鼠李糖取代的β－D－葡萄糖基－薯蓣皂甙的皂甙库、制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种含有β－D－葡萄糖基－薯蓣皂甙、单鼠李糖取代或多鼠李糖取代的β－D－葡萄糖基－薯蓣皂甙中的5—16种的皂甙库。该皂甙库由易得的甙元和单糖出发,经过一步随机糖苷化反应或随机酰化和随机糖苷化两步随机化反应联用,再经去除保护基而制备。该皂甙库用于为药物筛选提供具有生理活性的化合物库。

说明书

本发明涉及一种鼠李糖取代的β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙的皂甙库，具体的说是一种含有一个糖基到五个糖基的单糖皂甙到五糖皂甙的皂甙库。

皂甙是一类结构复杂的活性化合物，它们在植物中分布很广，许多皂甙类化合物已被证实具有多种生理活性和良好的药理作用，如抗癌、抗菌、消炎、降血压以及调节免疫功能等。但是到目前为止，对于皂甙的合成还局限于传统的上保护基-去保护基的分步方法上[Highlyefficient glycosylation of sapogenins．Shaojiang Deng，Biao Yu，Jianming Xie，Yongzheng Hui．J．Org．Chem．，1999，64，7265-7266]，这大大限制了皂甙化合物的合成和筛选过程。许多传统的中草药如人参、远志、麦冬等的有效成分中都含有皂甙，这些有效成分是由多种结构相似的皂甙同系物组成的，它们可以同时起药理作用。近年来Hindsgaul等人发展了用随机糖苷化反应制备三糖库的方法[A strategy of “random glycosylation” for the production of oliogosaccharide libraries．Osamu Kanie，Frank Barresi，Yili Ding，Jill Labbe，Albin otter，L．Scott Forsberg，Beaternst，Ole Hindsgaul．Angew．Chem．Int．Ed．Engl．，1995，34，2720-2722]，但是迄今为止，还没有制备皂甙库的报道。因此，发展组合化学的方法从易得的甙元和单糖出发简便地制备含有所有可能同系物的皂甙库是很有意义的。

本发明的目的是提供一种含有5-16种单鼠李糖取代或多鼠李糖取代的β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙的皂甙库。

本发明的另一目的是提供一种制备上述含有5-16种单鼠李糖取代或多鼠李糖取代的β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙的皂甙库的方法。

本发明的目的还提供一种上述含有5-16种单鼠李糖取代或多鼠李糖取代的β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙的皂甙库的用途，即为药物筛选提供具有生理活性的化合物库。

本发明采用小组的“随机糖苷化方法”，从易得的甙元和单糖出发经过一步或两步随机化反应，再经去除保护基反应制备出具有所有可能性的鼠李糖取代的二糖、三糖、四糖和五糖的皂甙混合物库，并使用气相色谱-质谱联用的分析方法对其构成进行表征，该皂甙库含有如下皂甙a-p中的5-16种：a)β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，相对摩尔百分含量为0-20％；b)鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，相对摩尔百分含量为0-35％；c)鼠李糖基(1→3)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，相对摩尔百分含量为0-35％；d)鼠李糖基(1→4)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，相对摩尔百分含量为0-30％；e)鼠李糖基(1→6)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，相对摩尔百分含量为0-35％；f)二鼠李糖基(1→2，1→3)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-25％；g)二鼠李糖基(1→2，1→4)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-25％；h)二鼠李糖基(1→2，1→6)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，相对摩尔百分含量为0-20％；i)二鼠李糖基(1→3，1→4)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-15％；j)二鼠李糖基(1→3，1→6)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-20％；k)二鼠李糖基(1→4，1→6)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-15％；l)三鼠李糖基(1→2，1→3，1→4)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-35％；m)三鼠李糖基(1→2，1→3，1→6)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-30％；n)三鼠李糖基(1→2，1→4，1→6)-3-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-35％；o)三鼠李糖基(1→3，1→4，1→6)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-30％；p)四鼠李糖基(1→2，1→3，1→4，1→6)-β-D-葡萄糖基-薯蓣皂甙，  相对摩尔百分含量为0-25％。

本发明的皂甙库所含皂甙a-p的量可以在上述范围内变化，例如下述各库所示：库I，包含：                    库II，包含：皂甙b，摩尔百分含量0-30％；    皂甙a，摩尔百分含量3-20％；皂甙c，摩尔百分含量0-30％；    皂甙b，摩尔百分含量3-35％；皂甙d，摩尔百分含量0-30％；    皂甙c，摩尔百分含量5-15％；皂甙e，摩尔百分含量15-35％     皂甙d，摩尔百分含量2-12％；皂甙f，摩尔百分含量0-6％；     皂甙e，摩尔百分含量1-7％；皂甙g，摩尔百分含量0-6％；     皂甙f，摩尔百分含量3-15％；皂甙h，摩尔百分含量5-25％；    皂甙g，摩尔百分含量3-15％；皂甙j，摩尔百分含量5-25％；    皂甙h，摩尔百分含量1-12％；皂甙i，摩尔百分含量0-10％；    皂甙i，摩尔百分含量2-7％；皂甙k，摩尔百分含量5-12％；    皂甙j，摩尔百分含量1-12％；皂甙m，摩尔百分含量0-20％；    皂甙k，摩尔百分含量2-4％；皂甙n，摩尔百分含量0-7％；     皂甙l，摩尔百分含量0-15％；皂甙o，摩尔百分含量0-30％；    皂甙m，摩尔百分含量1-12％；

                           皂甙n，摩尔百分含量2-15％；

                           皂甙o，摩尔百分含量3-20％；

                           皂甙p，摩尔百分含量3-7％；

库III，包含：                 库IV，包含：

皂甙f，摩尔百分含量0-3％；    皂甙b，摩尔百分含量5-35％；

皂甙g，摩尔百分含量0-3％；    皂甙c，摩尔百分含量2-35％；

皂甙h，摩尔百分含量5-10％；   皂甙d，摩尔百分含量5-20％；

皂甙j，摩尔百分含量5-10％；   皂甙f，摩尔百分含量7-25％；

皂甙i，摩尔百分含量0-5％；    皂甙g，摩尔百分含量7-25％；

皂甙m，摩尔百分含量10-30％；  皂甙i，摩尔百分含量2-5％；

皂甙n，摩尔百分含量5-35％；   皂甙l，摩尔百分含量0-35％；

皂甙o，摩尔百分含量10-30％；

皂甙p，摩尔百分含量15-25％；

本发明的皂甙库可具有生理活性。

本发明的方法中，采用一步随机糖苷化反应或者通过两步随机化反应连用先随机酰化后随机糖苷化，得到随机糖苷化产物后，再将上述糖苷化产物经还原反应去除保护基制备皂甙库。具体的说，采用β-D-葡萄糖基薯蓣皂甙或其衍生物为起始原料，在其葡萄糖基的2，3，4，6位中任意一位或多位的羟基上随机连接鼠李糖基得到同系列的糖苷化产物。或者由β-D-葡萄糖基薯蓣皂甙或其衍生物先和酰基给体发生随机酰化反应，采用随机酰化后的产物作为糖苷化的起始原料，进一步发生随机糖苷化反应。然后将随机糖苷化反应产物用一价金属还原脱除保护基得到β-D-葡萄糖基薯蓣皂甙、单鼠李糖基取代的β-D-葡萄糖基薯蓣皂甙、多鼠李糖基取代的β-D-葡萄糖基薯蓣皂甙或它们的混合物，即获得本发明的皂甙库。

本发明的方法可以用下述反应式表示：

上述反应式中，n=0、1、2、3或4，m=1、2、3或4，且m≥n，

R¹=甲酰基(Formyl)、乙酰基(Ac)、丁二酰单甲酯基(COCH₂CH₂COOCH₃)、苯甲酰基(Bz)或三甲基乙酰基(Piv)等。

R²=羟基全保护的鼠李糖基，其分子式是：式中R⁵是含有1-7个碳原子的酰基或苄基。

R³=鼠李糖基，其分子式是：

R⁴=异头碳位置经过活化的其余羟基全保护的鼠李糖，其分子式是：其中X是卤素、-SEt、-Sph、例如：全苄基化的鼠李糖硫苷，分子式是：全乙酰化的鼠李糖硫苷，分子式是：全苯甲酰化的鼠李糖三氯亚胺酯，分子式是：全苯甲酰化的鼠李糖溴苷，分子式是：

本发明的方法可进一步描述如下：

酰基给体和β-D-葡萄糖基薯蓣皂甙在或者不在极性溶剂中，并用有机碱下催化下发生酰化反应，使上述皂甙葡萄糖基的羟基上发生部分酰化反应，该反应时间为0．5-25小时，反应温度为-20℃至室温。其中β-D-葡萄糖基薯蓣皂甙、酰基给体和有机碱的摩尔比依次是1∶0．5-5∶1-1000。所述酰基给体是含有1-8个碳原子的各种酸酐或酰卤，如乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐、丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐、乙酰氯、乙酰溴、正丁酰氯、三甲基乙酰氯、苯甲酰卤、对硝基苯甲酰氯等。

在极性溶剂中，用上述酰化产物或者直接用β-D-葡萄糖基薯蓣皂甙或其衍生物作为糖基受体，异头碳位置经过活化的羟基全保护的鼠李糖R⁴作为糖基给体，并添加少量的经过活化的分子筛、硅胶、硅藻土或离子交换树脂作为吸水剂，在促进剂和吸水剂作用下发生随机糖苷化反应，使糖基受体中葡萄糖基上未被酰化的羟基与糖基给体发生糖苷化。该反应时间为0．5-25小时，反应温度为-20℃至室温。其中糖基受体或上述酰化产物、糖基给体和促进剂的摩尔比依次为1∶0．5-8∶0-5。

随机酰化所用有机碱是至少含有一个氮原子的有机碱，如三乙胺(Et₃N)、吡啶(Py)、二异丙基乙基胺(DIEA)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)等。随机酰化或糖苷化反应所用极性溶剂是四氢呋喃(THF)、N，N二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶、二氯甲烷或二氧六环等。随机糖苷化所用促进剂是C₁-C₆的卤代酰胺、C₁-C₆的卤代烃基磺酸、C₁-C₆的卤代烃基磺酸酯、C₁-C₆的卤代烃基磺酸盐、C₁-C₆的三甲基硅基卤代磺酸酯、三氟化硼-乙醚或它们的混合物，如N-碘代丁二酰亚胺(NIS)、N-碘代丁二酰亚胺(NIS)-三氟甲磺酸银(AgOTf)混合物、N-碘代丁二酰亚胺(NIS)-三氟甲磺酸(TfOH)混合物、三甲基硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、三氟甲磺酸银(AgOTf)、三氟化硼-乙醚(BF₃·Et₂O)等。这类反应还可加入弱碱淬灭反应，通常可加入NH₃、(CH₃)₃N、(C₂H₅)₃N等淬灭反应。

然后可取随机糖苷化反应产物，在极性溶剂和液氨中用一价金属还原剂还原，通过脱除葡萄糖基上随机酰化所连的酰基以及随机糖苷化所连的鼠李糖基上的保护基，将上述基团还原为羟基，获得最终产物皂甙库。该还原反应中随机糖苷化产物与还原剂的摩尔比为1∶1-500，每克随机糖苷化产物用1-1000ml的液氨，采用更多量的液氨对反应没有影响。还原反应时间为0．1-2h，所述的一价金属是锂、钠、钾、铷或铯等。

所获的皂甙库经衍生化制成部分甲基化的阿尔迪醇乙酸酯后，进行气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析，从气相色谱图上可以算出每一组分的相对摩尔质量。将与每组色谱峰相对应的色谱图和标准质谱图相比较，便可知每一组分的化学组成，从而可推知相应皂甙的具体结构。

本发明首次提供了一种具有生理活性的随机化合成的皂甙库。随机化反应拓展了皂甙化合物的合成和筛选过程，而且原料易得，方法简便，大大提高了合成此类化合物的效率，为发现和筛选新的皂甙化合物提供了一种高效、方便的方法，与从天然植物中提取方法相比，具有工业化前景。通过一步或两步随机化反应，不仅可以获得各种类型的皂甙库，而且也可以为药物筛选提供新的具有生理活性的化合物库。

通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容：

实施例1

随机酰化反应的一般步骤

取延龄草甙230mg(0．4mmol)于1．5-3mlPy或DMAP中，冰浴冷却下缓慢滴加Ac₂O19-188μl(0．2-2．0mmol)。冰浴维持0．5h后撤去，于-20℃至室温继续搅拌反应0．5-24h。后处理如下：减压下将Py或DMAP大部分除去。残余物用70ml CH₂Cl₂萃取，用饱和NaCl水洗三次并干燥。将溶剂减压蒸除后得白色固体。

实施例2

随机糖苷化的一般步骤

取随机酰化产物(或延龄草甙)0．16mmol，全苄基保护的鼠李糖硫苷或全苯甲酰化保护的鼠李糖三氯亚胺酯0．32mmol-0．64mmol溶于二氧六环3-5ml中，并转移至经火烘干的带支管的试管中(含1-5埃分子筛160mg)。氩气保护下于-20℃至室温搅拌30min后，加入NIS或BF₃·Et₂O的量为0．35mmol-0．70mmol，并迅速加入AgOTf甲苯溶液(0．19M)0．33-0．67ml。于-20℃至室温反应0．5-24h后加入Et₃N1ml淬灭反应。将反应液过滤，用CH₂Cl₂洗涤滤饼。滤液与洗涤液合并，CH₂Cl₂ 100ml稀释，依次用饱和Na₂S₂O₃，饱和NaCl水洗涤，MgSO₄干燥。减压蒸除溶剂，残余物用粗硅胶拌样上柱，用硅胶H柱层析纯化。用石油醚(10∶1)梯度洗脱，收集CH₂Cl₂与CH₂Cl₂-CH₃OH(20∶1)洗脱的洗脱液，将其减压浓缩后得棕色固体或油状物。

实施例3

Li／NH₃还原的一般步骤

取随机糖苷化反应产物180mg溶于3ml THF中备用。让NH₃冷凝在三口瓶中。干燥后，再将其蒸馏至50ml反应瓶中0．2-180ml左右，加入Li或钾丝300mg并搅拌。缓慢滴加随机糖苷化产物的THF溶液进行还原反应。滴完后-70℃左右继续反应0．1-2h，让其自然升至室温，至NH₃基本挥发完后，冰浴下加入CH₃OH淬灭反应，并调体系的PH值为酸性。减压蒸除甲醇余一油状物，用约70ml正丁醇稀释，用蒸馏水充分洗涤。待有机相与水相充分分层后，将正丁醇分出，在油泵减压下于水浴室温-35℃将其浓缩至小体积。加入大量无水乙醚后产生白色沉淀，过滤得Li／NH₃还原产物。

实施例4

实验结果表1  反应条件及皂甙库的分布表2  皂甙库中各皂甙的相对摩尔百分含量

实施例5

抗肿瘤生物活性体外筛选实验结果评定：无效：l0-5mol／l＜85％

弱效：l0-5mol／l≥85％或10-6 mol／l≥50％

强效：10-6mol／l≥85％或10-7 mol／l＞50％

表3筛选方法：磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法细胞株：A-549人肺腺癌              作用时间：72h

对肿瘤细胞生长的抑制率％

表4筛选方法：四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法细胞株：P388小鼠白血病             作用时间：48h

对肿瘤细胞生长的抑制率％