液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺

摘要

本发明公开了一种液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺。本发明采用的微生物为灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌种,采用液体好氧发酵法、液体好氧发酵－液体静置培养法或液体静置培养法进行生产,可以同时获得灵芝胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸,灵芝酸含量可达2.8毫克/100毫克,胞内和胞外多糖总量高达2.34克/升,培养技术简便,本发明所述的方法为一种具有工业化前景的生产方法。

说明书

本发明属于生物工程与技术领域。涉及一种灵芝多糖和灵芝酸的生产工艺，尤其涉及一种发酵法生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺。

灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌。自古以来，在东亚地区人们就将其作为药物或补品食用。现代医学研究发现灵芝中所含有效成分主要有多糖类(即：灵芝多糖)、三萜类(主要为灵芝酸类)、甾醇类、生物碱类、呋喃类衍生物、蛋白质、多肽和有机锗核苷等。在灵芝药用价值被广泛揭示的同时，灵芝的产量成为抑制灵芝应用的瓶颈，因为在自然界中野生的灵芝十分稀少，且其中灵芝酸含量为1毫克/100毫克干重，远不能满足人们的需要。同灵芝人工栽培相比，发酵法生产灵芝有效成份由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种更有效的方法。

有关灵芝深层发酵研究开始于七十年代，当时的研究侧重于如何确保灵芝菌丝体成功发酵以及如何获得较多的生物量。八十年代以来，人们开始注意如何获得其生物活性物质，其中主要集中在灵芝多糖(特别是胞外多糖)的发酵生产研究方面，如：

文献：李平作，徐柔，章克昌，灵芝胞外多糖深层发酵培养基的优化；无锡轻工大学学报1998，17(4)：26-30报道了一种方法，但该方法只能生产灵芝多糖；

文献：罗立新，姚汝华，周少奇，灵芝深层培养工艺的研究；华南理工大学学报(自然科学版)1997，25(5)：67-70报道了一种方法，但该方法灵芝多糖产量仅为1.0-2.1克/升左右；

日本专利：公开特许公报特开平4-304890，5pp公开了另一种主要生理活性物质—灵芝酸的发酵生产工艺，但其未提及灵芝多糖生产，且所得的产物中灵芝酸的含量仅为0.46-1.0毫克/100毫克干重；

还有不少的专利和文献也公开和报道了各种方法，但是，其主要生理活性物质均较低，同时也只报道了灵芝多糖的生产。

同时值得注意的是，由于灵芝多糖和灵芝酸分别为初级代谢产物和二次代谢产物，两者的发酵生产条件不一，需要加以综合考察来同时优化灵芝多糖(包括胞外和胞内多糖)及灵芝酸的生产过程。因此有关用液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的研究至今未见报道。

综上所述，至今尚无成熟的液体发酵法生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺，因此，尽快开发研究一种通过液体发酵法能够同时生产灵芝多糖和灵芝酸的技术，是人们所十分期望的。

本发明的目的在于公开一种液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺，以满足人们的需要。

本发明的构思是这样的：

发明人认为，只要采用合适的菌种，在同一发酵过程中采用适当培养条件，便可从灵芝发酵液中分离获得高产率的灵芝胞外多糖，从灵芝菌丝体中抽提获得高产率的灵芝胞内多糖和高产率的灵芝酸，从而为工业化经济生产灵芝多糖和灵芝酸奠定基础。

根据上述构思，发明人通过大量的实验，提出了实现本发明目的的如下所述的技术方案：

使用的微生物：

用于生产所述的灵芝多糖和灵芝酸的微生物为灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌种，具体的菌株如下：

67军军直卫生所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.75的菌株；

上海吴淞中学发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.110的菌株；

日本京大发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCNo.5.533的菌株；

中国贵州发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCNo.5.616的菌株；

中科院微生物研究所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.644的菌株；

中国农业科学院发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.5.653的菌株。

上述菌种的有关性质可以参阅中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)菌种目录，本发明不再赘述。

培养方法：

用上述菌属的菌种采用液体好氧发酵法、液体好氧发酵-液体静置培养法或液体静置培养法，以蔗糖或葡萄糖为碳源、蛋白胨和酵母膏为氮源作为种子培养基，并加入适量的无机盐和维生素，将菌种接种到液体培养基，通过液体发酵而获得含有灵芝胞外多糖的发酵液以及含有灵芝胞内多糖和灵芝酸的灵芝菌丝体，上述培养方法对温度并无严格要求，一般在室温进行。现分别叙述如下；

①液体好氧发酵法：

接种10-1000毫克干重/升种子于有培养基的摇瓶中，20-35℃，80-180转/分钟回旋培养，发酵4-12天；

②液体好氧发酵-液体静置培养法：将上述发酵产物静置培养，静置6-20天，结束培养，收获菌丝体和发酵液。在静置培养阶段细胞量也有增加，同时也有利于灵芝酸合成；

③静置培养法：

接种10-1000毫克干重/升种子于有培养基的摇瓶中，20-35℃，静置培养10～20天；

培养基可以采用常规的含有碳源、氮源、无机盐和维生素等成分的培养基。其中：碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、糖蜜或土豆汁等；氮源有酵母膏、蛋白胨、酪蛋白或黄豆饼粉等；无机盐包括KH₂PO₄和MgSO₄。其中当碳源中加入土豆汁时将更有利于细胞快速生长，葡萄糖、蔗糖有利于胞外多糖合成，麦芽糖有利于获得高的细胞量，乳糖有利于胞内多糖合成。有机氮源有利于细胞吸收利用。

胞外多糖通过乙醇沉淀法获得。胞内多糖通过碱溶解菌丝体后，乙醇沉淀法获得。灵芝酸通过乙醇水溶液提取后经过初步纯化获得。以上所说的方法均为现有技术，在许多文献中已有阐述，本发明不再赘述。

采用常规的分析方法对产物进行分析测试，结果表明，所述的方法可以同时获得灵芝胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸，灵芝酸含量可达2.8毫克/100毫克，胞内和胞外多糖总量高达2.34克/升，明显高于以往报道和市售灵芝。

综上所述，本发明获得的灵芝酸含量明显高于文献报导水平，胞内多糖含量略高于文献报导水平而胞外多糖含量同文献报导水平接近。通过本方法可以在灵芝发酵过程中以较高产率同时获得灵芝酸和灵芝多糖这两种灵芝主要药理成分。相对于现有采用类似液体发酵手段仅生产一种灵芝多糖而言，本方法由于不会增加复杂附加设备且培养技术简便，如在工业上实现灵芝酸和灵芝多糖这二种高值有效成分的同时生产，必将大幅度提高生产过程的经济效益，也会带来可观的社会效益。这些产品都具有较高的药用价值，可广泛用于医药和食品保健等行业。由此可见，本发明所述的方法确为一种具有工业化前景的生产方法。

以下将通过实施例对本发明的有关细节作进一步的说明。

                   实施例1

采用的菌种：CGMCC No.5.616；

发酵液体培养基中含有葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母膏5克/升，KH₂PO₄1克/升，MgSO₄ 0.5克/升，VB₁ 0.05克/升。发酵温度为30℃，接种15毫克菌丝体于50毫升培养基/250毫升摇瓶中培养8天。结束发酵，收获菌丝体和发酵液，并进行以下分析测定：

在15000rpm下离心分离获得菌丝体15.4克/升以及发酵液；

发酵液中加入4倍体积的95％的乙醇，混合过夜，在10000rpm下离心沉淀得胞外灵芝多糖。经1摩尔/升NaOH溶解，采用浓硫酸-苯酚法测定多糖含量为0.8克/升；

菌丝体在45℃干燥，取100毫克，加入3毫升50％乙醇提取灵芝酸两次，在4000rpm下离心，上清液50℃干燥，用2毫升水溶解，并用2毫升氯仿萃取，取氯仿相，再用5％小苏打2毫升萃取，取水相，加入2摩尔/升盐酸至pH＝3，加入氯仿，取氯仿相，挥干后用乙醇溶解后紫外比色法测定灵芝酸，计算得含量为1.43毫克/100毫克干重，产量为214毫克/升；

菌丝体100毫克，加入1摩尔/升NaOH溶解，浓硫酸-苯酚法测定胞内多糖为8毫克/100毫克干重，产量为1.1克/升。

                    实施例2

好氧发酵条件同实例1，发酵4天后，停止摇瓶振荡，转为静置培养。静置培养8天后，结束培养，收获菌丝体和发酵液，进行有效成份分析。测定方法同实例1，结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为20.9克/升，0.47克/升，1.4克/升(胞内含量6.6毫克/100毫克干重)，581毫克/升(胞内含量2.8毫克/100毫克干重)。

                   实施例3

液体发酵培养基的碳源为乳糖，发酵条件同实例1，培养10天后，结束发酵并收获菌体和发酵液。分析结果，细胞干重、胞外多糖、胞内多糖和灵芝酸产量分别为16.81克/升，0.35克/升，1.99克/升(胞内含量11.83毫克/100毫克)，207毫克/升(胞内含量1.40毫克/100毫克干重)。

                   实施例4

采用的菌种：CGMCC No.5.75；

每升发酵液培养基中含200克马铃薯提取液0.6升，蔗糖30克/升，蛋白胨2克/升，KH₂PO₄ 1.5克/升，MgSO₄ 0.75克/升，VB₁ 0.001克/升。发酵温度为30℃，接种1毫克菌丝体于50毫升培养基/250毫升摇瓶，培养12天。结束发酵，收获菌丝体和发酵液，分析测试方法同实施例1，分析结果表明，细胞干重、胞内多糖和灵芝酸产量分别为8克/升，0.36克/升(胞内含量4.5毫克/100毫克)，112毫克/升(胞内含量1.40毫克/100毫克干重)。

               实施例5～10

采用菌种分别为CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCCC No.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653中的一种；培养方法与实施例4相同，分析测试结果：

细胞干重和胞内多糖含量分别为9克/升和3.5毫克/100毫克干重、5.5克/升和4.4毫克/100毫克干重、2.8克/升和4.7毫克/100毫克干重、8.5克/升和4.8毫克/100毫克干重、2.8克/升和5.0毫克/100毫克干重以及2.7克/升和4.2毫克/100毫克干重。