筛选基因变异和蛋白质结合的DNA片段的方法

摘要

本发明主要包括制备DNA片段、检测与蛋白质结合的DNA片段和鉴定基因变异的方法。检测蛋白质结合DNA片段的方法:基因组DNA用内切酶酶切或用引物进行的PCR扩增制备出片段,用基团修饰这些DNA片段的末端,使与相应的固相载体表面进行共价交联,用微阵列点样设备将各种DNA片段点样子固相载体表面并共价交联之,制备成DNA芯片,用这种DNA芯片筛选蛋白质结合的DNA片段的方法。

说明书

本发明涉及的是一种鉴定基因变异和筛选蛋白质结合的DNA片段的方法。属于分子生物技术领域。

蛋白质与DNA的结合是基因表达调控、染色体结构构建、DNA复制与修复、基因转录等的关键。已经建立了一些鉴定DNA与蛋白质结合的方法。体外法有凝胶阻滞实验、分子筛过滤实验等；体内法有一元杂交法，就是将一个报告基因置于一段可能与蛋白质相结合的DNA片段的下游，在同一细胞中将可能的DNA结合蛋白与基因转录蛋白的活化域融合表达，如果该蛋白质与这段DNA相结合，报告基因就会表达。这些方法的最大缺点是工作量大，一次只能分析一种DNA结合蛋白；另一个缺点是盲目性大。分子生物学领域急需一种一次能够筛选生物体内所有的DNA结合蛋白所结合的DNA片段的方法。基因多态性分析是当今人类遗传学研究的一个重要研究领域，进行这种分析的技术有DNA序列测定、正常人基因与遗传并患者等位基因配对后进行梯度变性电泳(SSCP)、限制性酶切图谱分析等。这些技术的工作量大；而且在基因背景知识缺乏时，要进行连锁分析，否则盲目性大；对于多基因遗传病，很难用这些方法进行分析鉴定。最近文献中出现了用基因芯片分析基因多态性的方法，索顿E．M.1996.DNA芯片：大规模寡核苷酸杂交分析序列。遗传学进展。12(3)：110-115。该方法就是将序列已知的DNA片段以寡核苷酸的形式固定于固相载体的表面，待测个体的等位基因用荧光基团标记，然后与DNA芯片杂交。这种技术在检测序列已知基因的多态性方面很有用，但不能分析序列未知基因的多态性，而且需要合成大量的寡核苷酸片段，费用大，这种方法产生的信号量大，分析的难度高。

本发明的目的是在于克服现有技术的不足，提供一种筛选基因变异和蛋白质结合的DNA片段的方法。

本发明的技术方案如下：主要包括制备DNA片段的方法、检测与蛋白质结合的DNA片段的方法和鉴定基因变异的方法。

1．检测蛋白质结合DNA片段的方法如下：基因组DNA用限制性内切酶酶切或用特异性的引物进行的PCR扩增制备出包含整个基因组的不同的DNA片段，用特异性基团修饰这些DNA片段的末端，使之能够与相应的固相载体表面进行共价交联，用微阵列点样设备将各种DNA片段点样于固相载体表面并共价交联之，制备成DNA芯片，用这种DNA芯片筛选蛋白质结合的DNA片段的方法是(a)将DNA芯片直接与荧光标记的蛋白质保温，芯片的荧光信号位点表示蛋白质所结合的DNA片段；或(b)将DNA片段直接与蛋白质保温，然后用DNase酶切，与蛋白质相结合的DNA片段不会被DNase酶切，用同位素或荧光基团标记被保护的DNA片段，最后与DNA芯片杂交；或者将被保护的DNA片段直接与DNA芯片杂交，再用DNA连接酶或RNA连接酶或DNA聚合酶酶促反应标记与芯片杂交的DNA片段，芯片上的同位素信号或荧光信号表示与蛋白质结合的DNA片段。

2．鉴定基因变异的方法如下：DNA芯片的制备方法同上，但后续的方法稍有不同。将来源于不同个体的DNA片段(一种是正常型或称为标准型，另一种称为变异型或待测型)进行杂交，杂交产物有三种：(1)两条链都来源于正常型，DNA完全配对；(2)两条链都来源于变异型，DNA完全配对：(3)一条链来源于正常型，另一条链来源于变异型，变异处的DNA碱基误配或不能配对，因此能够与DNA修复蛋白如MUT S结合，将杂交产物与MUT S结合后，用DNase酶切，碱基误配或不配的DNA片段没有被酶切，用同位素或荧光标记基团标记被保护的DNA片段，再与DNA芯片杂交；或者直接将被保护的DNA片段与DNA芯片杂交，然后用RNA连接酶或DNA连接酶或DNA聚合酶酶促反应标记同位素或荧光基团，DNA芯片上的同位素或荧光信号表示基因变异所在的DNA片段，另一种方法是将变异型的DNA片段与DNA芯片进行杂交，杂交后与同位素或荧光标记的MUT S保温，或者与用显色酶交联的MUT S保温后进行显色，芯片上的型号位点表示基因变异所在的DNA片段。

本发明的显著性效果和实质性特点表现在：(1)能够大规模筛选与蛋白质相结合的DNA片段，鉴定基因变异所在的DNA片段：(2)操作容易，数据全面。(3)信号简单，易于分析。因此能够大大促进相关的研究与开发。

以下结合附图对本发明实施例进一步描述：

图1正常型基因组DNA进行PCR扩增的示意图。

图2正常型基因组DNA限制性酶切制备DNA片段的示意图。

图3正常型基因组DNA限制性酶切后进行PCR扩增的示意图。

图4DNA芯片制备的示意图。

图5DNA芯片直接与蛋白质结合的示意图。

图6与蛋白质结合的DNA片段标记后与DNA芯片杂交的示意图。

图7与蛋白质结合的DNA片段与DNA芯片杂交后再标记的示意图。

图8待测DNA与DNA芯片杂交后与MUT S结合的示意图。

图9误配DNA片段标记后与DNA芯片杂交的示意图。

图10误配DNA片段与DNA芯片杂交后进行标记的示意图。

1．可以用下列方法制备DNA片段并制造DNA芯片：

如图1所示，→正向引物，←反向引物。标准型基因组DNA直接用一套特异性引物进行PCR扩增，制备出成千上万种适宜于芯片制备的DNA片段。

如图2所示，正常型基因组DNA第1步用限制性内切酶酶切，第2步用凝胶技术技术或其它技术分离，制备成各种DNA片段。然后用特异性基团修饰末端，使之适宜于点样后与固相表面基团的共价交联。经过适当的途径如电泳、层析等技术分离，制备出多种多样的DNA片段。用适当的化学基团修饰这些DNA片段的末端，使之适宜于用来制备DNA芯片。

如图3所示，正常型基因组DNA第1步用限制性内切酶酶切，第2步酶切产物与适当的LINKER连接，第3步用能够与相应的LINKER进行配对，但3＇-末端带有额外4个核苷酸的引物进行PCR扩增，因此有256x256种引物组合进行PCR反应。

如图4所示，用图1-3所示的方法所获得的DNA片段，用手工或微阵列点样设备点样于适当的基片表面并进行共价交联反应，制备DNA芯片。

2．可以用下列方法筛选与蛋白质结合的DNA片段：

如图5所示，与放射性同位素或荧光基团标记或与显色酶交联的DNA结合蛋白保温，DNA与蛋白质结合后，洗去沸腾一行结合的蛋白质，用检测设备检测蛋白质的结合位点，如果DNA结合蛋白是酶交联的，先显色后检测。芯片上的相应位出现信号●，这种信号表示蛋白质所结合的DNA片段。

如图6所示，第1步蛋白质与DNA在液相中结合，第2步用DNase酶切，第3步回收蛋白质结合的DNA片断，第4步用放射性同位素或荧光标记，受保护的DNA片段用放射性同位素或荧光基团保护，第5步与DNA芯片杂交。芯片信号●表示与蛋白质结合的DNA片段。

如图7所示，第1步蛋白质与DNA在液相中结合，第2步然后用DNase酶切，第3步回收被保护的DNA片断，第4步与DNA芯片进行核酸杂交，然后用酶促反应进行同位素或荧光标记，受保护的DNA片段直接与DNA芯片杂交，然后在RNA连接酶或DNA连接酶或DNA聚合酶的酶促反应中用放射性同位素或荧光基团标记芯片上的杂交位点。芯片信号●表示与蛋白质结合的DNA片段。

3．可以用下列方法鉴定基因变异：

如图8所示，待测DNA片段首先与DNA芯片进行杂交，然后与DNA修复蛋白MUT S(DNA修复DNA修复蛋白是用放射性同位素或荧光基团标记，或者与适当的显色酶交联)结合(注意：与显色酶交联的DNA修复蛋白与DNA芯片结合后必须进行显示反应)，芯片信号●表示变异所在的DNA片段。

如图9所示，第1步正常型DNA和变异型DNA在液相中杂交，双链1的两条链来源于正常型，双链2的一条正常型，另一条为变异型，双链3的两条链均来源于变异型，第2步再与DNA修复蛋白如MUT S结合，第3步用DNase酶切，第4步回收保护的DNA片断，用放射性同位素或荧光基团标记被保护的DNA片段，第5步与DNA芯片杂交。芯片信号●表示变异所在的DNA片段。

如图10所示，第1步正常型DNA与变异型DNA先杂交，第2步再与DNA修复蛋白如MUT S结合，第3步用DNase酶切，第4步受保护的DNA片段直接与DNA芯片杂交，最后在RNA连接酶或DNA连接酶或DNA聚合酶酶促反应中用放射性同位素或荧光基团标记杂交的DNA片段。芯片信号●表示变异所在的DNA片段。

4、DNA芯片信号的检测：

放射性同位素标记产生的信号可以用X-光片自显影或同位素成像仪或扫描仪检测，荧光基团标记或其它发光物质产生的信号可以用光学检测设备检测。