表达的细胞是一种微生物，例如为一种病毒，一种细菌，或一种真菌。在一个优选的实施方案中，病毒例如杆状病毒，在其染色体组中含有一个本发明的核苷酸序列并且在感染适当的适于病毒复制与核苷酸序列表达的真核细胞后表达大量的相应的杀虫毒素。杀虫毒素因此被生产用作杀虫剂。或者，被基因改造含有核苷酸序列的杆状病毒被用于体内感染昆虫并通过杀虫毒素的表达或通过病毒感染与杀虫毒素的联合将其杀死。

细菌细胞也可为本发明的核苷酸序列表达的宿主。在一个优选的实施方案中，使用非致病共生菌，其能够在植物组织中生存和复制，所谓内寄生菌，或非致病共生菌，其能够定居于叶际或根际，所谓体表寄生菌。这种细菌包括土壤杆菌属，产碱菌属，固氮螺菌属，固氮菌类，芽胞杆菌属，棍状杆菌属，肠杆菌属，欧文氏菌属，产黄菌属，克雷伯氏菌属，假单胞菌属，根瘤菌属，沙雷氏菌属，链霉菌属以及黄单胞杆菌属。共生真菌，例如木霉属和粘帚霉属也是本发明核苷酸序列用于相同目的的表达的可能的宿主。

这些遗传操作技术对于不同的宿主是特异性的并且为被领域技术人员所公知。例如表达载体pKK223-3和pKK223-2可被用于在E.coli中的转录或翻译融合来表达在tac或trc启动子后面的异源基因。为了编码多ORF的操纵子的表达，最简单的方法是在转录融合中插入操纵子到载体例如pKK223-3中，允许异源基因的关联核糖体结合位点被使用。革兰氏阳性菌例如芽胞杆菌属中的过量表达技术也是本领域公知的且可被用于本发明的上下文中(Quax等.在.：工业微生物：基础和应用分子遗传学，Eds.Baltz等.，American Society forMicrobiology，华盛顿(1993))。过量表达的可选择的系统依赖于例如酵母载体以及包括应用Pichia，酵母属和克鲁维酵母菌属(Sreekrishna, 在.：工业微生物：基础和应用分子遗传学，Baltz,Hegeman,以及Skatrud eds.,American Society for Microbiology,华盛顿(1993)；Dequin & Barre,生物技术12:173-177(1994)；vanden Berg等，生物技术8:135-139(1990))。

在另一个优选的实施方案中，至少一个被描述的核苷酸序列被给药到并表达在具有生物防治特性的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株CGA267356(描述在EU 0 472 494以及WO94/01561上)中，在另一个优选的实施例中，本发明的一个核苷酸序列被给药到也具有生物防治特性的致金色假单胞菌(Pseudomonasaureofaciens)  菌株30-84中。在异源生物防治菌株中的表达要求筛选适于在所选择的宿主中复制的载体以及选择合适的启动子。在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及真菌中表达的技术是本领域公知的。

核苷酸序列在植物组织中的表达

在一个特定的优选的实施方案中，至少本发明的一种杀虫毒素在一种较为高等的生物体内表达，例如在植物内。在这种情况下，表达了有效量的毒素的转基因植物保护其本身不受害虫的影响。当害虫开始以此转基因植物为食时，其也摄取了表达的毒素。此将阻止昆虫进一步咬入植物组织或可能甚至伤害或杀死此昆虫。本发明的核苷酸被插入到表达盒中，其优选的稳定的整合到所述植物的染色体组中。在另一个优选的实施例中，核苷酸序列包含在非致病性自我复制病毒中。按本发明转化的植物可为单子叶或双子叶植物以及包括，但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甜马铃薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，卷心菜，菜花，花椰菜，萝卜，小萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，辣椒，芹菜，南瓜属植物，南瓜，大麻，西葫芦，苹果，梨，quince，甜瓜，李子，樱桃，桃子，蜜桃，杏子，草莓，葡萄，红莓，黑莓，菠萝，鳄梨，番木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，油菜籽，红花草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，水稻，马铃薯，茄子，黄瓜，Arabidopsis，以及木本植物例如松柏目的和落叶目的树。

所期望的核苷酸序列一旦被转化到特定的植物种中，其可以在此种中增殖或迁移到相同种的其它变种中，特别包括通过常规的育种技术的商用的变种。

本发明的核苷酸序列优选地在转基因植物中表达，因此引起相关的毒素在转基因植物中的生物合成。这样，产生了带有增强的昆虫抗性的转基因植物。为了在转基因植物中表达，本发明的核苷酸序列可能需要修饰和优化。尽管在许多情况下，来自微生物的未被修饰的基因在植物中以高水平表达，转基因植物中的低表达可能由于微生物的具有在植物中是非优选的密码子的核苷酸序列。本领域公知所有生物都具有密码子使用的特定偏好，且本发明的核苷酸序列的密码子可被改变以符合植物偏好，而保持被编码的氨基酸。此外，在植物中的高表达最好获自至少GC含量为大约35％，优选大于45％，更优选的大于50％，以及最优选的大于60％的编码序列。具有低GC含量的微生物核苷酸序列在植物中不良表达是由于去稳定信使的ATTTA基序，以及可能引起不适当的多腺苷酸化的AATAAA基序的存在。尽管优选的基因序列可能在单子叶植物和双子叶植物种中充分表达，序列可被修饰来满足单子叶植物和双子叶植物特异性密码子偏好与GC含量偏好，这些参数选择已被显示是不同的(Murray等。核酸研究。17:477-498(1989))。此外，核苷酸被筛查可引起信使平截的不正常剪接位点的存在。所有需要的核苷酸序列中的改变例如上述的改变通过利用已知的定点诱变，PCR，以及利用描述在公开的专利申请EP 0 385 962(Monsanto),EP 0 359 472(Lubrizol,与WO 93/07278(Ciba-Geigy)上的方法的合成基因构建物的技术来产生。

为了有效的启动翻译，邻接于初始甲硫氨酸的序列需要被修饰。例如，可通过含有在植物中有效的已知序列被修饰。Joshi提出了一个对植物合适的共有区(NAR 15:6643-6653(1987))以及Clontech提出了进一步的共有区翻译起始密码子(1993/1994 catalog,210页)。这些共有区适合与本发明的核苷酸序列一起使用。该序列被合并到含有该核苷酸序列的构建物中，直到并包含ATG(同时让第二氨基酸未被修饰)，或可选择地，直到并包含ATG之后的GTC(带有修饰转基因的第二氨基酸的可能性)。

核苷酸序列在转基因植物中的表达被在植物中起作用的启动子驱动。启动子的选择将随着表达时间和地点的要求以及目标物种而变化。因此，本发明核苷酸序列优选在叶中，在穗中，在花序(例如.穗状花序，圆锥花序，穗轴，等等。)中，在根中，和/或苗中进行表达。在许多情况下，然而，需要抗不止一种类型的害虫的保护，且因此在多种组织中表达是所期望的。尽管许多来自双子叶植物的启动子在单子叶植物表现出是有效的且反之亦然，理想的，双子叶植物的启动子被筛选用于在双子叶植物中表达，单子叶植物的启动子被筛选用于在单子叶植物中表达。然而，对所筛选的启动子的起源来源没有限制；只要能在所需细胞中有效的驱动核苷酸序列的表达便足够了。

优选组成型表达的启动子包括来自编码肌动蛋白或泛素的启动子以及CaMV 35S和19S启动子。本发明的核苷酸序列可在以化学方法调控的启动子的调控下表达。这使得杀虫毒素仅在当农作物用诱导化学药剂处理时能够被合成。优选的基因表达化学诱导的技术具体描述在申请EP 0 332 104(Ciba-Geigy)以及US专利5,614,395上。优选的化学诱导的启动子为烟草PR-1a启动子。

优选的一类启动子是伤口诱导型的。无数被描述的启动子在伤口位置表达也在致植物病菌的感染位点局部表达。理想地，这样的启动子将只在感染的位点局部有效，并且通过此方式杀虫毒素仅积累在需要合成杀虫毒素来杀死入侵害虫的细胞中。这种类型优选的启动子包括那些由Stanford等人。Mol.Gen.Genet.215:200-208(1989),Xu等人，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)22:573-588(1993),Logemann等人植物细胞1:151-158(1989),Rohrmeier & Lehle,植物分子生物学22:783-792(1993),Firek等人，植物分子生物学，22:129-142(1993)，以及Warner等人，Plant J.3:191-201(1993)描述的启动子。

优选的组织特异性表达模式包括绿色组织特异性，根特异性，茎特异性，以及花特异性。适于在绿色组织表达的启动子包括许多调节与光合作用有关的基因的启动子和许多从单子叶植物与双子叶植物中克隆的启动子。优选的启动子为来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth & Grula，植物分子生物学12:579-589(1989))。优选的根特异性表达的启动子被de Framond(FEBS 290:103-106(1991)；EP 0 452 269(Ciba-Geigy)所描述。优选的茎特异性启动子被描述在US专利5,625,136(Ciba-Geigy)上且启动玉米trpA基因的表达。

本发明特别优选的实施方案为以根优选的或根特异性方式表达至少一个本发明核苷酸序列的转基因植物。进一步优选的实施方案为以创伤诱导性或以感染诱导性的方式表达核苷酸序列的转基因植物。

除了筛选合适的启动子外，在植物中表达杀虫毒素的构建物需要一个适当的转录终止子，其在异源核苷酸序列的下游连接。几个这种终止子可以被获得并为技术人员所公知(例如来自CaMV的tml，来自rbcS的E9)。任何已知其在植物中有功能的可得终止子可被用于本发明的上下文中。

其他数目众多的序列可被合并到本发明所描述的表达盒中。这些包括已被显示增强表达的序列例如内含子序列(例如：来自Adh 1与bronze 1)以及病毒前导序列(例如来自TMV,MCMV和AMV)。

本发明核苷酸序列的靶向表达到植物中的不同细胞位点将是优选的。在一些情况下，在细胞溶胶中的定位将是期望的，然而在其它的情况下，在一些亚细胞器中定位将是优选的。通过本领域公知的技术来进行编码酶的转基因的亚细胞定位。典型的，编码来自一个已知的细胞器靶基因产物的目的肽的DNA是被操纵和融合在核苷酸序列的上游。已知许多这样的叶绿体的靶序列及其在异源构建物的功能已被显示。本发明核苷酸序列的表达也靶向于宿主细胞的内质网或液泡。达到此目的的技术是本领域所公知的。

合适的用于植物转化的载体被描述于本说明书的其它地方。为了土壤杆菌属介导的转化，二元载体或携带至少一个T-DNA边缘序列的载体是合适的，然而对于直接基因给药，任意的载体是合适的并且仅含有目的构建物的线性DNA将是优选的。在直接的基因给药的情况下，单DNA种转化或共转化可被使用(Schocher等人，生物技术4:1093-1096(1986))。为了直接基因转化和土壤杆菌属介导的转化，转化通常(但非必要地)用可提供对抗生素(卡那霉素，潮霉素或甲氨蝶呤)抗性或除草剂(basta)抗性的可筛选的标记。这种标记的实施例为新霉素转磷酸酶，潮霉素磷酸转移酶，二氢叶酸盐还原酶，膦丝菌素乙酰转移酶，2,2-二氯丙酸脱卤素酶乙酰氧肟酸合成酶，5-enolpyruvyl-shikimate-磷酸合酶，芳香基腈盐水解酶，原卟啉原氧化酶，乙酰基辅酶A羧酶，dihydropteroate合酶，氯霉素乙酰基转移酶，以及β-葡萄糖醛酸酶。然而用于植物的可选择的或可筛选的标记的选择并非本发明的关键。

上述的重组DNA可通过本领域所公知的方式被导入植物细胞中。本领域的技术人员可以理解方法的选择依赖于被转化的目的植物的类型。合适的转化植物细胞的方法包括微注射(Crossway等人.，生物技术4:320-334(1986))，电穿孔(Riggs等人.，Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 83:5602-5606(1986),土壤杆菌属介导的转化(Hinchee等人.，生物技术6:915-921(1988)；也参见，Ish ida等人.，自然生物技术14:745-750(六月1996)用于玉米转化)，直接的基因转移(Paszkowski等人.，EMBO J 3.2717-2722(1984)；Hayashimoto等人，植物生理.93:857-863(1990)(水稻))，以及利用从Agracetus,Inc.,Madison,Wisconsin和Dupont,Inc.,Wilmington,Delaware获得的装置的弹道粒子加速(参见，例如，Sanford等人.，U.S.专利4,945,050；以及McCabe等人.，生物技术6.923-926(1988)).也参见，Weissinger等人，Annual Rev.Genet.22:421-477(1988)；Sanford等人.，微粒科学和技术5:27-37 91987)(洋葱)；Svab等人.,Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 87:8526-8530(1990)(烟草叶绿体)；Christou等人.，植物生理.87:671-674(1988)(黄豆)；McCabe等人.，生物技术6:923-926(1988)(黄豆)；Klein等人.，Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA,85:4305-4309(1988)(玉米)；Klein等人，生物技术6:559-563(1988)(玉米)；Klein等人.，植物生理.91:440-444(1988)(玉米)；Fromm等人.，生物/技术8:833-839(1990)；以及Gordon-Kamm等人.，植物细胞2:603-618(1990)(玉米)；Koziel等人.，生物技术11:194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等人，自然338:274-277(1989)(水稻)；Christou等人，生物技术9:957-962(1991)(水稻)；Datta等人.，生物/技术8:736-740(1990)(水稻)；欧洲专利申请EP 0 332 581(果园草与其它的Pooideae)；Vasil等人，生物技术11:1553-1558(1993)(小麦)；Weeks等人.，植物生理102:1077-1084(1993)(小麦)；Wan等人，植物生理.104:37-48(1994)(大麦)；Jahne等人.，Theor.AppⅠ.GeneL 89:525-533(1994)(大麦)；Umbeck等人，生物/技术5:263-266(1987)(棉花)；Casas等人.，Proc.NatL Acad.Sci.USA90:11212-11216(Dec.1993)(sorghum)；Somers等人，生物技术10:1589-1594(Dec.1992)(燕麦)；Torbert等，Plant Cell Reports14:635-640(1995)(燕麦)；Week等，Plant Physiol.102:1077-1084(1993)(小麦)；Chang等，WO 94/13822(小麦)以及Nehra等，ThePlant Journal 5.285-297(1994)(小麦)。一系列通过微粒轰击将重组DNA分子导入到玉米中的尤其优选实施例可在Koziel等，Biotechnology 11:194-200 (1993)，Hill等，Euphytica85:119-123(1995)以及Koziel等，Annals of the New YorkAcademy of Sciences 792:164-171(1996)中找到。另外的优选实施方案为如EP 0 292 435的用于玉米的原生质体转化的方法。植物的转化可用单DNA种或多DNA种来进行(例如.共转化)并且这两种技术适用于过氧化物酶编码序列。

在另一个优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列被直接导入到质体染色体组中。质体转化的主要优点是质体通常能够表达没有实质性修饰的细菌基因且质体能够表达在单启动子的调控下表达多重开放阅读框架。质体转化技术被广泛地描述在U.S.专利No.5,451,513,5,545,817,和5,545,818,PCT申请WO 95/16783，和在McBride等人(1994)Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 91,7301-7305上。叶绿粒转化的基本技术包括导入侧接于一个与目的基因相联的筛选标记克隆质体DNA的区域到一个合适的靶组织中，例如利用biolistics或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)。1到1.5 kb旁侧区，称为靶序列，促进了与质体染色体组的同源重组且因此允许原质体系的特异性区域的替换或修饰。最初，叶绿体16S rRNA和rpsl 2基因中的赋予了对大观霉素和/或链霉素的抗性的点突变被用作转化的可选择性标记(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.,与Maliga,P.(1990)Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 87,8526-8530；Staub,J.M.，以及Maliga,P.(1992)Plant Cell 4,39-45)。其以每100被轰击的靶叶中约产生1个的频率产生稳定的同质转化体。这些标记间克隆位点的存在允许外源基因导入的质体靶载体的产生(Staub,J.M.,与Maliga,P.(1993)EMBO J 12,601-606)。通过用编码大观霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺嘌呤转移酶(Svab,Z.,and Maliga,P.(1993)Proc.NatL Acad.Sci.USA 90,913-917)的细菌aadA基因显性选择标记替换隐性的rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因，转化频率获得了大幅度的提高。以前，这种标记被成功的用于绿藻Chiamydomonas reinhardtii(Goldschmidt-Clermont,M.(1991)NucL Acids Res.19:4083-4089)的质体染色体组的高频率转化。其它的用于质体转化的选择标记为本领域所公知且包含在本发明的范围内。典型的，需要转化后大约15-20个的细胞分裂周期以达到一种同质体状态。其基因通过同源重组被插入到所有存在于每个植物细胞中的环状质体染色体组的几千个拷贝中的质体表达利用超过核表达基因的巨大的拷贝数的优点来允许表达水平可以轻易超过总可溶解的植物蛋白的10％。在一个优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列被插入到一个质体靶载体中以及被转化到目的植物宿主的质体基因组中。含有本发明核苷酸序列的质体基因组的植物同型体(homoplastic)被获得，并且偏向能够高效表达核苷酸序列。

杀虫剂组合物的制剂

本发明也包括含有至少一种本发明的杀虫毒素的组合物。为了有效的防治昆虫，此组合物优选含有足量的毒素。这些量随着被保护的农作物，特异性目的害虫，环境条件，例如湿度，温度或土壤类型而变化。在一个优选的实施方案中，含有杀虫毒素的组合物包括表达没有额外纯化的毒素的宿主细胞。在另一个优选的实施方案中，表达杀虫毒素的细胞在其被用作杀虫剂之前被冻干。在另一个实施方案中，杀虫毒素被改造从细胞宿主中分泌出来。在一些从宿主细胞中表达的毒素被纯化是所希望的情况下，杀虫毒素的不同程度的纯化被达到。

本发明进一步包括含有至少一种本发明杀虫毒素的组合物的制剂，其被均匀与此处所述的一种或多种化合物或化合物组混合。本发明也涉及处理植物的方法，其包括将杀虫毒素或含有杀虫毒素的组合物应用于植物。杀虫毒素可以被以组合物的形式应用于农作物地区或应用于已被用其它的化合物同时或连续处理的植物。这些化合物可以是肥料或微量营养素供体或其它的影响植物生长的制剂。它们也可以是选择性的除草剂，杀虫剂，杀真菌剂，杀菌剂，杀线虫剂，软体动物灭杀剂，或几种这些制剂的混合物，如果需要，与其它的本领域常规的载体，表面活性剂或应用促进佐剂一起联合使用。合适的载体和佐剂可为固体或液体以及与配制工艺有关的常规的物质，例如天然的或再生矿物质，溶剂，分散剂，湿润剂，增粘剂，粘合剂或肥料。

优选的本发明杀虫毒素应用的方法是通过向寄生害虫的例如土壤，水，或植物的叶子等的环境中喷洒。应用的数目和比率依赖于被害虫感染的类型和强度。杀虫毒素用液体组合物灌输到植物场所经由土壤(系统作用)通过根部渗透到植物中，或通过将固体的形式例如颗粒的形式的化合物应用到土壤中(土壤应用)。杀虫毒素可通过用含有杀虫毒素的液体制剂灌输到种子(包被)，或用固体制剂涂布到种子的方式应用于种子。在特殊的情况下，其它类型的应用也是可能的，例如选择性处理植物的茎或芽。杀虫毒素也可以被提供作为诱饵置于上层或下层的土壤。

杀虫毒素以未修饰的形式使用或者，优选的，与本制剂领域的常规的佐剂一起联合使用，并以已知的方式配成可乳化的浓缩物，可包被的糊剂，直接喷洒或稀释的溶液，稀释乳剂，可湿性粉剂，可溶性粉剂，粉剂，颗粒剂，并且也可以包被，例如在聚合物中。如同组合物一样，应用的方法例如喷雾，粉化，撒布，扩散或浇注依据所计划的目标和主要的环境来选择。

含有杀虫毒素以及必要时的固体或液体的佐剂的制剂，组合物或制剂，通过已知的方式被配制，例如通过均匀混合和/或研磨杀虫毒素与增量剂，例如溶剂，固体载体以及适当的表面活性物质(表面活性剂)。

合适的溶剂包括芳香烃，优选为含有8到12个碳原子的级分，例如，二甲苯混合物或取代的萘，邻苯二甲酸酯如二丁基邻苯二甲酸酯或二辛基邻苯二甲酸酯，脂肪族烃例如环己烷或石蜡烃，醇和乙二醇及其醚和酯，例如乙醇，乙烯一甲基乙二醇或一乙基醚，酮例如环己酮，强极性溶剂例如N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基亚砜或二甲基甲酰胺，以及环氧植物油类例如环氧化椰子油或大豆油或水。

所用的固体载体例如用于粉剂和可分散的粉剂，通常是天然的矿物填料例如方解石，滑石，高岭土，蒙脱石或attapulgite。为了增加物质的性能，也可能加入高分散的硅酸或高分散的吸收聚合物。合适的颗粒状吸附载体是多孔型的，例如浮石，碎砖，海泡石或皂粘土；且合适的非吸附载体为例如方解石或沙子。此外，大量的无机或有机性质的颗粒状物质可被使用，例如，特别是白云石或粉状植物残渣。    合适的表面活性化合物为具有优良的乳化，分散和润湿特性的非离子型，阳离子和/或阴离子表面活性剂。术语“表面活性剂”也可理解为包括表面活性剂的混合物。合适的阴离子表面活性剂可以是水溶性的肥皂和水溶性的合成的表面活性化合物。

合适的肥皂为高等脂肪酸(10到22个碳原子的链)碱金属盐，碱土金属盐或非取代的或取代的铵盐，例如油酸或硬脂酸或可从例如椰子油或动物油中获得的天然脂肪酸混合物的钠或钾盐。脂肪甲基牛磺酸盐也可被使用。

然而，更经常的，使用所谓合成的表面活性剂，特别的脂肪磺酸盐，脂肪硫酸盐，磺化苯并咪唑衍生物或烷基芳香基磺酸盐。

脂肪磺酸盐或硫酸盐通常为碱金属盐，碱土金属盐或非取代的或取代的铵盐以及具有8到22个碳的包括烷基的烷基部分的烷基的形式，例如，木质素磺酸的，十二烷基硫酸的或从天然脂肪酸中获得的脂肪醇硫酸盐混合物的钠盐或钙盐。这些化合物也包括硫酸酯的盐和脂肪醇/环氧乙烷加成物的磺酸的盐。磺化苯并咪唑衍生物优选含有2个磺酸基团和一个含有8到22个碳原子的脂肪酸基。烷基芳基磺酸盐的实施例为十二烷基苯磺酸，二丁基萘磺酸，或萘磺酸/甲醛缩合产物的钠，钙或三乙醇胺盐。也合适的是对应的磷酸盐，例如带有4到14个环氧乙烷的p-壬基苯酚加成物的磷酸酯的盐。

非离子表面活性剂优选为脂肪族或环状脂肪醇，饱和的或不饱和的脂肪酸以及烷基苯酚的聚乙二醇醚衍生物，所述的衍生物含有3到30个乙二醇醚基团以及8到20个碳原子在(脂肪族的)烃部分以及6到18碳原子在烷基苯酚的烷基部分。

进一步合适的非离子表面活性剂为聚环氧乙烷与聚丙二醇，乙二胺基丙二醇与烷基聚丙二醇的水溶性加成物，其中的烷基聚丙二醇的烷基链中含有1到10个碳原子，其加成化合物含有20到250个乙二醇醚基团和10到100个丙二醇醚基团。这些化合物通常每个丙二醇单元含有1到5个乙二醇单元。

非离子表面活性剂的典型例子是壬基苯酚聚乙氧基乙醇，蓖麻油聚乙二醇醚，聚丙烯/聚环氧环烷加成物，三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇，聚乙二醇和辛基苯氧基乙氧基乙醇。聚氧乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯与聚环氧乙烯脱水山梨醇三油酸酯也是合适的非离子表面活性剂。

阳离子表面活性剂优选为季铵盐，其具有，作为N-取代基，至少一个C8-C22烷基基团与，作为进一步的取代基，低级非取代或卤化烷基，苯甲基或低等羟基烷基基团。盐优选为卤化物，甲基硫酸盐或乙基硫酸盐的形式，例如，硬脂酰三甲氯化铵或苯甲基二(2-氯乙基)乙基溴化铵。

制剂领域通常使用的表面活性剂被描述在，例如，在"McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual", MCPublishing Corp.Ringwood，新泽西1979，以及Sisely与Wood,“表面活性剂百科全书”Chemical Publishing Co.,Inc.纽约，1980。

实施例

本发明通过引用下述具体的实施例进一步进行描述。这些实施例仅提供用于解释的目的，而不是用来限制，除非另有说明。这里所用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的并被Ausubel(ed.)，现代分子生物学方法，John Wiley与Sons,Inc.(1994)；T.Maniatis,E.F.Fritsch与J.Sambrook,分子克隆：一种实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)；以及被T.J.Silhavy,M.L.Berman,和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)所描述。

A.表达产生抗鳞翅目昆虫毒素活性的核苷酸序列的分离

实施例1：致病杆菌属和发光杆菌属菌株的生长

为了昆虫的生物测定，依据ATCC介绍的生长培养基，下述菌株在营养物肉汤培养基中25℃培养3天。为了DNA分离，培养物被在相同的条件下培养24 hr。

嗜线虫致病杆菌菌株ATCC 19061

嗜线虫致病杆菌菌株Psi，一个USDA分离物

波氏致病杆菌菌株ATCC 49122

发光光杆状菌菌株Ps5，一个USDA分离物

实施例2：昆虫的生物测定

通过在固体的人工(P.xylostella)食物上等分50μl每一种大肠杆菌培养物进行小菜蛾(Px)生物测定(Biever与Boldt,Annals of Entomological Society of America,1971；Shelton，等人J.Ent.Sci 26:17)。4ml的食物被注入1盎司(oz.)的干净塑料杯中(Bioserve product #9051)。来自食物改变的实验室群体的5个新生的小菜蛾被分别置于含有每种食物的杯子中然后用白纸盖盖上(Bioserve product #9049)。每种浓度用10个幼虫来进行试验。装杯子的托盘被置于恒温箱内以72°F 14:10(小时)光：暗周期。记录每一个杯子中的活幼虫数。

实施例3：生物测定的结果

在实施例2的昆虫生物测定中，嗜线虫致病杆菌菌株ATCC 19061的培养基产生了抗小菜蛾(Px)的100％死亡率。同样的，在实施例2的昆虫生物测定中，嗜线虫致病杆菌菌株Ps1，波氏致病杆菌菌株ATCC49122，以及发光光杆状菌菌株Ps5的细菌培养基产生了抗小菜蛾(Px)的100％死亡率。

实施例4：粘粒文库的构建

通过用2mg/ml溶菌酶处理重悬浮在100 mM Tris pH 8,10 mM EDTA中37℃30分钟的嗜线虫致病杆菌菌株ATCC 19061的新生长的细胞从中分离得到DNA。蛋白酶K被加到0.5％SDS中至终浓度为100μg/ml并45℃培养。溶液澄清并变得很粘性。SDS浓度被增加到1％以及300 mM NaCl和等体积的苯酚-氯仿-异戊醇被加入。样品被轻轻地混合5分钟并3K下离心。重复两次。水相然后与0.7体积的异丙醇混合并离心。DNA沉淀用70％乙醇洗涤3次并温和地重悬浮在0.5X TE中。6μg的DNA被用每μg DNA 0.3单位的Sau3A在100μl的体积内37℃处理3.5分钟。样品然后被65℃加热30分钟来使酶失活，然后用2单位的牛小肠碱性磷酸酶37℃温育30分钟。样品用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合并离心。水相被去除并与0.7体积的异丙醇混合并离心。沉淀物以100ng/ml浓度被重悬浮在0.5X TE中。

通过利用BamHⅠ克隆位点如供应商所述方法来制备SuperCos粘粒载体(Stratagene,La Jolla,CA)。制备的100μg/ml的Supercos被用事先用Sau3A在5μl的体积中以2∶1的比率6℃过夜消化的嗜线虫致病杆菌DNA连接。连接混合物如供应商所述利用Gigapack XLⅢ(Stratagene)被包装。被包装的噬菌体如供应商所述被感染到XL-1 MR大肠杆菌细胞(Stratagene)中。粘粒文库加在含有50μg/ml卡那霉素的L-琼脂上并37℃培养16小时。500个菌落被转到新鲜的L-kan平板上，密度为50/平板。LB培养基洗涤细胞并与20％甘油混合以及-80℃冷冻。

在嗜线虫致病杆菌的4.2 Mb的大基因组的情况下，平均大小为40kb的450个克隆相当于基因组的4倍。因此，450个克隆的筛选将产生99％的发现任何基因的可能。

来自嗜线虫致病杆菌菌株Ps1，波氏致病杆菌菌株ATCC 49122，以及发光光杆状菌菌株Ps5的粘粒文库以同样的方式被建立。

实施例5：粘粒生物测定的结果以及具有杀虫活性克隆的鉴定

来自每一个粘粒文库的400大肠杆菌克隆通过昆虫生物鉴定产生的带有抗小菜蛾活性的克隆而被筛选。一个来自嗜线虫致病杆菌菌株ATCC 19061的杀虫粘粒克隆被鉴定为pCIB9362。一个来自嗜线虫致病杆菌菌株Ps1的42 kb的杀虫粘粒克隆被鉴定为pCIB9379。一个来自波氏致病杆菌菌株ATCC 49122的42 kb的杀虫粘粒克隆被鉴定为pCIB9354。一个来自发光光杆状菌菌株Ps5的7 kb的杀虫粘粒克隆被鉴定为pCIB9383-21。

实施例6：具有杀虫活性的亚克隆的分离

克隆pCIB9362被用SacⅡ消化并分离到一个9 kb DNA片段。此片段被连接到用SacⅡ切割的Bluescript上。连接混合物如分子克隆，第二版(Sambrook等.)所述被转化到DH5α大肠杆菌细胞中。转化混合物被辅在添加了100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂上并37℃过夜培养。分离到的菌落在添加了100μg/ml氨苄青霉素的L培养液中生长并且通过分子克隆，第二版(Sambrook等.)所述的碱性微量制备分离粘粒DNA。9 kb SaclⅠ克隆被鉴定为pCIB9362-3并当生物测定抗小菜蛾时产生100％的死亡率。3μg的pCIB9362-3被分离，每μg DNA用0.3单位的Sau3A 37℃消化4,6及8分钟并且在75℃加热15分钟。样品被合并，并连接到先用BamHⅠ消化的pUC19中并用牛小肠碱性磷酸酶处理。连接体被转化到DH5α大肠杆菌细胞，如分子克隆所述的辅在含有Xgal/Amp的L琼脂上并在37℃过夜培养。选择白色菌落并培养在含100μg/ml的氨苄青霉素的L培养基上，粘粒DNA如上所述被分离。DNA用EcoRⅠ/HindⅢ消化并且新的限制谱被测序。测序引物定自Genosys Biotechnologies(Woodlands,Tx)。测序是通过双脱氧链终止法来进行的并使用Applied Biosystems Inc.377型自动DNA测序仪(Foster City,CA)来完成。序列通过Gene Codes Corporation(Ann Arbor,Michgan)的Sequencher 3.0装配。

在限制性位点以及潜在ORF’s的鉴定之后，pCIB9362-3被用CIaⅠ消化且一个3.0 kb的片段被分离克隆到Bluescript中并被转化到DH5α大肠杆菌细胞中。被分离的菌落如前面所述进行生长且通过碱性法分离质粒DNA。亚克隆被鉴定为pCIB9369并在生物测定中产生了100％的抗小菜蛾死亡率。pCIB9369被于1997年11月12，保藏并在USDA ARS专利培养物中心保藏号为NRRL B-21883。

一个20kb被鉴定为pCIB9381的片段通过NotⅠ消化从粘粒pCIB9379中亚克隆。

实施例7：生物测定结果

不同昆虫的pCIB9369的昆虫生物测定

    昆虫   pCIB9369    小菜蛾    Heliothis Virescens    Helioverpa zea    Spodoptera exguia    C.elegans    +++    na    na    na    na

na=没有活性

+=显著的生长抑制

++  =＞40％死亡率，但少于100％

+++  100％死亡率

这些结果表明pCIB9369的3.0kb的核苷酸序列表达产生的杀虫毒素具有高度的小菜蛾抗性。

pCIB9381,pCIB9354，以及pCIB9383-21的生物测定也表现出高度的小菜蛾抗性。

实施例8：杀虫活性的大小分级

嗜线虫致病杆菌粘粒克隆pCIB9369与大肠杆菌宿主DH5中的Stratagene’s Blue Script载体在添加了50μg/ml的氨苄青霉素的由50％Terrific肉汤和50％Luria肉汤组成的培养基上生长。摇瓶培养物(在1000ml挡板摇瓶中装300ml)250 RPM培养，37℃过夜。每一种菌株的培养物在4℃ Sorvall GS-3转子7,000 RPM离心。沉淀细胞被重悬浮在30ml的50mM NaCl,25mM Tris碱，pH 7.0中。浓缩的细胞通过使用Branson450型超声波仪超声波处理大约八个10秒的循环并在循环之间在冰上冷却超声破碎。超声波处理的产物用Sorvall SS34转子6,000 RPM 4℃离心10分钟。产生的上清液通过一个0.2μ过滤器过滤。来自离心的超声波产物的沉淀物被重悬浮在30ml的50mM NaCl,25mM Tris碱，pH 7.0中。

3ml的滤出液被应用于先前用10ml的50mM NaCl,25mM Tris碱，pH 7.0平衡的Bio-Rad Econo-Pac 10 DG柱中。在样品加载过程中收集的流出液被弃去。随后加入两种各为4ml的NaCl-Tris平衡缓冲液分馏样品。首先的三种级分被保存用于实验。第一级分应该含有所有的大于约6,000 mol.wt的物质。后来的级分应该含有小于6,000 mol.wt的物质。

超声波处理的滤出液的样品以及超声波处理后重悬浮的沉淀物，同来自10DG柱的三种级分一起被用于测定在表面污染试验中对新生小菜蛾的活性。超声波处理物的滤过上清液和来自9369样品的第一柱级分对小菜蛾是高度活性的。来自9369样品的第二和第三级分是无活性的。来自带有Blue Script质粒培养物的DH5a的样品没有活性。这些结果表明嗜线虫致病杆菌(X.nematophilus)克隆pCIB9369编码的杀虫活性与来自pCIB9381,pCIB9354，以及pCIB9383-21的同系物是大于6,000分子量的。

实施例9：杀虫活性的稳定性

300ml添加了氨苄青霉素的Luria培养基被接种pCIB9369并37℃过夜培养。样品被置于无菌的15ml的旋盖试管中且22℃和4℃保存。一个样品被离心并除去上清液，冷冻干燥并22℃保存。这些样品在这些条件下保存2个星期然后进行抗Px.的生物鉴定。冷冻干燥的物质被重悬浮在与先前冷冻干燥样品的相同体积内。所有的样品通过涡旋被重悬浮。另一种样品100℃处理5分钟。

处理结果22℃(2周)++4℃(2周)++冷冻干燥(2周)++100℃ 5分钟na

na=没有活性

实施例10：杀虫活性的热失活

毒素的热稳定性被检测。大肠杆菌菌株pCIB9369(大肠杆菌宿主DH5a，携带嗜线虫致病杆菌的3.0 kbDNA)的过夜培养物被培养在Luria培养基与terrific培养基的50∶50混合物上。培养管中的培养物37℃培养在试管滚筒中。每种培养物的1ml的样品被置于1.5ml的eppendorf管中并置于60℃,80℃。在5分钟后除去样品并冷却到室温。此样品与未被处理部分的培养物一起用于对小菜蛾的检测。50μl的样品被涂布在食物上，干燥并且新生的小菜蛾幼虫被应用于此表面。试验在室温下培育5天。

未处理的样品以及在60℃处理的样品导致100％死亡率。80℃处理的样品和单独的食物对照未引起可观察的死亡率。

实施例11：杀虫活性的蛋白酶处理

嗜线虫致病杆菌粘粒克隆pCIB9369与大肠杆菌宿主DH5中的Stratagene’s Blue Script载体被培养在含有50％ Terrific培养基和50％Luria培养基，其中添加了50μg/ml氨苄青霉素的培养基上。250 RPM摇瓶(在1000ml挡板摇瓶中装300ml)培养，37℃过夜。每一种菌株的培养物在Sorvall GS-3转子中4℃下7,000RPM离心。沉淀物细胞被重悬浮在30ml的50mM NaCl,25mM Tris碱，pH 7.0.的溶液中。浓缩的细胞通过使用Branson450型超声波仪超声波处理大约八个10秒的循环并在循环之间在冰上冷却被破碎。超声波处理的产物用Sorvall SS34转子6,000 RPM 4℃离心10分钟。产生的上清液通过一个0.2μ过滤器过滤。1ml的上清液样品加入CaCl₂调整到5mM Ca++。加入蛋白酶K(Gibco BRL；Gaithersburg,MD)至500μg/ml。样品在37℃培养2到24小时。制备对照样品并加入Ca++但不加入蛋白酶进行培养。

在5mM Ca++存在的情况下培养的pCIB9369和pCIB9369样品的超声波滤出液产生了对小菜蛾新生幼虫的100％的致死率。pCIB9369样品与蛋白酶K和Ca++一起培养显示出对Plutella的较少的，大约90％的致死率。

实施例12：与cry3A的蛋白序列和保幼激素酯酶的蛋白序列的序列比较

pCIB9369(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列在核苷酸569-976和1045-2334显示两个开放阅读框架(ORF)。ORF#1在用UWGCG Blast和Gap程序检索后在Genbank中没有发现任何的同源的序列。通过Blast程序对pCIB9369的ORF#2编码的蛋白进行的Gap分析确定了其与苏云金芽孢杆菌cry3A蛋白具有一定的不显著的同源性(21％同一性)，然而，通过Blast程序对pCIB9369 ORF#2(SEQ ID NO:3)编码的蛋白进行的Gap分析的确表明其与保幼激素酯酶相关的蛋白(GenBank 注册号为 2921553；Henikoff等.，PNAS USA 89:10915-10919(1992))具有同源性(30.6％的AA同一性和44.1％AA相似性)。

pCIB9381,pCIB9354，与pCIB9383-21的核苷酸序列也在每一个这些克隆中显示出两个开放阅读框架。pCIB9381和pCIB9383-21的每一个中的两个ORF的核苷酸序列与在pCIB9369中的那些序列的同一性都超过90％。因此，pCIB9381和pCIB9383-21的ORF#2蛋白与pCIB9369中的ORF#2一样与保幼激素酯酶相关的蛋白基本上具有相同的同源性。pCIB9354 ORF#1的核苷酸序列与pCIB9369的ORF#1的核苷酸序列有77％的同一性，以及pCIB9354 ORF#2的核苷酸序列与pCIB9369 ORF#2的核苷酸序列有79％的同一性。pCIB9354的ORF#2蛋白也与保幼激素酯酶相关的蛋白具有同源性(29.2％AA同一性和42.2％AA相似性)。

实施例13：pCIB9369与来自WO 98/08388的序列的序列比较

从其核苷酸序列被描述在WO 98/08388上的38.2 kb DNA片段中获得的22个其中每个序列为60个核苷酸(60-mers)的序列，并比较于含有pCIB9369的pCIB9362-3的核苷酸序列。第一个60-mer从38.2kb DNA片段的碱基1开始，而其它的60-mers以大约2kb的间隔位于DNA片段上。他们在38.2 kb DNA片段上的位置被列举如下：

1-60；2,041-2,100；4,021-4,080；6,001-6,060；8,041-8,100；10,021-10,080；12,001-12,060；14,041-14,100；16,021-16,080；18,001-18,060；20,041-20,100；22,021-22,080；24,001-24,060；26,041-26,100；28,021-28,080；30,001-30,060；32,041-32,100；34,021-34,080；36,001-36,060；38,041-38,100；38,161-38,220.

利用UWGCG Gap程序进行序列比较且22个60-mer序列中的每一个及其互补序列被检测。这些序列对比的结果显示最高为53％的同一性，其在本领域被认为是不显著的同源性。

实施例14：使用得自WO 98/08388序列的探针进行Southern印迹分析

寡核苷酸对被设计用来扩增公开在WO 98/08388上的38.2 kb DNA片段的DNA片段。寡核苷酸定购自Genosys Biotechnologies(TheWoodlands,Texas)且它们在38.2 kb DNA片段中的位置显示如下。它们的扩增PCR片段的大小也列举如下：

VK1046：位置20-40

VK1047：位置2,078-2,100

使用VK1046和VK1047扩增的PCR片段的大小：2,080 bp

VK1048：位置11,221-11,241

VK1049：位置13,360-13,380

使用VK1 048和VK1049扩增的PCR片段的大小：2,120 bp

VK1050：位置26,581-26,601

VK1051：位置28,537-28,560

使用VK1050和VK1051扩增的PCR片段的大小：1,979 bp

VK1052：位置18,901-18,921

VK1053：位置20,321-20,340

使用VK1052和VK1053扩增的PCR片段的大小：1,439 bp

VK1054：位置34,261-34,281

VK1055：位置35,320-35,340 BP

使用VK1054和VK1055扩增的PCR片段的大小：1,079bp

通过使用Perkin-Elmer 9600 Thermo-Cycler在下述条件下完成了PCR反应：94℃,2分钟；然后30个循环：94℃30秒,54℃,30秒；72℃,4分钟。样品在100μl终体积中含有800ng的嗜线虫致病杆菌DNA,0.1-0.5μM的每一种寡核苷酸对，250μM dNTP,5UTaq聚合酶以及1x缓冲液(Perkin-Elmer)。完成的反应物用乙醇沉淀，重悬浮在TE中并置于1％SeaPlaque(FMC,Rockland,Maine)TBE凝胶上。在电泳后，溴化乙锭染色以及用紫外光显影然后从凝胶上切割片段。凝胶切片在65℃溶化并用10μl等分样品与μl蒸馏水混合，煮沸5分钟。并置于冰上。然后，15μl的随机引物标记缓冲液(GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD),6μl dNTP混合物(无dCTP),80μCi α-dCT32P和1μl Klenow被混合。标记的反应在室温下进行60分钟。样品被依据供应商的说明书被清理到Nick柱上(Pharmacia Biotech)。探针被煮沸5分钟，并置于冰上。

通过消化的嗜线虫致病杆菌总DNA，得自粘粒pCIB9362以及pCIB9363(这些粘粒重叠超过25 kb且都含有pCIB9369的DNA片段；pCIB9362被用于亚克隆)的DNA，得自亚克隆pCIB9362-3(9 kb SacⅡ片段)和pCIB9369(2.96 kb ClaⅠ片段)的DNA进行Southern杂交，用ClaⅠ,SacⅡ或HindⅢ消化。消化反应物加在0.75％琼脂糖TBE凝胶上并电泳过夜。拍照且凝胶如 Bio-Rad所述进行处理用于印迹到Zeta-探针杂交膜。印迹后，膜被80℃烘干30分钟。膜然后被放到7％SDS,250 mM磷酸钠，pH 7.2中并67℃培养30分钟。加入新鲜的溶液并在平衡到67℃后，如上所述的放射性探针被加入且允许杂交过夜，膜用2X SSC,0.5％SDS 67℃洗涤30分钟，然后，在0.5×SSC，0.5％SDS中于67℃下洗涤30分钟。膜被曝光在胶片上1和3小时。显色胶片且结果显示来自WO 98/08388序列的PCR探针并不杂交于本发明所述的粘粒的DNA或亚克隆的DNA。然而观察到与嗜线虫致病杆菌DNA有强烈的杂交信号。

这些结果证实了序列比较的结果并表明了克隆pCIB9369与WO98/08388中所述的核苷酸序列是不同的。

B．本发明的核酸序列在异源微生物宿主中的表达

适于本发明核苷酸序列的异源表达的微生物为所有的能够定居于植物或根际的微生物。其本身将被用于接触害虫。这些包括革兰氏阴性微生物例如假单胞菌属，肠杆菌属和沙雷氏菌属，革兰氏阳性微生物例如芽胞杆菌属以及真菌木霉菌属，粘帚霉属，以及啤酒酵母。尤其优选的异源宿主为荧光假单胞菌，恶臭假单胞菌，洋葱假单胞菌，致金色假单胞菌，桔黄假单胞菌，阴沟肠杆菌，粘质沙雷氏菌，枯草芽胞杆菌，腊状芽胞杆菌，Trichoderma viride,Trichodermaharizianum,Gilocladium virens,以及酿酒酵母。

实施例19：核苷酸序列在大肠杆菌及其它的革兰氏阴性细菌中的表达

许多基因已在革兰氏阴性细菌中以异源的方式表达。表达载体pKK223-3(Pharmacia catalogue#27-4935-01)可在大肠杆菌中表达。此载体具有一个被lac调控和IPTG诱导的强烈的tac启动子(Brosius,J.等人.，Proc.Nat’.Acad.Sd.USA 81)。大量的表达系统被改进用于大肠杆菌。热诱导表达载体pPL(Pharmacia#27-4946-01)使用严紧调控的噬菌体λ启动子，其允许蛋白的高水平表达。lac启动子提供了另一种表达的方式但是启动子并不表达象tac启动子一样的高水平。随着将广范围宿主复制子加入到这些表达系统的载体中，核苷酸序列在严紧相关的革兰氏阴性细菌例如假单胞菌属，肠杆菌，沙雷氏菌属以及欧文氏菌中的表达是可能的。例如，pLRKD211(Kaiser & Kroos,Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 81:5816-5820(1984))含有其允许在许多革兰氏阴性细菌中复制的广范围宿主复制子ori T。

在大肠杆菌中，IPTG诱导需要tac(即trp-lac)启动子的表达。当此相同的启动子(如广宿主范围质粒PLRKD211)被导入假单胞菌属时，其为没有PTG诱导的组成型活性。此trp-lac启动子可被置于任意在假单胞菌属或其它严紧相关的细菌中表达的目的基因或操纵子的前面用于此基因的组成型表达的目的。因此，表达产生杀虫毒素的核苷酸序列可被置于组成型启动子的后面，给药到具有定居植物或根际特性的细菌中，转化此微生物为杀虫剂。其它可能的启动子可被用于革兰氏阴性菌的核苷酸序列的组成型表达。这些启动子包括，例如来自假单胞菌属调控基因gafA和lemA(WO 94/01561)以及萨氏假单胞菌IAA操纵子启动子(Gaffney等人.,J.Bactedol.172:5593-5601(1990)。

实施例20：核苷酸序列在革兰氏阳性细菌中的表达

核苷酸序列在革兰氏阳性细菌中的异源表达是产生杀虫毒素的另一种方式。用于芽胞杆菌属和链霉菌属的表达系统被最充分地表征。来自肺炎链球菌的红霉素抗性基因(ermR)的启动子被显示在革兰氏阳性需氧菌以及厌氧菌以及大肠杆菌(Trieu-Cuot等人，Nud AcidsRes 18:3660(1990))中具有活性。另一个来自硫链丝菌肽基因抗生素抗性启动子被用在链霉菌属克隆载体中(Bibb,Mol Gen Ge net 199:26-36(1985))。穿梭载体pHT3101也适于在芽胞杆菌属中表达(Lereclus,FEMS Microbiol Lett 60:211-218(1989))。此方法的一个显著的优点是许多革兰氏阳性细菌产生可被用于配制长效杀虫剂的孢子。芽胞杆菌属和链霉菌属种是土壤的侵占性定居者。

实施例21：核苷酸序列在真菌中的表达

Trichodema harzianum和Gliocladium virens被显示出提供了在田地中不同水平的生物调控(US 5,165,928以及US 4,996,157,都授予Cornell Research Foundation)。一个表达产生杀虫毒素的核苷酸序列能够在这种真菌中表达。此可以通过大量的本领域公知的方式来完成。其中之一是真菌通过PEG或电穿孔介导的技术进行的原生质体介导的转化。可选择地，微粒轰击可被用于转化具有再生成熟结构能力的原生质体或其它的真菌细胞。原来被发展用于曲霉属转化现在被广泛用于真菌转化载体pAN7-1(Curragh 等.，Mycol.Res.97(3):313-317(1992)；Tooley等,Curr.Genet.21:55-60(1992)；Punt等.，Gene 56:117-124(1987))被工程改造含有核苷酸序列。此质粒含有大肠杆菌侧接于Aspergillus nidulans gpd启动子和trpC终止子的潮霉素B抗性基因(Punt等，Gene 56:117-124(1987))。

在一个优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列在酿酒酵母中表达。例如，来自pCIB9369,pCIB9381,pCIB9354,或pCIB9383的两个ORF’s中的每一个被克隆到带有GALl诱导型启动子和CYCl终止子的各个载体中。每个载体具有氨苄青霉素抗性和2微米复制子。载体优选具有不同于酵母的生长标记。构建物被独立的以及一起被转化到酿酒酵母中。ORF被一起表达和用来检测蛋白表达和杀虫活性。

C．杀虫毒素的制剂

使用含有分离的毒素或上述实施例所述的产生毒素的细胞悬浮液或浓缩液的活性成分来制得杀虫制剂。例如表达杀虫毒素的大肠杆菌可被用于防治害虫。制剂以液态或固态的形式被制得并被描述如下。

实施例18：杀虫剂成分的液态制剂

在下面的实施例中，成分的百分比以重量表示1．可乳化的浓缩物：                            a     b      c活性成分                                      20％  40％  50％十二烷基苯磺酸钙                              5％   8％   6％蓖麻油聚乙二醇醚                              5％    -    -(36摩尔的环氧乙烷)三丁基苯酚聚乙二醇醚                           -    12％  4％(30摩尔的环氧乙烷)环己酮                                         -    15％  20％二甲苯混合物                                  70％  25％  20％任意所需浓度的乳剂可通过用水稀释此浓缩液来产生。2．溶液：                            a    b     c    d活性成分                            80％ 10％  5％  95％乙二醇一甲基醚                      20％  -     -    -聚乙二醇400                          -   70％   -    -N-甲基-2-吡咯烷酮                    -   20％   -    -环氧化椰子油                         -    -    1％  5％石油馏出液                           -    -    94％  -(沸腾范围160～190°)

这些溶液适合以微滴的形式应用。3．颗粒剂                            a    b活性组分                            5％  10％高岭土                              94％  -高度分散的硅酸                      1％   -Attapulgit                           -   90％

活性组合物被溶解在二氯甲烷中，溶液被喷射到载体上，且溶剂随后在真空中被蒸发掉。4．粉剂：                            a    b活性组分                            2％   5％高度分散的硅酸                      1％   5％滑石                                97％  -高岭土                                -   90％

通过彻底地混合载体与活性组分获得了即用的粉剂。

实施例19：杀虫组合物的固态制剂

在下面的实施例中，成分的百分比以重量表示1．可湿性粉剂：                     a     b    c活性组分                           20％  60％  75％木素磺酸钠                         5％   5％    -十二烷基硫酸钠                     3％    -    5％二异丁萘磺酸钠                      -    6％   10％辛基苯酚聚乙二醇醚(7-8摩尔的环氧    -    2％    -乙烷)高度分散的硅酸                     5％   27％  10％高岭土                             67％   -     -

活性成分与助剂彻底地混合且混合物在合适的碾磨机中被彻底的研磨，使得可湿性粉剂，可被用水稀释产生所需浓度的悬浮液。2．可乳化的浓缩物：活性成分                                      10％辛基苯酚聚乙二醇醚(4-5摩尔的环氧乙烷)         3％十二烷基苯磺酸钙                              3％蓖麻油聚乙二醇醚(36摩尔的环氧乙烷)            4％环己酮                                        30％二甲苯混合物                                  50％

任意所需浓度的乳剂可通过用水稀释此浓缩液来产生。3．粉剂：                               a      b活性组分                               5％    8％滑石                                   95％    -高岭土                                  -     92％

通过混合活性组合物与载体并在一个合适的碾磨机中研磨，获得了即用的粉剂。4．挤压颗粒剂：活性成分                                      10％木素磺酸钠                                    2％羧甲基纤维素                                  1％高龄土                                        87％

活性组分被与助剂混合并研磨，混合物接着用水湿润。混合物被挤压然后在气流中干燥。5．包被颗粒：活性成分                                      3％聚乙二醇200                                   3％高龄土                                        94％

微细研磨过的活性成分在搅拌机中被均匀的应用到用聚乙二醇湿润的高龄土中。通过此方式获得非粉状的包被颗粒。6．悬浮浓缩物：活性成分                                      40％乙二醇                                        10％壬基苯酚聚乙二醇(15摩尔的环氧乙烷)            6％木素磺酸钠                                    10％羧甲基纤维素                                  10％37％水性甲醛溶液                              0.2％75％水性乳剂的硅油                            0.8％水                                            32％

微细研磨过的活性成分被彻底的与助剂混合，产生一个悬浮浓缩物，从此可通过用水稀释来获得任意的所需的浓度悬浮液。

上述的杀虫制剂通过本领域技术人员公知的技术以害虫被杀虫毒素防治的量应用于植物。

D．核苷酸序列在转基因植物中的表达

本申请所述的核酸序列通过常规的重组DNA技术可被引入到植物细胞中。通常地，此涉及通过本领域公知的标准克隆方法插入一个本发明的编码序列到一个其编码序列是异源(即，通常不存在)的表达系统中。载体含有插入的蛋白编码序列的转录和翻译必需的元件。本领域技术人员公知的大量的表达系统可以被使用，例如，质粒，噬菌体病毒和其它的被修饰的病毒。合适的载体包括，但不限于，病毒载体例如λ载体系统λgtl1,λgtl0和Charon载体4；质粒载体例如pB1121,pBR322,pACYC177,pACYC184,pAR系列,pKK223-3,pUC8,pUC9,pUC18,pUC19,pLG339,pR1(290,pKC37,pKC101,pCDNAⅡ；以及其它的类似的系统。表达系统的元件可被修饰来增加表达。例如平截序列，核苷酸替换或其它的修饰可以被采用。此处所述的表达系统可被在合适的条件下用于实质上转化任意农作物植物细胞。转化的细胞再生成整个植物，这样本发明的核苷酸序列便赋予了转基因植物昆虫抗性。

实施例22：编码序列以及相邻序列的修饰

本申请所述的核苷酸序列可被修饰用于在转基因植物中表达。表达核苷酸序列的以及在其细胞中产生杀虫毒素的宿主植物增强了对昆虫攻击的抗性且因此较好的减少了因昆虫攻击引起的农作物的损失。

微生物来源的基因在植物中的转基因表达可能需要这些基因的修饰来获得和最优化在植物中的表达。特别地，编码独立的但被相同转录体在天然微生物中编码的酶的细菌ORF最好在植物中独立的转录体上表达。为了达到上述目标，每一个微生物的ORF分别被分离和在盒中克隆，其中的盒在ORF的5’末端提供一个植物启动子序列以及在ORF的3’末端提供一个植物转录终止子。分离的ORF序列优选包括起始ATG密码子和终止STOP密码子，但可能在起始ATG密码子和STOP密码子之外包括另外的序列。此外，ORF可被截短，但仍保留所需的活性；对于特别的长ORF，仍保留活性的截短形式可优先在转基因生物体内表达。“植物启动子”和“植物转录终止子”指在植物细胞中有效的启动子和转录终止子。其包括可从非植物来源的例如病毒(一个例子为花椰菜花叶病毒)获得的启动子和转录终止子。

在一些情况下，不需要对ORF编码序列及其相邻序列进行修饰。分离含有目的ORF的片段与插入到植物启动子的下游就足够了。例如，Gaffney等人(Science 261:754-756(1993))在转基因植物中在CaMV 35S启动子和CaMV tml终止子的调控下成功的表达了假单胞菌属nahG基因，而没有编码序列的修饰并且ATG上游的假单胞菌属基因xbp以及STOP密码子的下游ybp仍旧与nahG ORF相连。优选的如小的相邻的微生物的序列将被留在与ATG的上游以及STOP密码子的下游相连。实际上，此构建物依赖于限制性位点的可得性。

在其它的情况下，来自微生物来源的基因表达在表达中会产生一些问题。这些问题在本领域已被充分描述且特别是来自一定的来源例如芽胞杆菌属的基因所常见的。这些问题可被应用于本发明的核苷酸序列且这些基因的修饰可通过本领域技术人员公知的技术来进行。下面的问题将被遇到。

1．密码子选择

植物中的优选的密码子选择不同于在特定的微生物中的密码子选择。克隆微生物ORF的密码子选择与植物基因(以及来自靶植物的特定基因)的密码子选择的比较将能够鉴定优选被改变的ORF中的密码子。典型地，植物进化趋于在单子叶植物的第三碱基位置强烈使用核苷酸C和G，然而双子叶植物通常在此位置使用核苷酸A和T。通过修饰一个基因来引入对于特定的目的转基因品种优选的密码子选择，许多下述的GC/AT含量以及不正常剪接的难题将被克服。

2．GC/AT含量

植物基因典型地含有大于35％的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列可在植物中引起一些难题。首先，据信ATTTA基元引起信使的去稳定作用并在许多短寿mRNA的3’末端被发现。第二，据信多腺苷酸化信号例如AATAA在信使中的合适的位点的产生引起转录的过早截断。此外，单子叶植物可识别富含AT的序列为剪接位点(见下面)。

3．与起始甲硫氨酸相邻的序列

植物不同于微生物之处在于其信使不具有确定的核糖体结合部位。相反，据信核糖体连接于信使的5’末端且扫描第一个可得的ATG，在此处开始翻译。然而，据信，某些核苷酸优先相邻于ATG且微生物基因的表达可通过一个真核的共有区翻译起始密码子在ATG处的引入被增强。Clontech(1993/1994 catalog,第210页，在此引入作为参考)提出了一个序列作为一个共有区翻译起始密码子用于大肠杆菌uidA基因在植物中的表达。此外，Joshi(NAR L5:6643-6653(1987),在此引入作为参考)  比较了许多相邻于ATG的植物序列并提出了另外的共有区序列。遇到微生物ORF在植物中的表达中的难题的情况下，这些序列中的一个在起始ATG处的包含能改善翻译。在此情况下，共有区的最后三个核苷酸可能不适于包含在修饰的序列中，这是由于其修饰第二个AA残基。优选的相邻于起始甲硫氨酸的序列在不同的植物种类中可能是不同的。对GenBank数据库中的14个玉米基因的研究得到了下面的结果：

14个玉米基因的起始ATG前的位置：

   -10   -9   -8   -7   -6   -5   -4   -3    -2    -1

C    3    8    4    6    2    5    6    0    10    7

T    3    0    3    4    3    2    1    1    1     0

A    2    3    1    4    3    2    3    7    2     3

G    6    3    6    0    6    5    4    6    1     5

用于所期望的该核苷酸序列被引入的植物种类的这种分析可被进行，并且邻接于ATG的序列被修饰来引入优选的核苷酸。

4．不正常剪接位点的去除。

从非植物来源克隆的以及未被优化在植物中表达的基因也可能含有在植物中被识别为5’或3’剪接位点的基元并被切除，因此产生截短的或缺失的信使。这些位点可通过本领域公知的技术被除去。  

编码序列和相邻序列的修饰技术是本领域公知的。在微生物ORF的起始表达很低的并且其被认为适合产生如上所述序列的改变情况下，则合成基因的构建可通过本领域公知的方法来被完成。这些，例如，描述在公开的专利EP 0 385 962(Monsanto),EP 0 359 472(Lubrizol)以及WO 93/07278(Ciba-Geigy)中，所有这些在此引入作为参考。在大多数的情况下，通过使用瞬时分析方法(其在本领域是公知的)在其转入转基因植物前分析基因构建物的表达是优选的。

实施例23：植物表达盒的构建

计划用于在转基因植物中表达的编码序列首先被装配在表达盒中在植物中表达的合适的启动子的后面。表达盒也可含有任意其它需要或选择用于转基因表达的序列。此序列包括，但不限于，转录终止子，增强表达的附加的序列例如内含子，有生活力的序列，以及用于基因产物对特定的细胞器和细胞区室的寻靶作用的序列。这些表达盒然后可轻易地被给药到在下面描述的植物转化载体。下列是典型的表达盒的不同组成的描述。

1．启动子

表达盒中所用启动子的选择将决定转基因植物中转基因的空间和时间的表达模式。选择的启动子将在特定的细胞类型(例如叶表皮的细胞，叶肉细胞，根皮层细胞)或在特定的组织或器官(例如，根，叶，或花)中表达转基因并且选择将反映所期望的基因产物积累的场所。可选择地，所选择的启动子在不同的诱导条件下驱动基因的表达。启动子在其强度例如启动转录的能力上是不同的。依赖于所利用的宿主细胞系统，任意一个合适的启动子可被使用，包括基因的天然启动子。下面是可用在表达盒中的启动子的非限制性的实例。

a．组成型表达，遍在蛋白启动子：

遍在蛋白质是一种基因产物已知在许多细胞类型中积累并且其启动子被从一些种中克隆用于转基因植物(如向日葵-Binet等Plant Science 79:87-94(1991)；玉米-Christensen等人.PlantMolec.Biol.12:619-632(1989)；以及Arabidopsis-Norris等人.，Plant MoL BIoL 21:895-906(1993))。玉米遍在蛋白质启动子在转基因单子叶植物系统中被改进且其用于单子叶植物转化的序列以及载体被公开在专利申请EP 0 342 926(to Lubrizol)上，其在此通过引用被合。Taylor等人(Plant Cell Rep.12:491-495(1993))描述了一个载体(pAHC25)其含有玉米遍在蛋白质启动子和第一内含子以及其当经过微粒子轰击导入时在很多单子叶植物的细胞悬浮液中的高活性。Arabidopsis遍在蛋白质启动子理想地用于本发明的核苷酸序列。遍在蛋白质启动子适于在转基因植物，单子叶植物以及双子叶植物中的基因表达。合适的载体为pAHC25的衍生物或任意在本申请中描述的通过导入适当的遍在蛋白质启动子和/或内含子序列进行修饰的的转化载体。

b．组成型表达，CaMV 35S启动子

质粒pCGN1761的构建被描述在公开的专利申请EP 0 392 225(实施例23)，其在此引入作为参考。pCGN1761含有“双”CaMV 35S启动子和tml转录终止子，在启动子和终止子间带有一个独特的EcoRⅠ位点并且具有一个pUC型主链。pCGN1761的衍生物被构建具有一个修饰的包括除存在的EcoRⅠ位点外的Notl位点和Xhol位点的多接头。此衍生物被设计为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX对于cDNA序列或编码序列(包括微生物ORF序列)在其多接头中的用于在转基因植物中35S启动子的调控下的表达目的的克隆是有用的。此构建物的整个35S启动子-编码序列-tml终止子可被HindⅢ,SphⅠ,Sall在从5’位点到启动子切除，以及XbaⅠ,BamHⅠ以及BgⅡ在从3’位点到终止子切除来给药到如下面所述的转化载体。此外，双35S启动子片段可被去除通过用HindⅢ,SphⅠ,Sall,XbaⅠ,或PstⅠ 5’切除和任意的多接头限制性位点(EcoRⅠ,NotⅠ或XhoⅠ)用其它的启动子替换。如果需要，克隆位点周围的修饰可通过导入能增强翻译的序列来产生。当过量表达被期望时，此特别有用。例如，pCGN1761ENX可通过翻译起始位点的优化被修饰，如实施例37中的US专利No.5,639,949所述，其引入作为参考。

c．组成型表达，肌动蛋白启动子

肌动蛋白的一些异构形式已知在大多数的细胞类型中表达并且因此所以肌动蛋白是组成型启动子的良好的选择。特定的，来自水稻ActⅠ基因的启动子被克隆和鉴定(McElroy等人Plant Cell 2:163-171(1990))。启动子的一个1.3kb的片段被发现含有在水稻原生质体表达需要的所有调控元件。此外，无数的基于AcTl启动子为基础的表达载体被构建特定的用于单子叶植物(McElroy等人Mol.Gen.Genet232:150-160(1991))。这些包括Acti-内含子，Adhl 5’侧翼序列和Adhl-内含子(来自玉米乙醇脱氢酶基因)以及来自CaMV 35S启动子的序列。显示出最高表达的载体是35S和Acti-内含子或Adhl 5’侧翼序列和Adhl-内含子的融合物。起始密码子ATG(GUS报道基因)周围的序列的优化也增强了表达。McElroy等人(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))描述的启动子表达盒可轻易地被修饰用于基因表达且特别适合用于单子叶植物宿主。例如，含有启动子的片段被从McElroy构建物中去除并用于替换pCGNl761 ENX中的双35S启动子，其有效用于特异性基因序列的插入。融合基因如此被构建然后被给药到适当的转化载体中。在一个独立的报道中，携带其第一内含子的水稻ActⅠ启动子也已被发现在种植的大麦细胞中指导高效表达(Chibbar等人.Plant Cell Rep.12:506-509(1993))。

d．诱导型表达，PR-1启动子：

pCGN1761ENX中的双35S启动子可被任何其它的会产生合适的高表达水平的启动子替换。例如，一个描述在US专利No.5,614,395上的化学调控的启动子可替换双35S启动子。所选的启动子优选被限制性酶从其来源被切除，但可选择地利用携带适当的终止限制位点的引物被PCR扩增。若PCR-扩增将被进行，则启动子应在扩增的启动子在靶载体中的克隆之后被重测序来检查扩增错误。化学/病原体调控烟草PR-1a启动子被从质粒pCIB1004(用于构建，参见EP 0332 104的实施例21，其在此引入作为参考)分离并被给药到质粒pCGN1761ENX(Uknes等人.，1992)中。pCIB1004用NcoⅠ切割且所得的线性片段的3’突出端被通过用T4 DNA聚合酶处理变钝。然后片段用HindⅢ切割且产生的含PR-1a启动子的片段被凝胶纯化并克隆到其35S启动子已被去除的pCGN1761 ENX中。这通过下述步骤完成：用Xho1切割并用T4聚合酶钝化，接着用HindⅢ切割以及分离pCIB1004启动子被克隆入的较大含有-载体终止子的片段。此产生了带有PR-1a启动子和tml终止子和一个带有独特的EcoRⅠ以及NotⅠ位点的间插多接头的pCGN1761ENX衍生物。所选的编码序列可被插入到此载体中，且融合的产物(即启动子-基因-终止子)随后可被给药代任意所选的转化载体中，包括那些下文描述的。不同的化学调节剂可被用来诱导所选的编码序列在通过本发明转化的植物中的表达，包含公开在US专利No.5,523,311和5,614,395上的苯并噻二唑，异烟酸，以及水杨酸化合物。

e．诱导型表达，乙醇-可诱导的启动子：

被特定的醇或酮，例如乙醇诱导的启动子可被用来赋予本发明的编码序列可诱导的表达。此种启动子例如来自Aspergillus nidulans的alcA基因启动子(Caddick等人(1998)Nat.Biotechnol16:177-180)。在A.nidulans中，alcA基因编码乙醇脱氢酶，其表达在化学诱导剂的存在下被AIcR转录因子所调控。为了达到本发明的目的，在含有被融合到最小的35S启动子(Caddick等人(1998)Nat.Biotechnol 16:177-180)上的alcA基因启动子序列的质粒palcA:CAT中的CAT编码序列被本发明的一个编码序列替换来形成一个具有在alcA基因启动子调控下的编码序列的表达盒。此是通过本领域公知的方法来进行。

f．诱导型表达，糖皮质素可诱导的启动子：

本发明的利用基于类固醇激素的系统的核苷酸序列的表达的诱导也已被考虑。例如，糖皮质素介导的诱导系统被使用(Aoyama和Chua(1997)The Plant Journal 11:605-612)以及通过糖皮质素的应用诱导基因表达，例如，一个合成的糖皮质素，优选的为地塞米松，优选的浓度为0.1mM到1mM，较优选的为10mM到100mM。为了达到本发明的目的，荧光素酶基因序列被本发明的一段核酸序列替换来产生一个具有本发明的核酸序列的表达盒，其是在6拷贝的融合到35S最小启动子的激活序列上游GAL4的调控下。此通过本领域公知的方法进行的。反式作用因子含有融合到疤疹病毒蛋白质VP16(Triezenberg等人(1988)Genes Devel.2:718-729)反式激活区的GAL4 DNA-结合区(Keegan等人(1986)Science 231:699-704)，其中的疱疹病毒蛋白质VP16融合到鼠糖皮质素受体(Picard等人(1988)Cell54:1073-1080)的激素结合区。融合蛋白的表达被适用于在本领域公知的或此处所描述的植物中表达的任意启动子所调控。此表达盒也包含在含有本发明的融合到6xGAL4/最小启动子的核酸序列的植物中。因此，融合蛋白的组织或器官特异性被获得来产生杀虫毒素的可诱导的组织或器官特异性。

g．根特异性表达：

另一种基因表达的模式是根表达。一个合适的根启动子被deFramond描述(FEBS 290:103-106(1991))以及被描述在公开的专利申请EP 0 452 269上，其在此引入作为参考。此启动子被转到一个合适的例如pCGN1761 ENX载体中，用于插入一个被选择的基因并且随后转移完整的启动子-基因-终止子盒到目的转化载体中。

h．愈伤-诱导启动子:

愈伤-诱导启动子也适于基因表达。大量的这种启动子已被描述(如Xu等人Plant Molec.Biol.22:573-588(1993),Logemann等人Plant Cell 1:151-158(1989),Rohrmeier & Lehle,Plant Molec.Biol.22:783-792(1993),Firek等人.Plant Molec.Biol.22:129-142(1993),Warner等人.Plant J.3:191-201(1993))且全都适用于本发明。Logemann等人描述了双子叶马铃薯wunL基因的5’上游序列。Xu等人表明来源于双子叶马铃薯(pin2)的愈伤-诱导启动子在单子叶植物水稻中也具有活性。另外，Rohrmeier & Lehle描述愈伤诱导的玉米Wipl cDNA的克隆且其可被通过常规技术用来分离关联启动子。Similar,Firek等人以及Warner等人描述了一个来自于单子叶植物Asparagus officinalls的愈伤-诱导基因，其被表达在局部愈伤区以及病原体侵染位点。利用本领域公知的克隆技术，这些启动子可被转到合适的载体中，融合到本发明涉及的基因中，并且用于在植物愈伤点表达这些基因。

i．木髓-优选的表达：

专利WO 93/07278，其引入作为参考，描述了优选在木髓细胞中表达的玉米trpA基因的分离。从转录起始延伸到-1726 bp的基因序列以及启动子被描述。利用常规的分子生物学技术，此启动子或其部分，可被转到一个如pCGN1761载体中，其可替换35S启动子并用于驱动外源基因以木髓-优选的方式表达。事实上，含有木髓-优选的启动子或其部分的片段可被转到任意载体并被修饰用于转基因植物。

j．叶-特异性表达：

编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因已被Hudspeth & Grula描述(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))。利用常规的分子生物学技术，该基因的启动子可被用来驱动任意基因以叶-特异性的方式在转基因植物中表达。

k．花粉-特异性表达：

WO 93/07278描述了表达在花粉细胞中的玉米钙-依赖的蛋白质激酶(CDPK)基因的分离。该基因序列和启动子从转录起始延伸到1400bp。利用常规的分子生物学技术，该启动子或其部分，可被转到如pCGN1761载体中来替换35S启动子并且用于驱动本发明的核酸序列以花粉-特异性方式表达。

2．转录终止子

可得到很多种类的转录终止子用于表达盒。这些终止子负责除转基因以及准确的聚腺苷酸化外的转录终止。适当的转录终止子为那些已知在植物中有功能的终止子且包括CaMV 35S终止子，tml终止子，胭脂氨酸合酶终止子以及豌豆rbcS E9终止子。这些可被用于单子叶和双子叶植物。此外，一个基因的天然转录终止子也可被利用。

3．用于增强或调控表达的序列

大量的序列已被发现从转录单元内部增强基因表达并且这些序列可被用于联合本发明的基因来增加其在转基因植物中的表达。

不同的内含子序列已被显示出特别是在单子叶植物的细胞中增强表达。例如，玉米Adhl基因的内含子已经被发现当被导入到玉米细胞后显著加强在其关联启动子控制下的野生型基因的表达。内含子1被发现特别有效并且增强带有氯霉素乙酰转移酶基因(Callis等人.，Genes Develop.1:1183-1200(1987))的融合构建物中的表达。在相同的实验系统中，来自玉米bronzel基因的内含子具有相似的增强表达活性。内含子序列已经被常规地引入到植物转化载体，典型的在非翻译前导区内。

也已知来源于病毒的大量非翻译前导序列增强表达，并且这些在双子叶植物细胞中特别有效。具体地，来自烟草花叶病毒(TMV,“W-序列”)，玉米黄斑病毒(MCMV)，以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已被显示对增强表达有效(e.g.Gallie等人Nud.Acids Res.15:8693-8711(1987)；Skuzeski等人Plant Molec.Biol.15:65-79(1990))。

4．细胞内基因产物的寻靶作用

靶向基因产物的不同机制已知存在于植物中且调控这些机制功能的序列在一些细节上已被鉴定。例如，基因产物对叶绿体的寻靶作用被一个发现在不同蛋白质氨基末端的信号序列调控，其在叶绿体输入的过程中被切割产生成熟的蛋白质(如Comai等人J.Biol.Chem.263:15104-15109(1988))。这些信号序列可被融合到异源基因产物中来影响异源产物运输到叶绿体中(van den Broeck，等人.Nature313:358-363(1985))。编码适当信号序列的DNA可被从编码RUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合酶，G52蛋白以及许多其它的已知定位于叶绿体的蛋白的cDNA的5’末端分离。也参见，U.S.专利No.5,639,949的实施例37的命称为“叶绿体寻靶作用的表达”。

其它的基因产物被定位在其它的细胞器例如线粒体以及过氧物酶体中(如Unger等人.Plant Molec.Biol.13:411-418(1989))。编码这些产物的cDNA已被人工处理来影响异源基因产物对这些细胞器的寻靶作用。这种序列的实例为核-编码的腺苷三磷酸酶以及线粒体的特异性天门冬氨酸盐氨基转移酶同Ⅰ型。靶向细胞蛋白体已被Rogers等人描述(Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 82:6512-6516(1985))。

此外，已鉴定引起基因产物对其它细胞室的寻靶作用的序列。氨基末端序列负责对ER，质外体，以及来自糊粉细胞的细胞外分泌物的寻靶作用(Koehler & Ho,Plant Cell 2:769-783(1990))。另外，氨基末端序列与羧基末端序列联合对基因产物的液泡的寻靶作用负责(Shinshi等Plant Molec.Biol.14:357-368(1990))。

通过将上述的适当的寻靶作用序列融合到目的转基因序列中，其可能引导转基因产物到任意细胞器或细胞小室中。为了叶绿体的寻靶作用，例如，来源于RUBISCO基因，CAB基因，EPSP合酶基因，或GS2基因的叶绿体信号序列被融合到转基因的氨基末端ATG框中。选择的信号序列应包括已知的切割位点，且构建的融合物应考虑切割所需的切割位点后的任意氨基酸。在一些情况下，这种需要可通过在切割位点和转基因ATG之间加入少许的氨基酸，或可选择地，在转基因内部替换一些氨基酸来满足。用于叶绿体输入的构建融合物可被通过体外转录构建物的体外翻译接着体外叶绿体吸收用于检测叶绿体吸收的效率，利用的技术为Bartlett等人在：Edelmann等(Eds.)Methodsin Chloroplast Molecular Biology,Elsevier pp 1081-1091(1982)以及Wasmann等Mol.Gen.Genet.205:446-453(1986)所描述。这些构建物技术是本领域公知的且同样适用于线粒体和过氧物酶体。

上述的用于细胞寻靶作用机制可被不仅与它的关联启动子联合，而且也可与异源启动子联合使用以便达到在一个具有不同于靶向信号来源的启动子的表达模式的启动子的转录调控下的特异性细胞-寻靶作用的目的。

实施例24：构建植物转化载体

大量的适用于植物转化的转化载体对于植物转化领域的普通技术人员来说是已知，且与本发明相关的基因可被用于连接于任意的这样的载体。载体的选择将依赖于优选的转化技术以及用于转化的靶种。对于一定的靶的种类来说，不同的抗生素或除草剂选择标记将是优选的。转化中常规应用的选择标记包括nptll基因，其赋予卡那霉素以及相关的抗生素的抗性(Messing & Vierra.基因19:259-268(1982)；Bevan等人，Nature 304:184-187(1983)),bar基因，其赋予除草剂膦丝霉素抗性(White等人.，Nud.Acids Res 18:1062(1990),Spencer等人.Theor.Appl.Genet 79:625-631(1990)),hph基因，其赋予抗生素潮霉素抗性(Blochinger & Diggelmann,MolCell Biol 4:2929-2931),以及dhfr基因，其赋予methatrexate抗性(Bourouis等人.，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))，以及EPSPS基因，其赋予草甘膦抗性(U.S.专利No.4,940,935和5,188,642)。

1．适合于土壤杆菌转化的载体

许多载体适合于利用根瘤土壤杆菌的转化。这些典型地携带至少一个T-DNA边界序列并包括例如pBINl 9(Bevan,Nud.Acids Res.(1984))和pXYZ的载体。下面，两种典型的适用于土壤杆菌转化的载体的构建被描述。

a．pCIB200和pCIB2001:

二元载体pcIB200和pCIB2001被用于构建用于土壤杆菌的重组载体并以下述的方式构建。通过pTJS75的NarⅠ消化(Schmidhauser& Helinski,J.Bacteriol.164:446-455(1985))允许四环素-抗性基因的切除，接着插入来源于携带NPTⅡ的pUC4K的一个AccⅠ片段，产生了pTJS75kan(Messing & Vierra，基因19:259-268(1982):Bevan等人.，Nature 304:184-187(1983):McBride等人.，Plant Molecular Biology 14:266-276(1990))。XhoⅠ接头被连接到PCIB7的EcoRV片段上，其中的EcoRV片段含有左或右T-DNA边界，一个植物选择性nos/nptll嵌合基因  以及pUC多接头(Rothstein等人.，基因53:153-161(1987))，且Xhol-消化的片段被克隆到Sall-消化的pTJS75kan片段上来产生pCIB200(也参见EP 0332 104，实施例19)。pCIB200含有下面的独特的多接头限制性位点：EcoRⅠ,SstⅠ,KpnⅠ,BgⅢ,XbaⅠ,和SaⅡ。pCIB2001是通过插入另外的限制性位点到多接头中产生的pCIB200的衍生物。在pCIB2001多接头中独特的限制性位点为EcoRⅠ,SstⅠ,KpnⅠ,BgⅢ,XbaⅠ,SaⅡ,MIuⅠ,BcⅡ,AvrⅡ,Apal,HpaⅠ,以及StuⅠ。pCIB2001除了含有独特的限制性位点外还含有植物和细菌卡那霉素选择性，土壤杆菌介导转化的左和右T-DNA边界，用于在E.coil和其它的宿主间的迁移的RK2-来源的trfA功能，以及也来自于RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适用于含有它们自身调节信号的植物表达盒的克隆。

b．pCIB10以及其潮霉素选择性衍生物：

二元载体pCIB10含有编码用于植物中选择的卡那霉素抗性基因以及T-DNA右和左边界序列以及引入来自于宿主广谱的允许其在E.coli和土壤杆菌中复制的质粒pRK252的序列。其构建物被Rothstein等人描述(基因53:153-161(1987))。pCIB10的不同衍生物被构建，其引入了潮霉素B磷酸转移酶基因，如Gritz等所描述(Gene 25:179-188(1983))。这些衍生物能够在仅含潮霉素(pCIB743)，或潮霉素与卡那霉素(pCIB715,pCIB717)上筛选转基因植物细胞。

2．适用于非-土壤杆菌转化的载体

没有利用根瘤土壤杆菌的转化避免了对在选择转化载体的T-DNA序列的要求，且因此除了诸如上述的含有T-DNA序列的载体外，缺少这些序列的载体可被利用。不依赖于土壤杆菌的转化技术包括通过微粒轰击，原生质体摄取(例如.PEG和电穿孔)以及微注射的转化。载体的选择较多地依赖于被转化种类的优选选择。下面，适用于非土壤杆菌转化的典型载体的构建被描述。

a．pCIB3064:

pC1B3064是一个pUC-起源的载体，适用于与除草剂basta(或膦丝霉素)的选择联合的直接基因转移技术。质粒pCIB246含有CaMV 35S启动子(可操作地融合到E.coil GUS基因)和CaMV 35S转录终止子并被描述于公开的PCT申请WO 93/07278。此载体的35S启动子含有两个起始位点的5’ATG序列。这些位点利用标准的PCR技术被诱变使得去除ATG并产生Sspl和PvuⅡ限制性位点。新的限制性位点距离独特的SaⅡ位点96和37 bp以及距离实际的起始位点101和42 bp。产生的pCIB246的衍生物被命名为pCIB3025。然后，GUS基因通过SaⅡ和SacⅠ的消化被从pCIB3025切除，末端被变钝并被重新连接产生质粒pCIB3060。质粒pJIT82从John InnesCentre,Norwich获得并且一个400 bp的含有来自Streptomycesviridochrormogenes的bar基因的Smal片段被切除并插入到pCIB3060的Hpal位点(Thompson等EMBO J 6:2519-2523(1987))。产生pCIB3064，其含有在CaMV 35S启动子和用于除草剂选择的终止子的调控下的bar基因，一个氨苄青霉素抗性基因(用于在E.coil中选择)和一个具有特定位点SphⅠ,PstⅠ,HindⅢ，和BamHⅠ的多接头。此载体适于含有自身调控信号的植物表达盒的克隆。

b．pSOG19和pSOG35:

pSOG35是一个转化载体，其利用E.coli二氢叶酸还原酶基因(DFR)作为选择性标记赋予甲氨蝶呤抗性。PCR被用于扩增35S启动子(-800 bp)，来自玉米Adhl基因的内含子6(-550 bp)以及来自pSOG10的18bp的GUS非翻译前导序列。一个编码E.coli二氢叶酸还原酶Ⅱ型基因的250-bp片段也通过PCR被扩增并且这两个PCR片段用来自pBl221(Clontech)的SacⅠ-PstⅠ片段装配，其中的片段含有pUC19载体主链以及胭脂氨酸合酶终止子。这些片段的装配产生pSOG19，片段其含有与内含子6序列，GUS前导序列，DHFR基因以及胭脂氨酸合酶终止子融合的35S启动子。pSOG19中的GUS前导序列被来自玉米黄斑病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus)(MCMV)的前导序列替换产生了载体pSOG35。pSOG19和pSOG35携带氨苄青霉素抗性的pUC基因并具有适于外源物质克隆的HindⅢ,SphⅠ,PstⅠ和EcoRⅠ位点。

3．适用于叶绿体转化的载体

为了本发明的核苷酸序列在植物质体中的表达，质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)被利用。核苷酸序列被插入到pPH143，因此替换PROTOX编码序列。此载体然后被用于质体转化以及大观霉素抗性的转化子的选择。可选择地，核苷酸序列被插入到pPH143从而替换了aadH基因。在这种情况下，选择转化子的对PROTOX的抑制剂抗性。

实施例25：转化

一旦本发明的核酸序列被克隆到一个表达系统中，其被转化到植物细胞。植物的转化和再生的方法是本领域公知的。例如，Ti质粒载体已被利于转运外源DNA，以及直接DNA摄取，脂质体，电穿孔，微注射，以及微粒。此外，来源于土壤杆菌属的细菌可被用于转化植物细胞。下面描述转化单子叶植物和双子叶植物的代表性的技术以及代表性质粒转化技术。

1．双子叶植物的转化

双子叶植物的转化技术是本领域公知的并且包括基于土壤杆菌的技术和不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术包括由原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。此可以通过PEG或电穿孔介导的摄取，微粒轰击介导的转运，或微注射被完成。这些技术的实例被Paszkowski等，EMBO J 3:2717-2722(1984),Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199:169-177(1985),Reich等，Biotechnology 4:1001-1004(1986)，以及Klein等人，Nature 327:70-73(1987)描述。在每一个情况下，被转化的植物通过本领域公知的常规技术被再生为整个植株。

土壤杆菌介导的转化是双子叶植物转化的优选技术，因为它的高效转化和在很多不同种类中的广泛应用。土壤杆菌转化典型地包括携带外源目的DNA的二元载体(例如pCIB200或pCIB2001)转化到一个适宜的土壤杆菌菌株中，其可能依赖于由土壤杆菌菌株在共住的Ti质粒或染色体上(例如pCIB200和pCIB2001的菌株CIB542(Uknes等Plant Cell 5:159-169(1993))所携带的vir基因的互补序列(complement)。重组二元载体的转到土壤杆菌通过利用携带重组二元载体的E.coil，携带例如pRK2013的质粒且能运输重组二元载体到靶土壤杆菌菌株的辅助E.coil菌株的三亲本交配法被完成。可选择地，重组二元载体可通过DNA转化被转运到土壤杆菌(HOfgen &Willmitzer,Nud.Acids Res.16:9877(1988))。

通过重组土壤杆菌的靶植物种的转化通常包括来自植物的外植体与土壤杆菌的共培养且根据本领域公知的方法。被转化的组织在含有位于二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择性培养基上再生。

另一种用基因转化植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞中推进惰性或生物活性粒子。此技术公开于Sanford等人的U.S.专利No.4,945,050,5,036,006,和5,100,792上。通常地，此方法涉及在有效穿透细胞的外表面并与掺入其内部的条件下推进惰性或生物活性粒子。当惰性粒子被利用时，载体可通过包被有含有目的基因的载体的粒子被导入到细胞中。选择性地，靶细胞可被载体包围以致于载体通过粒子的激发被导入到细胞中。生物活性粒子(例如，干酵母细胞，干细菌或噬菌体，各含有要被导入的DNA)也可被推进入到植物细胞组织中。

2．单子叶植物的转化

大多数的单子叶植物种的转化现在已成为常规的技术。优选的技术包括利用PEG或电穿孔技术，和微粒攻击到愈伤组织直接转化基因到原生质体中。转化可用单DNA种类或多DNA种类来进行(例如.共转化)且这两种技术都适用于本发明。共转化可以具有避开完全载体的构建以及产生带有目的基因和可选择性标记的非连接基因座的转基因植物的优点，能够在后代中除去选择性标记，这些是所期望的。然而，利用共转化的一个缺点是分离DNA种类被整合到基因组中的频率低于100％(Schocher等Biotechnology 4:1093-1096(1986))。

专利申请EP 0 292435,EP 0 392 225，以及WO 93/07278描述了用于制备来自玉米的优良近交系的愈伤组织和原生质体的技术，利用PEG或电穿孔转化原生质体的技术，以及来自被转化的原生质体的玉米植株的再生。Gordon-Kamm等(Plant Cell 2:603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology 8:833-839(1990))已公开了利用微粒轰击转化Al88衍生玉米系的技术。此外，WO 93/07278和Koziel等(Biotechnology il:194-200(1993))描述了利用微粒轰击转化玉米优良近交系的技术。该技术利用从授粉后14-15从玉米穗上切割的1.5-2.5mm长的非成熟玉米胚和用于轰击的PDS-1000He Biolistics装置。

水稻的转化也通过利用原生质体或微粒轰击直接的基因转移技术进行。Japonica-型以及Indica-型的原生质体介导的转化已被描述(Zhang等Plant Cell Rep Z:379-384(1988)；Shimamoto等Nature338:274-277(1989)；Datta等Biotechnology 8:736-740(1990))。两种类型也可利用微粒轰击被常规的转化(Christou等Biotechnology 9:957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了利用电穿孔来转化水稻的技术。

专利申请EP 0 332 581描述Pooideae原生质体的产生，转化和再生的技术。这些技术允许Dactyils和小麦的转化。此外，小麦转化已被Vasil等(Biotechnology 10:667-674(1992))描述利用微粒轰击到C型长期可再生的愈伤组织的细胞，也被描述利用微粒轰击不成熟胚和不成熟胚来源的愈伤组织，Vasil等人(Biotechnology11:1553-1558(1993))和Weeks等(Plant Physiol.102:1077-1084(1993))。然而，小麦转化的优选的技术，包括通过粒子轰击不成熟胚细胞的小麦转化并包括在基因转运前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击前，任何数量的胚(0.75-1mm长)被置于有3％蔗糖(Murashiga &Skoog,Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))以及3mg/l2,4-D的MS培养基上用于诱导体细胞胚，其在黑暗中进行。在被选择轰击的那一天，胚被从诱导培养基上移走并放置渗压剂上(带有被加至所需浓度的蔗糖或麦芽糖，典型地为15％的诱导培养基)。胚被允许质壁分离2-3h并被轰击。典型的每个目的平皿20个胚，但不是关键。一个适宜的携带基因的质粒(例如pCIB3064或pSG35)利用常规的方法被沉淀到微米大小的金颗粒。每个胚平皿用DuPontBiolistics^helium设备在1000 psi的突发压下利用标准80目的筛来射击。在轰击后，胚被放回到黑暗中恢复24小时(仍在渗透剂上)。24小时后，胚从渗透剂上移走并被放回到诱导培养基上并在再生前培养大约1个月。大约1个月后，具有发育的胚发生的愈伤组织的胚外植体被转化到再生培养基(MS+1mg/升NAA，5mg/升GA)，另外含有适宜的选择剂0(在pCIB3064情况下为10mg/l basta，在pSOG35情况下为2mg/I甲氨蝶呤)。大约1个月后，发育的芽被转移到较大的无菌容器其含有半量MS,2％蔗糖，以及相同浓度的选择剂。

利用土壤杆菌的单子叶植物转化也被描述。参见WO 94/00977和U.S.专利No.5,591,616，此二者引入作为参考。

3．质体的转化

Nicotiana tabacurn c.v.‘Xanthi nc’的种子在一个T琼脂培养基上1”环状排列每皿中有7个发芽且在播种12-14天后用包被有来自质粒pPH143和PPHI45的DNA的1μm钨粒子(M10,Biorad,Hercules,CA)轰击，基本上如下所述(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)PNAS 90,913-917)。被轰击的种子培养在T培养基上两天后，叶子被切割并将远轴侧朝上于亮光(350-500 pmol光子/m²/s)中于含有500μg/ml的大观霉素二盐酸盐(Sigma,St.Louis,MO)的RMOP培养基上。在轰击3到8周后，有脱色叶的下面出现的抗性芽被亚克隆到相同的选择性培养基上，允许形成愈合组织，且继发的芽被分离和亚克隆。在独立亚克隆中的转化的质体基因组拷贝的完全分离通过标准的Southern印迹技术被评估(Sambrook等.，(1989)分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，冷泉港)。BamH/EcoRl-消化的总细胞DNA(Mettler,I.J.(1987)Plant Mol BiolReporter 5,346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上被分离，被转到尼龙薄膜上(Amersham)并用对应于来自含有部分rps7/12质体靶序列的pC8的0.7 kb BamHⅠ/HindⅢ DNA片段的³²p标记的随机引物DNA序列探测。同质芽在含有大观霉素的MS/IBA培养基上无菌生根(McBride,K.E.等人.(1994)PNAS 91,7301-7305)并被转移到温室中。

E．育种和种子生产

实施例26：育种

通过用本发明的核酸序列转化获得的植物可为任意种类的植物品种，包括单子叶植物和双子叶植物；然而，用于本发明方法的植物优选的选自农业上重要的如上文所述的目的作物。本发明的基因的表达与其它重要的产量和品质特性可通过育种被合并到植物品系。育种的方法和技术是本领域已知的。参见，例如，Welsh J.R.，植物遗传和育种基础，John Wiley & Sons,NY(1981)；农作物育种，Wood D.R.(Ed.)American Society of Agronomy Madison,Wisconsin(1983)；Mayo O.,植物育种原理，第二版，Clarendon出版社，Oxford(1987)；Singh,D.P.,用于抗疾病和抗害虫的育种，Springer-Verlag,NY(1986)；以及Wricke和Weber,Quantitative Genetics andSelection Plant Breeding,Walter de Gruyter以及Co.,Berlin(1986)。

被工程改造到上述转基因种子和植物中的遗传特性通过有性繁殖或无性生长被给药且因此在后代植物植物中保持和传播。通常所说的保持和传播利用了已知的被改进以适用特定目的的农业方法，例如耕种，播种，或收割。特别的方法例如溶液培养或温室技术也可被应用。由于正在成长的作物容易被害虫攻击和损害同样也受杂草竞争的影响，一些如防治杂草，植物疾病，昆虫，线虫以及其它不利条件的措施被采用来提高产量。这些包括机械的方法例如土壤的耕作或去杂草和被感染的植物，同样也包括农用化学药品例如除草剂，杀菌剂，杀配子剂，杀线虫剂，生长调节剂，催熟剂以及杀虫剂的应用。

本发明的转基因植物和种子的有利遗传特性的用途可进一步被用于植物育种上，其目的在于培育改良特性的植物，例如害虫耐性与除草剂耐性，或逆境耐性，改良的营养值，增加的产量，引起减少由于寄生或脱落引起损失的改良结构。不同的育种步骤通过明确的人类干预被表征，例如筛选用于杂交的品系，引导亲本系的授粉，或筛选适当的子代植株。依赖于所期望的特性，采取了不同的育种措施。相关的技术是本领域公知的且包括但不限于杂交，近交，回交育种，多线育种，品种混交，种间杂交，非整倍体技术等等。杂交技术也包括通过机械的，化学的，或生物化学的方式不育化植物产生雄性或雌性不育植物。雄性不育植株与不同品系的花粉间的交叉授粉确保雄性不育但雌性保育植株的基因组将始终如一地获得两个亲本品系的特性。因此，本发明的转基因种子和植物可被用于改良的植物品系的育种，例如，增加传统方法例如除草剂或杀虫剂处理的有效性或由于它们的被修饰的遗传特性而可以省去所说的方法。可选择地，带有改良的应力耐性的新作物可被获得，其取决于它们被优化的遗传“设备”，与不能耐受类似的不良发育条件的产品相比产生了较好品质的收获产品。

实施例27：种子的生产

在种子的生产中，发芽质量及种子的均一性是重要的产品特性，然而农民所收获的以及出售的种子的发芽质量及种子的均一性是不重要的。由于保持一种作物不受其它的作物和杂草种子的影响，防治种传病，以及生产带有优良发芽的种子是很困难的，相当广泛和明确的种子生产操作已被种子生产商改进，其中生产商在纯种子的生长，调理，以及销售方面是富有经验的。因此，使用购买的符合特定质量标准的种子代替使用自己收获的种子对农民来说是共有的经验。被用作种子的繁殖物质通常用含有除草剂，杀虫剂，杀真菌剂，杀菌剂，杀线虫剂，灭螺剂，或其混合物的保护剂包衣处理。通常，所用的保护剂包衣含有化合物例如克菌丹，萎锈灵，福美双(TMTD^)，methalaxyl(Apron^)，以及甲基虫螨磷(ActelIic)。如需要，这些化合物与其它的通常用于配制领域的载体，表面活性剂或促进应用的助剂一起配制来提供抗细菌，真菌或动物害虫引起的损害的保护。保护剂包衣可通过用液态制剂浸渗繁殖物质或通过用联合的湿或干制剂包被被应用。其它应用的方法例如直接处理芽或果实也是合适的。

本发明的另一个方面是通过新的农业方法，例如上述实施例的方法，其特征在于本发明的转基因植物，转基因植物材料，或转基因种子的应用。

种子可以以由合适的包装材料组成的袋子，器皿或容器中的形式提供，该袋子和容器能够被密封来包含种子。袋子，器皿或容器可被设计用于种子的短期或长期或短期和长期的储藏。合适的包装材料的实例包括纸，例如牛皮纸，硬或软的塑料或其它的聚合材料，玻璃或金属。理想的袋子，器皿或容器由相同的或不同类型的多层的包装材料构成。在一个实施方案中，提供袋子，器皿或容器从而排除或限制水以及湿气接触种子。在一个实施例中，袋子，器皿或容器被密封，例如热封，来阻止水分或湿气进入。在另一个实施例中，水吸收物质被置于包装材料层间或与包装材料层相邻。在另一个实施例中，袋子，器皿或容器，或其构成它的包装材料被处理来限制，抑制或阻止疾病，污染或其它的对种子储藏和运输不良的影响。这种处理的一个实施例是灭菌，例如通过化学方式或通过暴露于射线中。本发明包含是一个商用袋子，其含有在所述转化植物中以比野生型植物中的更高水平表达的本发明的基因的转基因植物的种子，和一个合适的载体，以及赋予植物广谱疾病抗性的标签说明书。

上述公开的实施例是举例说明。本发明公开的内容将使本领域的技术人员拥有许多本发明的变化形式。因此，所有的这些明显的和可预见的变化被包含在附加的权利要求的范围中。

序列表<110>Novartis AG<120>来自嗜线虫致病杆菌的新型杀虫毒素及其编码核酸<130>30472/A/CGC1992<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2978<212>DNA<213>嗜线虫致病杆菌<220><221>CDS<222>(569)..(976)<223>orf1<220><221>CDS<222>(1045)..(2331)<223>JHE-样orf2<220><223>pCIB9369<400>1atcgatgtga cggcagagta tttttattcc tgtaaactga cgacaatgca tttctaagat 60atcaatataa taatgataaa tttattgatc atatatctgt tatattttga ttgaaaatta 120ttgaatatac ctcttgtact aaattcatta catttttttt actttaaaca acattaaatt 180cacacataat acagcttaaa tataacatgt gatatatatt atgattataa aaaacattaa 240aataaataat acgccacata tattaacaat atctaattac tgatgatact attttctgag 300tatatataaa tcttaaagaa aataattatt ttttatattt cacatcaatt taaaatctgc 360ttagaatgcc ccccggcatc acaagaaaac aaaatcattc aagtaataca atagagttaa 420atttaaaaat aacatgtata acaaaataca tagacaatta tacatgtaaa tgacagacaa 480ctgacaaaac atagcaaaaa aacgccttaa atattaaggt atcaaaacaa tatatcagac 540tatcttaaat ctaataggag aatccctc atg att aca ata cat atc agt ggt    592

                           Met Ile Thr Ile His Ile Ser Gly

                             1               5ggt agt gta aca att aat aac aat ata gta aca gaa act gat gtc caa   640Gly Ser Val Thr Ile Asn Asn Asn Ile Val Thr Glu Thr Asp Val Gln

 10                  15                  20aat aca ccc gct tca gcg cct tta tca att act aat ttt agg gat atg   688Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu Ser Ile Thr Asn Phe Arg Asp Met 25                  30                  35                  40aca ata gaa cct cat tca tct gtt gag gcg ata aga acc gat aca ccg    736Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro

             45                  50                  55att att cct gaa tca cga cca aat tac tat gtt gct aat tct ggc ccg    784Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro

         60                  65                  70gcc tca tca gtc aga gct gtt ttc tat tgg tcc cac tct ttt aca tca    832Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser

     75                  80                  85gaa tgg ttt gaa tct tcc tct att att gta aaa gca ggc gaa gac gga    880Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly

 90                  95                 100gtc tta cat tca ccg ggt aat tct tta tat tac agc aag gtt gta att    928Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile105                 110                 115                 120tat aac gat aca gac aaa cgt gct ttt gtt acc ggc tac aat cta taa    976Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu

            125                 130                 135taacgcagaa atacaatcca tatttccaat gaatttcaaa taacatcctt aaggcaagaa  1036acaaaatc atg aat aat gaa ccg atg aat act aat gaa tca caa gct tca   1086

     Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser

                 140                 145                 150gag ata gta ccc tca atg aat gaa tct ata tta gca gca cct tat tca    1134Glu Ile Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser

            155                 160                 165att tct aca cct aat tat gaa tgg gat atg tca tca ata ata aaa gat    1182Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp

        170                 175                 180gct att att ggt ggt ata ggc ttt att cct ggt ccg ggc tca gca ata    1230Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile

    185                 190                 195tca ttt ttg tta ggg tta ttt tgg cca caa caa acc gac aat act tgg    1278Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp

200                 205                 210gag caa att ctc caa aaa gta gaa caa atg atc gag caa gcc aat ctc    1326Glu Gln Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu215                 220                 225                 230aaa act att caa gga ata ttg aac ggc gat ata caa gaa att aaa ggc    1374Lys Thr Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly

            235                 240                 245aaa atg gaa cat gtg caa ttc atg cta gaa tcc tca cct ggc act caa    1422Lys Met Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln

        250                 255                 260gaa agc cat gac gca tac atg ttt ctg gcg aga tat ctg gtc agt ata    1470Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile

    265                 270                 275gac gaa aaa ttc aag tct ttt gat aac aaa aca aat tat caa att ctt    1518Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu

280                 285                 290ccc atg tat acc aat acg att atg tta caa gcc cct tat tgg aaa atg    1566Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met295                 300                 305                 310ggt ata gag aga aaa gat gag atc aaa cta aca gat ata gaa gtt aat    1614Gly Ile Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn

            315                 320                 325gaa tta aaa gag ctg ata gga aaa tta tct acc agc gcc gat aaa tat    1662Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr

        330                 335                 340att cat gat gtc tat act cgt gaa tat gat aat gcg atg aac act tca    1710Ile His Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser

    345                 350                 355aca gca gca aat atc acc aat aat tta tta tct gta aga ggc tat tgt    1758Thr Ala Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys

360                 365                 370tta tta cat ggt tta gaa tgt ctc gaa gtc att aac cat ata caa aat    1806Leu Leu His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn375                 380                 385                 390aat agc ctt gag caa agt ttt tat cct aaa act atc agc tac tcc acc    1854Asn Ser Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr

            395                 400                 405gta ttc gat cgc cag aca aat aaa aca agg gtt caa gcc ctg aca gaa    1902Val Phe Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu

        410                 415                 420gac gat caa atg caa gag cca ttc aag cct gct tta att aat ggg aag    1950Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys

    425                 430                 435tac aac aaa ata aaa tca ttg att ggg tat gta caa aga atc gga aac    1998Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn

440                 445                 450gca ccc aga gtt gga ggc att aaa gtc aca ttt gca aac gat gca tct    2046Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser455                 460                 465                 470tat acc ctc ggt aca gta act tca gaa gta aac tca att gaa ctg aat    2094Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn

            475                 480                 485gac agc gtt ata acc agc ctg gaa gta tgg gga aat ggc gct att gat    2142Asp Ser Val Ile Thr Ser Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Ile Asp

        490                 495                 500gag gca ttc ttt aca tta agt gac gga cgt caa ttt agg ctt ggc caa    2190Glu Ala Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln

    505                 510                 515cgc tat gcc agt aac tat aga aaa tat gct gtc gat aac cac tat att    2238Arg Tyr Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile

520                 525                 530tca gga ttg tac tta gcc agt gat gaa cct tca ttg gca ggt caa gca    2286Ser Gly Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala535                 540                 545                 550gca ggc att gca gtt tca tac cat atg ata gct gat aaa aaa tca       2331Ala Gly Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser

            555                 560                 565tagtattaac aggcttctga tttcagacta agcaagtaag cggatcttca gagtcatata 2391gcatgctata tgactgaaga gttatccgct cctcactttt aactaaactc attacatcct 2451ccactaattt attcagcgat aaaaaacaca caatgaaaac caaacatttg tttgttattt 2511tcataaaaaa tgcaactctt tgtttaataa aaatttatcg cagtataaaa tattgccagt 2571tttatagact atattatatt ctcactttat ctatattttt agtttaaaat tcaagactaa 2631aatcacactt ttatgcaaaa tgttcacttt atataactta cgatcgtact ctcataatta 2691gaatcaaata tcaaaataat ctttactgtt tatcagacat gcaatacaac attaatacaa 2751aaaatagcta aggacatgat atgttgaaaa gggaaaatca gatattgcaa ctactgaagg 2811gcgatccttt catgcagcag caagaaatcg ctgatatcct tggaattagc cgctcgtgtg 2871ttgcaggaca tattatgaac ctaagcaaaa aaggatatat taaaggcaaa gggtatatct 2931tatctaatga tgtttatact gttacaattg gtgctgccaa tatcgat               2978<210>2<211>135<212>PRT<213>嗜线虫致病杆菌<400>2Met Ile Thr Ile His Ile Ser Gly Gly Ser Val Thr Ile Asn Asn Asn  1               5                  10                  15Ile Val Thr Glu Thr Asp Val Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu

         20                  25                  30Ser Ile Thr Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val

     35                  40                  45Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn

 50                  55                  60Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe 65                  70                  75                  80Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile

             85                  90                  95Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser

        100                 105                 110Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala

    115                 120                 125Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu

130                 135<210>3<211>429<212>PRT<213>嗜线虫致病杆菌<400>3Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser Glu Ile   1               5                  10                  15Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser

         20                  25                  30Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile

     35                  40                  45Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe

 50                  55                  60Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln 65                  70                  75                  80Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr

             85                  90                  95Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met

        100                 105                 110Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser

    115                 120                 125His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu

130                 135                 140Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met145                 150                 155                 160Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile

            165                 170                 175Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu

        180                 185                 190Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His

    195                 200                 205Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala

210                 215                 220Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu225                 230                 235                 240His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser

            245                 250                 255Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe

        260                 265                 270Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp

    275                 280                 285Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn

290                 295                 300Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro305                 310                 315                 320Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr

            325                 330                 335Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser

        340                 345                 350Val Ile Thr Ser Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Ile Asp Glu Ala

    355                 360                 365Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr    370                 375                 380Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly385                 390                 395                 400Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly

            405                 410                 415Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser

        420                 425<210>4<211>408<212>DNA<213>嗜线虫致病杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(405)<223>pCIB9381的orf1<400>4atg att aca atc aat atc act ggt gat aat gta aga gtt aat aac aat    48Met Ile Thr Ile Asn Ile Thr Gly Asp Asn Val Arg Val Asn Asn Asn  1               5                  10                  15ata gca aca gaa acc gac ctc caa aat aca cct gct tca gca ccc tta    96Ile Ala Thr Glu Thr Asp Leu Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu

         20                  25                  30tca att att aat ttt agg gat atg aca ata gaa cct cat tca tct gtt    144Ser Ile Ile Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val

     35                  40                  45gag gcg ata aga acc gat aca ccg att att cct gaa tca cga cca aat    192Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn

 50                  55                  60tac tat gtt gct aat tct ggc ccg gcc tca tca gtc aga gct gtt ttc    240Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe 65                  70                  75                  80tat tgg tcc cac tct ttt aca tca gaa tgg ttt gaa tct tcc tct att    288Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile

             85                  90                  95att gta aaa gca ggc gaa gac gga gtc tta cat tca ccg ggt aat tct    336Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser

        100                 105                 110tta tat tac agc aag gtt gLa att tat aac gat aca gac aaa cgt gct    384Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala

    115                 120                 125ttt gtt acc ggc tac aat cta taa                                    408Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu

130                 135<210>5<211>135<212>PRT<213>嗜线虫致病杆菌<400>5Met Ile Thr Ile Asn Ile Thr Gly Asp Asn Val Arg Val Asn Asn Asn  1               5                  10                  15Ile Ala Thr Glu Thr Asp Leu Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu

         20                  25                  30Ser Ile Ile Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val

     35                  40                  45Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn

 50                  55                  60Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe 65                  70                  75                  80Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile

             85                  90                  95Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser

        100                 105                 110Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala

    115                 120                 125Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu

130                 135<210>6<211>1290<212>DNA<213>嗜线虫致病杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1287)<223>pCIB9381的JHE一样orf2<400>6atg aat aat gaa ccg atg aat act aat gaa tca caa gtt tca gag ata    48Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Val Ser Glu Ile  1               5                  10                  15gta ccc tca atg aat gaa tct ata tta gca gca cct tat tca att tct    96Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser

         20                  25                  30aca cct aat tat gaa tgg gat atg tca tca ata ata aaa gat gcc att    144Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile

     35                  40                  45att ggt ggt ata ggc ttt att cct ggt ccg ggc tca gca ata tca ttt    192Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe

 50                  55                  60ttg tta ggg tta ttt tgg cca caa caa acc gac aat act tgg gag caa    240Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln 65                  70                  75                  80att ctc caa aaa gta gaa caa atg atc gag caa gcc aat ctc aaa act    288Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr

             85                  90                  95att caa gga ata ttg aac ggc gat ata caa gaa att aaa ggc aaa atg    336Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met

        100                 105                 110gaa cat gtg caa ttc atg cta gaa tcc tca cct ggc act caa gaa agc    384Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser

    115                 120                 125cat gac gca tac atg ttt ctg gcg aga tat ctg gtc agt ata gac gaa    432His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu

130                 135                 140aaa ttc aag tct ttt gat aac aaa aca aat tat caa att ctt ccc atg    480Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met145                 150                 155                 160tat acc aat acg att atg tta caa gcc cct tat tgg aaa atg ggt ata    528Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile

            165                 170                 175gag aga aaa gat gag ata aaa cta aca gat ata gaa gtt aat gaa tta    576Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu

        180                 185                 190aaa gag ctg ata gga aaa tta tct acc agc gcc gat aaa tat att cat    624Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His

    195                 200                 205gat gtc tat act cgt gaa tat gat aat gcg atg aac act tca aca gca    672Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala

210                 215                 220gca aat atc acc aat aat tta tta tct gta aga ggc tat tgt tta tta    720Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu225                 230                 235                 240cat ggt tta gaa tgt ctc gaa gtc att aac cat ata caa aat aat agc    768His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser

            245                 250                 255ctt gag caa agt ttt tat cct aaa act atc agc tac tcc acc gta ttc    816Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe

        260                 265                 270gat cgc cag aca aat aaa aca agg gtt caa gcc ctg aca gaa gac gat    864Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp

    275                 280                 285caa atg caa gag cca ttc aag cct gct tta att aat ggg aag tac aac    912Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn

290                 295                 300aaa ata aaa tca ttg att ggg tat gta caa aga atc gga aac gca ccc    960Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro305                 310                 315                 320aga gtt gga ggc att aaa gtc aca ttt gca aac gat gca tct tat acc    1008Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr

            325                 330                 335ctc ggt aca gta act tca gaa gta aac tca att gaa ctg aat gac agc    1056Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser

        340                 345                 350gtt ata acc agc ctg gaa gta tgg gga aat ggc gct gtt gat gag gca    1104Val Ile Thr Set Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala

    355                 360                 365ttc ttt aca tta agt gac gga cgt caa ttt agg ctt ggc caa cgc tat    1152Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr

370                 375                 380gcc agt aac tat aga aaa tat gct gtc gat aac cac tat att tca gga    1200Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly385                 390                 395                 400ttg tac tta gcc agt gat gaa cct tca ttg gca ggt caa gca gca ggc    1248Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly

            405                 410                 415att gca gtt tca tac cat atg ata gct gat aaa aaa tca tag            1290Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser

        420                 425<210>7<211>429<212>PRT<213>嗜线虫致病杆菌<400>7Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Val Ser Glu Ile  1               5                  10                  15Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser

         20                  25                  30Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile

     35                  40                  45Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe

 50                  55                  60Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln 65                  70                  75                  80Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr

             85                  90                  95Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met

        100                 105                 110Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser

    115                 120                 125His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu

130                 135                 140Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met145                 150                 155                 160Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile

            165                 170                 175Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu

        180                 185                 190Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His

    195                 200                 205Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala

210                 215                 220Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu225                 230                 235                 240His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser

            245                 250                 255Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe

        260                 265                 270Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp

    275                 280                 285Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn

290                 295                 300Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro305                 310                 315                 320Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr

            325                 330                 335Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser

        340                 345                 350Val Ile Thr Ser Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala

    355                 360                 365Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr

370                 375                 380Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly385                 390                 395                 400Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly

            405                 410                 415Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser

        420                 425<210>8<211>408<212>DNA<213>波氏致病杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(405)<223>pCIB9354的orf1<400>8atg atc aca atc aat atc agt ggt ggt aat gta aca att aat aac aat    48Met Ile Thr Ile Asn Ile Ser Gly Gly Asn Val Thr Ile Asn Asn Asn  1               5                  10                  15atc agt tca gta acg gat atc caa aaa ccc ctt gat gca gaa ccc ctc    96Ile Ser Ser Val Thr Asp Ile Gln Lys Pro Leu Asp Ala Glu Pro Leu

         20                  25                  30tca gtc acg aat tat aga gat ctg aca ata gag ccg cac tca tct att    144Ser Val Thr Asn Tyr Arg Asp Leu Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Ile

     35                  40                  45caa gca gac aga acg gac acc ccc att att cct gaa aca cgc cct gat    192Gln Ala Asp Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Thr Arg Pro Asp

 50                  55                  60tat tat atc gct aac tca ggc cct gct tca tca gtc aaa gct gtg ttt    240Tyr Tyr Ile Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Lys Ala Val Phe  65                  70                  75                  80tat tgg tcg cat tcg ttt aca tcg gaa tgg ttc gag tat tca tct atc    288Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Tyr Ser Ser Ile

             85                  90                  95acg gta aaa gca gga gaa gat gga ata tta aaa tca ccg agt aat gct    336Thr Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Ile Leu Lys Ser Pro Ser Asn Ala

        100                 105                 110gta tat tac agt aaa gta gtc att tat aat gat aca gat aag cgg gct    384Val Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala

    115                 120                 125ttt gtg act gga tat aac atg taa                                    408Phe Val Thr Gly Tyr Asn Met

130                 135<210>9<211>135<212>PRT<213>波氏致病杆菌<400>9Met Ile Thr Ile Asn Ile Ser Gly Gly Asn Val Thr Ile Asn Asn Asn  1               5                  10                  15Ile Ser Ser Val Thr Asp Ile Gln Lys Pro Leu Asp Ala Glu Pro Leu

         20                  25                  30Ser Val Thr Asn Tyr Arg Asp Leu Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Ile

     35                  40                  45Gln Ala Asp Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Thr Arg Pro Asp

 50                  55                  60Tyr Tyr Ile Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Lys Ala Val Phe 65                  70                  75                  80Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Tyr Ser Ser Ile

             85                  90                  95Thr Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Ile Leu Lys Ser Pro Ser Asn Ala

        100                 105                 110Val Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala

    115                 120                 125Phe Val Thr Gly Tyr Asn Met

130                 135<210>10<211>1056<212>DNA<213>波氏致病杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1053)<223>pCIB9354的JHE-样orf2<400>10atg aat aat agt cca atg aat gat cag tta tca aca gcg cct tat tca    48Met Asn Asn Ser Pro Met Asn Asp Gln Leu Ser Thr Ala Pro Tyr Ser  1               5                  10                  15att tcg aca ccc aat tat gaa tgg gat atg tca tca atc ata aaa gat    96Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp

         20                  25                  30gcc att atc ggt ggc ata gga ttt att ccc gga cca ggc cct gca atc    144Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Pro Ala Ile

     35                  40                  45tct ttt tta tta gga ctg ttc tgg cca caa cag aca gac aat acc tgg    192Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp

 50                  55                  60gat caa atc ctc caa aaa atc gaa caa atg ata gaa gaa gcg aat tta    240Asp Gln Ile Leu Gln Lys Ile Glu Gln Met Ile Glu Glu Ala Asn Leu 65                  70                  75                  80aaa acc att aaa ggt ata tta aat gga gat ata caa gaa att aaa gga    288Lys Thr Ile Lys Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly

             85                  90                  95aaa atg gac cat gtg aaa tct atg cta gag aat tct cct ggc agc cag    336Lys Met Asp His Val Lys Ser Met Leu Glu Asn Ser Pro Gly Ser Gln

        100                 105                 110gaa agc cat gat gct tat atg ttt ctg gca agg ttt ttg gtc agt att    384Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Phe Leu Val Ser Ile

    115                 120                 125gat gaa aaa ttc aaa tct ttc gat gat aga aca aat tat caa att ctt    432Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asp Arg Thr Asn Tyr Gln Ile Leu

130                 135                 140ccc atg tac acg aat aca att atg tta caa gcg cct tat tgg aaa atg    480Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met145                 150                 155                 160ggc atc gaa aag aaa gag gat atc ggt tta acc gat att gaa gtt ggt    528Gly Ile Glu Lys Lys Glu Asp Ile Gly Leu Thr Asp Ile Glu Val Gly

        165                     170                 175gaa tta aaa gaa ctt atc gat aaa tta tat act aaa tca tat gat tat    576Glu Leu Lys Glu Leu Ile Asp Lys Leu Tyr Thr Lys Ser Tyr Asp Tyr

   180                      185                 190atc aat aat acg tat aat cgt gaa tat aat aat gca atc aat acg tca    624Ile Asn Asn Thr Tyr Asn Arg Glu Tyr Asn Asn Ala Ile Asn Thr Ser

195                     200                 205acc gca gag agt atc acc aat aat tta ttg tct gtc aga gga tat tgt    672Thr Ala Glu Ser Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys

210                 215                 220tta tta cat ggt tgt gaa tgc ctt gaa gtt att gcg cat ata caa aac    720Leu Leu His Gly Cys Glu Cys Leu Glu Val Ile Ala His Ile Gln Asn225                 230                 235                 240aat agt ctt gat aaa ggc ttc tac cct aaa acg atc agc tat tcg agt    768Asn Ser Leu Asp Lys Gly Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Ser

            245                 250                 255gtt ttc gat cgt cct aca aac aaa atg aga att cag gcg ctt aca gaa    816Val Phe Asp Arg Pro Thr Asn Lys Met Arg Ile Gln Ala Leu Thr Glu

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    275                 280                 285tat aat aaa ata aaa tca ttg gag ggt tat gtc aca agg atc ggc aat    912Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Glu Gly Tyr Val Thr Arg Ile Gly Asn

290                 295                 300gcc ccc cga gtc ggc gga att aaa atc aca ttt gaa aac aac gca tct    960Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys Ile Thr Phe Glu Asn Asn Ala Ser305                 310                 315                 320tat act ctt ggc act gta act tca gaa aca acc tct att gaa ctc aat    1008Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Thr Thr Ser Ile Glu Leu Asn

            325                 330                 335gag agt gtt ata acc agc ata gaa gtg tgg gga gag tgg tgc cgt tga    1056Glu Ser Val Ile Thr Ser Ile Glu Val Trp Gly Glu Trp Cys Arg

        340                 345                 350<210>11<211>351<212>PRT<213>波氏致病杆菌<400>11Met Asn Asn Ser Pro Met Asn Asp Gln Leu Ser Thr Ala Pro Tyr Ser  1               5                  10                  15Ile Ser Thr Pro Ash Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp

         20                  25                  30Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Pro Ala Ile

     35                  40                  45Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp

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        100                 105                 110Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Phe Leu Val Ser Ile

    115                 120                 125Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asp Arg Thr Asn Tyr Gln Ile Leu

130                 135                 140Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met145                 150                 155                 160Gly Ile Glu Lys Lys Glu Asp Ile Gly Leu Thr Asp Ile Glu Val Gly

            165                 170                 175Glu Leu Lys Glu Leu Ile Asp Lys Leu Tyr Thr Lys Ser Tyr Asp Tyr

        180                 185                 190Ile Asn Asn Thr Tyr Asn Arg Glu Tyr Asn Asn Ala Ile Asn Thr Ser

   195                  200                 205Thr Ala Glu Ser Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys

210                 215                 220Leu Leu His Gly Cys Glu Cys Leu Glu Val Ile Ala His Ile Gln Asn225                 230                 235                 240Asn Ser Leu Asp Lys Gly Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Ser

            245                 250                 255Val Phe Asp Arg Pro Thr Asn Lys Met Arg Ile Gln Ala Leu Thr Glu

        260                 265                 270Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ser Phe Val Asn Gly Gln

    275                 280                 285Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Glu Gly Tyr Val Thr Arg Ile Gly Asn

290                 295                 300Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys Ile Thr Phe Glu Asn Asn Ala Ser305                 310                 315                 320Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Thr Thr Ser Ile Glu Leu Asn

            325                 330                 335Glu Ser Val Ile Thr Ser Ile Glu Val Trp Gly Glu Trp Cys Arg

        340                 345                 350<210>12<211>408<212>DNA<213>发光光杆状菌<220><221>CDS<222>(1)..(405)    <223>pCIB9383-21的orf1<400>12atg att aca atc aat atc act ggt gat aat gta aga gtt aat aac aat    48Met Ile Thr Ile Asn Ile Thr Gly Asp Asn Val Arg Val Asn Asn Asn  1               5                  10                  15ata gca aca gaa acc gac ctc caa aat aca cct gct tca gca ccc tta    96Ile Ala Thr Glu Thr Asp Leu Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu

         20                  25                  30tca att att aat ttt agg gat atg aca ata gaa cct cat tca tct gtt    144Ser Ile Ile Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val

     35                  40                  45gag gcg ata aga acc gat aca ccg att att cct gaa tca cga cca aat    192Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn

 50                  55                  60tac tat gtt gct aat tct ggc ccg gcc tca tca gtc aga gct gtt ttc    240Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe 65                  70                  75                  80tat tgg tcc cac tct ttt aca tca gaa tgg ttt gaa tct tcc tct att    288Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile

             85                  90              95att gta aaa gca ggc gaa gac gga gtc tta cat tca ccg ggt aat tct    336Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser

        100                 105                 110tta tat tac agc aag gtt gta att tat aac gat aca gac aaa cgt gct    384Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala

    115                 120                 125ttt gtt acc ggc tac aat cta taa                                    408Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu

130                 135<210>13<211>135<212>PRT<213>发光光杆状菌<400>13Met Ile Thr Ile Asn Ile Thr Gly Asp Asn Val Arg Val Asn Asn Asn  1               5                  10                  15Ile Ala Thr Glu Thr Asp Leu Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu

         20                  25                  30Ser Ile Ile Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val

     35                  40                  45Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn

 50                  55                  60Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe 65                  70                  75                  80Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile

             85                  90                  95Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser

        100                 105                 110Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala

    115                 120                 125Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu

130                 135<210>14<211>1320<212>DNA<213>发光光杆状菌<220><221>CDS<222>(1)..(1317)<223>pCIB9383-21的JHE-样orf2<400>14atg aat aat gaa ccg atg aat act aat gaa tca caa gct tca gag ata    48Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser Glu Ile  1               5                  10                  15gta ccc tca atg aat gaa tct ata tta aat gaa tct ata tta aat gaa    96Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu

         20                  25                  30tct ata tta gca gca cct tat tca att tct aca cct aat tat gaa tgg    144Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp

     35                  40                  45gat atg tca tca ata ata aaa gat gcc att att ggt ggt ata ggc ttt    192Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe

 50                  55                  60att cct ggt ccg ggc tca gca ata tca ttt ttg tta ggg tta ttt tgg    240Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp 65                  70                  75                  80cca caa caa acc gac aat act tgg gag caa att ctc caa aaa gta gaa    288Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln Ile Leu Gln Lys Val Glu

             85                  90                  95caa atg atc gag caa gcc aat ctc aaa act att caa gga ata ttg aac    336Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr Ile Gln Gly Ile Leu Asn

        100                 105                 110ggc gat ata caa gaa att aaa ggc aaa atg gaa cat gtg caa ttc atg    384Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met Glu His Val Gln Phe Met

    115                 120                 125cta gaa tcc tca cct ggc act caa gaa agc cat gac gca tac atg ttt    432Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe

130                 135                 140ctg gcg aga tat ctg gtc agt ata gac gaa aaa ttc aag tct ttt gat    480Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp145                 150                 155                 160aac aaa aca aat tat caa att ctt ccc atg tat acc aat acg att atg    528Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met

            165                 170                 175tta caa gcc cct tat tgg aaa atg ggt ata gag aga aaa gat gag ata    576Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile Glu Arg Lys Asp Glu Ile

        180                 185                 190aaa cta aca gat ata gaa gtt aat gaa tta aaa gag ctg ata gga aaa    624Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gly Lys

    195                 200                 205tta tct acc agc gcc gat aaa tat att cat gat gtc tat act cgt gaa    672Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His Asp Val Tyr Thr Arg Glu

210                 215                 220tat gat aat gcg atg aac act tca aca gca gca aat atc acc aat aat    720Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala Ala Asn Ile Thr Asn Asn225                 230                 235                 240tta tta tct gta aga ggc tat tgt tta tta cat ggt tta gaa tgt ctc    768Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu His Gly Leu Glu Cys Leu

            245                 250                 255gaa gtc att aac cat ata caa aat aat agc ctt gag caa agt ttt tat    816Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser Leu Glu Gln Ser Phe Tyr

        260                 265                 270cct aaa act atc agc tac tcc acc gta ttc gat cgc cag aca aat aaa    864Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe Asp Arg Gln Thr Asn Lys

    275                 280                 285aca agg gtt caa gcc ctg aca gaa gac gat caa atg caa gag cca ttc    912Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe

290                 295                 300aag cct gct tta att aat ggg aag tac aac aaa ata aaa tca ttg att    960Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Ile305                 310                 315                 320ggg tat gta caa aga atc gga aac gca ccc aga gtt gga ggc att aaa    1008Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys

            325                 330                 335gtc aca ttt gca aac gat gca tct tat acc ctc ggt aca gta act tca    1056Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser

        340                 345                 350gaa gta aac tca att gaa ctg aat gac agc gtt ata acc agc ctg gaa    1104Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser Val Ile Thr Ser Leu Glu

    355                 360                 365gta tgg gga aat ggc gct gtt gat gag gca ttc ttt aca tta agt gac    1152Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala Phe Phe Thr Leu Ser Asp

370                 375                 380gga cgt caa ttt agg ctt ggc caa cgc tat gcc agt aac tat aga aaa    1200Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr Ala Ser Asn Tyr Arg Lys385                 390                 395                 400tat gct gtc gat aac cac tat att tca gga ttg tac tta gcc agt gat    1248Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Ala Ser Asp

            405                 410                 415gaa cct tca ttg gca ggt caa gca gca ggc att gca gtt tca tac cat    1296Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly Ile Ala Val Ser Tyr His

            420             425                 430atg ata gct gat aaa aaa tca tag                                    1320Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser

    435<210>15<211>439<212>PRT<213>发光光杆状菌<400>15Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser Glu Ile  1               5                  10                  15Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu

         20                  25                  30Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp

     35                  40                  45Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe

 50                  55                  60Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp 65                  70                  75                  80Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln Ile Leu Gln Lys Val Glu

             85                  90                  95Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr Ile Gln Gly Ile Leu Asn

        100                 105                 110Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met Glu His Val Gln Phe Met

    115                 120                 125Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe

130                 135                 140Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp145                 150                 155                 160Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met

            165                 170                 175Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile Glu Arg Lys Asp Glu Ile

        180                 185                 190Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gly Lys

    195                 200                 205Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His Asp Val Tyr Thr Arg Glu

210                 215                 220Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala Ala Asn Ile Thr Asn Asn225                 230                 235                 240Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu His Gly Leu Glu Cys Leu

            245                 250                 255Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser Leu Glu Gln Ser Phe Tyr

        260                 265                 270Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe Asp Arg Gln Thr Asn Lys

    275                 280                 285Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe

290                 295                 300Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Ile305                 310                 315                 320Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys

            325                 330                 335Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser

        340                 345                 350Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser Val Ile Thr Ser Leu Glu

    355                 360                 365Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala Phe Phe Thr Leu Ser Asp

370                 375                 380Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr Ala Ser Asn Tyr Arg Lys385                 390                 395                 400Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Ala Ser Asp

            405                 410                 415Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly Ile Ala Val Ser Tyr His

        420                 425                 430Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser

    435