土贝母苷乙用于制备防治人和动物病毒性疾病的药物药饵

摘要

本发明涉及土贝母苷乙及含土贝母苷乙的土贝母皂苷用于制备预防和治疗人和动物各种病毒性疾病的药物或药饵。土贝母苷乙是从土贝母中分离出来的一种化学成分,土贝母皂苷是不含土贝母苷丙的土贝母中的皂苷组分。土贝母苷乙和土贝母皂苷抑制人和动物病毒的复制,对人和动物病毒性疾病有预防和治疗效果,可用于预防和治疗人和动物各种病毒性疾病。

说明书

本发明涉及用土贝母苷乙及含土贝母苷乙的土贝母皂苷制备预防和治疗人和动物各种病毒性疾病的药物或药饵。

众所周知，病毒是一种严重危害人类健康、引起多种动物罹患各种疾患甚至死亡的微生物致病因子。目前在全世界广泛流行的对人类健康威胁甚大的艾滋病、各型流感、各型病毒性肝炎、埃泼氏病毒感染、以及给人类造成巨大经济损失的虾病毒病和禽流感均由病毒所引起。一些常见病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)引起的感染虽然常常是无症状的，但它不仅可引起局部病变，如反复发作的生殖器和口面部的损伤、角膜炎、结膜炎，还可引起严重的全身性疾患，如脑膜炎和新生儿全身播散性感染等。另一些常见病毒，如乳头状瘤病毒(HPV)和Epstein-Barr(EB)病毒则分别与子宫颈癌和鼻咽癌的发生有关。值得注意的是，某些动物病毒性疾病，还可以传染给人。对于各种病毒性疾病，目前人类尚无有效的防治手段。

在中国专利说明书(CN 1094637A)中描述了土贝母苷乙的天然衍生物土贝母苷甲注射液对人艾滋病毒I型及其变异株的复制有明显的抑制效果，并能抑制人艾滋病毒I型所引起的细胞病变。上述专利申请在此作为参考。

土贝母苷乙是从中药土贝母中分离提取出来的一种单体，分子量为1334，化学结构式如图1所示。土贝母苷乙与土贝母苷甲的区别是：土贝母苷甲苷元16位碳上是氢，而土贝母苷乙苷元16位碳上是羟基。土贝母苷乙与土贝母苷甲一样，水溶性好，稳定性强，唯得率较土贝母苷甲低(土贝母苷乙为0.5％，土贝母苷甲为1.8％)。本发明所涉及的土贝母皂苷系指不含土贝母苷丙的土贝母中的皂苷组分，其水溶性和稳定性则与土贝母苷甲、土贝母苷乙相当。制备土贝母皂苷的工艺简单易行，得率也高，约2.2％。

土贝母苷乙和土贝母皂苷的提取方法参见文献(王永清、于立坚等：陕西新医药，10：55，1981；Kasai，R et al.，Phytochemistry，27：1439-1446，1988)

本发明涉及土贝母苷乙或土贝母皂苷作为预防和治疗人和动物各种病毒性疾病的药物或药饵的组合物，该药物或药饵组合物包括土贝母苷乙或土贝母皂苷及可药用或食用的载体。

本发明涉及如权利要求1所定义的药物或药饵组合物的制备方法，该方法包括土贝母苷乙或土贝母皂苷分别与可药用或食用的载体混合或溶解。

本发明涉及土贝母苷乙或土贝母皂苷作为预防和治疗人和动物各种病毒性疾病的药物或药饵在需要进行这种预防或治疗的人或动物中的应用。

土贝母苷乙或土贝母皂苷可与任何可药用或食用的载体混合或溶解做成药物组合物，这些载体包括经皮肤、粘膜、胃肠内和胃肠外给药的可药用载体或可食用的载体。该药物组合物以常规药用制剂的形式使用，如固体形式的片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂等，或半固体形式的油膏、软膏等，或液体形式的针剂、悬浮剂、糖浆剂、乳剂、搽剂等。该药物组合物中使用可药用的赋形剂和添加剂，这些可药用的赋形剂和添加剂包括无毒的可相容的填料、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂、稳定剂，例如乳糖、柠檬酸、硬脂酸、硬脂酸镁石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因、抗坏血酸等。该药物组合物可按各种制剂的常规工艺制备。该药饵组合物以常规饵料的形式使用，饵料组合物中使用可药用或食用的赋形剂和添加剂。

本发明所述及的土贝母苷乙或土贝母皂苷作为预防人和动物各种病毒性疾病的药物，可作为食品添加剂、化妆品添加剂、阴道用避孕药或避孕药套添加剂、饵料添加剂加入到食品、化妆品、避孕药或避孕药套中，亦可加入到饵料或水生动物的生存环境中。

本发明所述有效成份土贝母苷乙或土贝母皂苷作为防治各种人和动物病毒性疾病的药物，可用于各型病毒性肝炎、单纯疱疹病毒引起的各类疾患、艾滋病及对虾病毒性疾病、禽流感等。

所制成的各种口服药物组合物中土贝母苷乙或土贝母皂苷的含量为每日每kg体重大约0.001-100mg，优选约0.01-50mg，更优约0.05-30mg，最佳约0.1-10mg。每日分2-4次服用，5-30天为一疗程，一般用药3-6个疗程，每个疗程间隔5-30天。所制成的注射用药物组合物，可供肌肉注射或静脉点滴，其中土贝母苷乙或土贝母皂苷的含量为每日每kg体重0.001-50mg，优选约0.01-25mg/kg，更优约0.05-15mg，最佳约0.1-3mg。每日分1-3次使用，5-30天为一疗程，一般用药3-6个疗程，每个疗程间隔5-30天。然而，精确的剂量、用药途径、用药方式等应由医生决定，主要取决于病人的年龄、体重、病情、反应等。至于动物用药，则应根据动物对药物的耐受和反应情况作适当调整。

下面列举我们的实验内容及其结果，作为土贝母苷乙或土贝母皂苷可用于制备预防和治疗各种人和动物病毒性疾病的药物和药饵的证据。一.药效学试验

1.土贝母苷乙或土贝母皂苷对单纯疱疹病毒I型、II型(HSV-I、HSV-II)的抑制作用

1.1.细胞：Vero-E₆细胞株(非洲绿猴肾细胞株)。

1.2.病毒：HSV-I和HSV-II，滴度分别为PFU(空斑形成单位5×10⁶/ml、4×10⁸/ml，实验中使用浓度为MOI＝1。

1.3.土贝母苷乙或土贝母皂苷在体外对单纯疱疹病毒I型和II型的中和作用。

1.4.病毒经土贝母苷乙或土贝母皂苷作用后接种：将不同浓度的药液与等体积单纯疱疹病毒液混合，作用1.5小时后分别加入单层细胞孔内，每孔0.1ml，每一浓度平行作3孔。逐日观察细胞病变情况。同时设病毒对照组、不同浓度药液对照组及正常对照组。

1.5.细胞感染病毒后加土贝母苷乙或土贝母皂苷：在长成单层细胞的孔内，加入单纯疱疹病毒，0.1ml/孔，每一浓度平行作3孔。在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的孵箱中孵育1.5小时后弃去病毒液。用培养液洗3次后分别加入不同浓度的土贝母苷乙或土贝母皂苷，逐日观察细胞病变情况。同时设病毒对照组、不同浓度药液对照组及正常对照组。

1.6.结果

1.6.1土贝母苷乙或土贝母皂苷对HSV-I型和HSV-II型有直接灭活作用，结果见表1、2。

表1  土贝母苷乙对HSV-I的体外中和作用^*

                             观察时间

                    72h                          96h

  细胞对照        -      -      -          -      -      -

  病毒对照      ++++   ++++   ++++       ++++   ++++   ++++

  土贝母苷乙

  (μg/ml)

    0.5           -     -      -

    1.0           -     -      -

    2.0           少 部 分 空 泡

    4.0           部  分  空  泡

    8.0           死          亡

  病毒+土

  贝母苷乙

  (μg/ml)

    0.5        ++++   ++++   ++++        ++++   ++++   ++++

    1.0        ++++   ++++   ++++        ++++   ++++   ++++

    2.0         ++     ++     ++         +++    +++    +++

    4.0         +      +      +           ++     ++     ++

    8.0         -      -      -

^*- 细胞未出现病变                  ±个别细胞出现病变、皱缩

+  25％以下细胞出现病变            ++25-50％细胞圆缩、病变

+++50-75％细胞圆缩、病变           ++++75％以上细胞出现病变表2  土贝母苷乙对HSV-II的体外中和作用

                          观察时间

                72h                          120h

细胞对照      -      -     -          -      -      -

病毒对照    ++++   ++++   ++++       ++++   ++++   ++++

土贝母苷乙

(μg/ml)

  0.5         -      -     -

  1.0         -      -     -

  2.0         少 部 分 空 泡

  4.0         部  分  空  泡

  8.0         死    死    死

病毒+土

贝母苷乙

(μg/ml)

  0.5       ++++   ++++   ++++       ++++   ++++   ++++

  1.0        ++    +++     ++        ++++   ++++   ++++

  2.0        +      +      +         +++     ++     ++

  4.0        ±     -      -          +      ±     ±

  8.0        -      -      -

^*-细胞未出现病变             ±个别细胞出现病变、皱缩

 +25％以下细胞出现病变       ++25-50％细胞圆缩、病变   +++50-75％细胞圆缩、病变      ++++75％以上细胞出现病变

1.6.2土贝母苷乙或土贝母皂苷对HSV-I型和HSV-II型致细胞病变有保护作用，结果见表3、4。表3  土贝母苷乙对HSV-I致细胞病变的保护作用^*

                  72h观察结果

细胞对照      -          -            -

病毒对照     ++++       ++++         ++++

土贝母苷

乙对照

(μg/ml)

  0.5         -          -           -

  1.0         -          -           -

  2.0        少    部    分    空    泡

  4.0        部    分    空    泡

  8.0        死                      亡

病毒+土

贝母苷乙

(μg/ml)

  0.25      ++++        ++++        ++++

  0.5       ++++        ++++        ++++

  1.0       ++++        ++++        ++++

  2.0       +++         +++         +++

  4.0       ++          ++          ++

  8.0       -           -           -

^*-细胞未出现病变                 ±个别细胞出现病变、皱缩

+25％以下细胞出现病变            ++25-50％细胞圆缩、病变

+++50-75％细胞圆缩、病变         ++++75％以上细胞出现病变表4  土贝母苷乙对HSV-II致细胞病变的保护作用*

                         观察时间

                  72h                             120h

细胞对照       -       -       -           -       -       -

病毒对照      ++++    ++++    ++++        ++++    ++++    ++++

土贝母苷乙

(μg/ml)

  0.5          -       -       -           -       -       -

  1.0          -       -       -           -       -       -

  2.0          少         部         分         空         泡

  4.0          部             分             空            泡

  8.0          死                                          亡

病毒+土

贝母苷乙

(μg/ml)

  0.5        ++++    ++++    ++++        ++++    ++++    ++++

  1.0        ++++    ++++    ++++        ++++    ++++    ++++

  2.0        ++     +++      ++          +++     +++     +++

  4.0        +       +       +           ++      ++      ++

  8.0        -       -       -

^*-细胞未出现病变               ±个别细胞出现病变、皱缩

 +25％以下细胞出现病变          ++25-50％细胞圆缩、病变

 +++50-75％细胞圆缩、病变       ++++75％以上细胞出现病变

1.7结果说明

与2-4μg/ml药液作用一定时间后的疱疹病毒感染细胞，细胞病变程度明显低于对照组。在感染后第5日，病毒对照组细胞几乎全部脱落，而HSV-II实验组病变表现为细胞由胀大变为园缩，折光性减弱，部分细胞破碎，却没有脱落或极少脱落。上述结果表明，土贝母苷乙对HSV-I型和HSV-II型有直接灭活作用。另外，土贝母皂苷对HSV-I型和HSV-II型的直接灭活作用略逊于土贝母苷乙(资料未显示)。

先感染病毒然后用药的实验中，土贝母苷乙浓度在2-4μg/ml时，对疱疹病毒致细胞病变有延缓作用。实验还显示，在同一浓度时，先感染病毒后用药者细胞病变出现时间先于中和组(药液和病毒体外作用后感染细胞组)，而且细胞病变程度亦比中和组高，表明土贝母苷乙药液对病毒的直接灭活作用比其抑制作用更大。土贝母皂苷抑制HSV-I型和HSV-II型的效果略逊于土贝母苷乙(资料未显示)。

2.土贝母苷乙或土贝母皂苷对艾滋病毒(HIV-I)的抑制作用

2.1.细胞：T类淋巴母细胞株(MT-2细胞)，以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。

2.2.病毒：HIV-I的分离体HTLV-III_B、HTLV-III_RF和HTLV-III_MN以H9和MT-2细胞培养。病毒通过离心(150×g)，8μm孔径滤膜过滤培养上清获得。病毒储存液的滴度是1×10⁵-10×10⁵(每毫升MT-2细胞50％组织感染剂量，TCID₅₀)。

2.3.病毒中和测定：土贝母苷乙或土贝母皂苷对HIV-I感染的中和活性用下述两种方法来测定：抑制核心蛋白P²⁴(HIV-I的核壳抗原)的产生和保护细胞免遭HIV-I病毒致细胞病变(比色法)。土贝母苷乙和土贝母皂苷以含10％胎牛血清不含酚红的RPMI-1640培养液进行系统稀释。稀释液加入96孔板并与等量稀释的感染复数(MOI)为0.0015的HIV-I混合。37℃培养1小时后，加入25μl polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)处理的MT-2细胞(1×10⁶/ml)。在37℃条件下孵育后，从每一孔中收集100μl培养上清，同时补充等量的新鲜培养液到各孔中。上清用于测定P²⁴。第6天各孔加入XTT四氮唑指示剂(1mg/ml，50μl/孔)。4小时后在150nm条件下测定细胞内的甲。HIV复制或细胞病变抑制百分率按下式计算：(C-B)/C×100，B和C分别代表在加或不加土贝母苷乙或土贝母皂苷时P²⁴的量或细胞中毒百分率。

2.4结果

2.4.1土贝母苷乙抑制HTLV-III_B的复制病毒核心蛋白P²⁴用ELISA法测定。土贝母苷乙抑制P²⁴的产生呈量效依赖关系。土贝母苷乙抑制HTLV-III_B复制的EC₅₀为21.6μg/ml。

2.4.2.土贝母苷乙抑制HIV介导的细胞病变土贝母苷乙明显抑制HTLV-III_B介导的细胞病变。土贝母苷乙抑制HTLV-III_B介导的细胞病变的50％有效浓度(EC₅₀)为20.4μg/ml。

2.4.3.土贝母苷乙对其他HIV-I分离株复制的抑制HTLV-III_B是实验中最常使用的分离株之一。土贝母苷乙也有效地抑制HTLV-III_MN及HTLV-III_RF的复制，其EC₅₀分别为21.8μg/ml和18.1μg/ml。土贝母苷乙对HIV-1各种分离株复制的抑制作用略强于土贝母苷甲(参见专利CN 1094637A)，而土贝母皂苷的活性略逊于土贝母苷乙但优于土贝母苷甲(资料未显示)。

2.4.4.土贝母苷乙介导的细胞毒当土贝母苷乙的浓度从80μg/ml稀释到40μg/ml时，其细胞毒性迅速减小。土贝母苷乙的50％细胞毒浓度(CC₅₀)为62.8μg/ml。土贝母皂苷对HTLV-III_B复制的抑制，对其他HIV-I分离株复制的抑制，对HIV介导的细胞病变的抑制效果都略逊于土贝母苷乙，而其细胞毒性则略强于土贝母苷乙(资料未显示)。土贝母苷甲对HIV-I复制的抑制效果略逊于土贝母皂苷，而细胞毒性却略比它强。

3.土贝母苷乙或土贝母皂苷对Epstein-Barr病毒和TPA(12-0-十四酰佛波-13-乙酸酯)协同诱发鼻咽癌的抑制效果

Epstein-Barr病毒(EBV)与鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)有密切关系。将PSG-CR2-Hyg载体转入永生化人上皮细胞(293细胞)中获得CR2-293细胞。间接免疫荧光法测定发现，转化的细胞表达EB病毒受体。用EB病毒感染CR2-293细胞后，1/4的细胞可表达EB病毒的抗原。用TPA作用于这些细胞后，表达病毒抗原的细胞数增加。用PCR法从EB病毒感染细胞的DNA中扩增出EB病毒DNA W片断。在TPA持续作用下，EB病毒感染细胞的形态特征发生改变。把EB病毒感染细胞接种在裸鼠皮下，每周注射TPA，诱导细胞在裸鼠体内形成肿瘤。经组织病理检查，肿瘤为低分化上皮细胞癌(李宝民等，病毒学报，14：133-138，1998)。每周在EB病毒感染细胞接种部位周围注射TPA的同时注射土贝母苷乙或土贝母皂苷，并每天观察肿瘤形成情况。结果表明，EB病毒感染CR2-293细胞后，加5ng/mlTPA作用至第4周时，细胞形态发生改变。一些细胞成堆，多层生长，接触抑制生长丢失，细胞触角变少、变短。EB病毒感染CR2-293细胞后，接种于裸鼠皮下，每周在细胞接种部位注射50ng/mlTPA或在注射TPA的同时在相同部位注射土贝母苷乙或土贝母皂苷。3周后，细胞接种部位出现肿块并逐渐长大。6-7周时，肿块已相当明显。实验表明，除EB病毒感染CR2-293细胞接种皮下加TPA组的裸鼠约半数出现肿瘤外，其他各组，即接种EB病毒感染细胞但不注射TPA，或注射TPA的同时注射土贝母苷乙或土贝母皂苷，或接种未经EB病毒感染的293细胞后注射TPA组的裸鼠都不出现肿瘤。由此可见，土贝母苷乙或土贝母皂苷对EB病毒和TPA协同诱发肿瘤有非常显著的抑制效果。

4.土贝母苷乙或土贝母皂苷对家兔疱疹性角膜炎的治疗效果

4.1.土贝母苷乙或土贝母皂苷滴眼液：用生理盐水在无菌条件下配制，使其中土贝母苷乙或土贝母皂苷的含量为1mg/ml。

4.2. 0.1％无环鸟苷眼液(湖北潜江制药厂生产)。

4.3.病毒：单纯疱疹病毒I型SM₄₄毒株(HSV-SM₄₄)，滴度为10⁶半数组织培养感染量(TCID₅₀)/ml，引自北京生物制品研究所。

4.4.动物：健康新西兰兔24只，体重2-3kg，雌雄各半。

4.5.感染模型与实验分组：在角膜做4mm#字压痕后，滴入病毒原液30μl，闭眼按摩30s。随机分为4组，即土贝母苷乙治疗组，土贝母皂苷治疗组，无环鸟苷眼液阳性对照组和生理盐水空白对照组，分别编号为1，2，3，4组，各组兔眼数均为12只。

4.6.滴眼治疗：病毒接种后24小时行双眼给药，每只眼每次2滴(约50μl)，每日5次，连续用药14天。

4.7.疗效观察：每日行荧光染色，裂隙灯观察记录角膜病变，将角膜上皮病变程度按Trousdale法分为0-4级。

4.8.结果：接种HSV-1后24-28h，所有试验兔角膜均出现点状、短树枝状病变，各组角膜病变程度相互间比较差异无显著性(P＞0.05)。对照组接种后第3天，角膜这些典型的树枝状病灶继续不断扩大；第6-8天形成大片密集的树枝状和地图状溃疡，基质水肿，浸润，病变面积占角膜总面积的75％-100％；第9-14天病变向深层扩展，上皮溃疡面积呈缩小趋势。土贝母苷乙或土贝母皂苷治疗组在接种后第三天，角膜可见点状及短棒状病变，范围较局限。至第4-6天病情较重时，病变面积占角膜面积的20％-40％。基质水肿、浸润也较轻，与对照组角膜病变程度比较差异有非常显著性(P＜0.01)。至第12天大部分兔眼角膜已痊愈。无环鸟苷眼液治疗组，在接种后4-6天，病变面积占角膜面积的25％-45％。至第14天大部分兔眼角膜痊愈。治疗效果由小到大的顺序是：无环鸟苷眼液＜土贝母皂苷＜土贝母苷乙。

5.土贝母苷乙或土贝母皂苷对疱疹病毒性皮肤病的治疗效果

疱疹病毒性皮肤病系由人类单纯疱疹病毒(Herpes virus hominis)所致。该病毒的核酸为DNA。单纯疱疹病毒可分为I、II型(简称HSV-I和HSV-II)。HSV-I与大多数非生殖器感染有关，HSV-II感染多发生在生殖器部位，近来发现HSV-II与宫颈癌的发病有关。疱疹病毒性皮肤病可分为单纯疱疹、水痘、带状疱疹、Kaposi水痘样疹、巨细胞包涵体病、传染性单核细胞增多症、B病毒病等。土贝母苷乙或土贝母皂苷对上述疱疹病毒性皮肤病均有一定的治疗效果。兹以复发型口唇疱疹(颜面疱疹)(herpes labiais；herpesfacialis)30例的治疗效果为例。口唇疱疹是复发性单纯疱疹中最常见的一型，发作初期局部往往先有灼热、瘙痒及潮红，继而出现密集成群或数群针头大小水疱，较原发型的水疱要小且较蔟集，破裂后糜烂渗液，逐渐干燥结痂，全过程1-2周，愈后局部可留有暂时性色素沉着。损伤好发于皮肤粘膜交界处，如口角、唇沿及鼻孔附近，亦有发生于颜面、唇部者。本组30例，男18例，女12例，年龄分布在18-65岁之间。灼热、瘙痒及潮红期8例；水疱期12例；水疱破裂、糜烂期10例。用法：5mg/ml的土贝母苷乙或土贝母皂苷水溶液涂抹局部，1小时1次，30例病人均在1-3日内痊愈，愈后局部无色素沉着。90％的病人1年内未复发。对本病的治疗效果土贝母皂苷略逊于土贝母苷乙。

6.土贝母苷乙或土贝母皂苷对乳头多瘤空泡病毒性疾病的治疗效果乳头多瘤空泡病毒(papovaviruses)，属DNA病毒，即乳头瘤病毒(papillomavirus)，多瘤病毒(palyoma virus)及空泡病毒(Simiare vacnolatingvirus，SV₄₀)。人乳头瘤病毒(HPV)感染后不仅引起疣，还有一部分会导致恶性肿瘤，如皮肤癌、舌癌和宫颈癌等。土贝母苷乙或土贝母皂苷对扁平疣(又称青年扁平疣)和生殖器疣(又称尖锐湿疣)的治疗效果较好。用法：5mg/ml的土贝母苷乙或土贝母皂苷水溶液涂抹局部，每日8-12次。对局部无刺激，愈后不留瘢痕。对本病的治疗效果，土贝母皂苷略逊于土贝母苷乙。

7.土贝母苷乙或土贝母皂苷对慢性子宫颈炎的治疗效果慢性子宫颈炎是妇女的一种常见病、多发病，与乳头状瘤病毒和HIV-II有关，临床上表现为子宫颈糜烂、肥厚、息肉等，部分病例诱发子宫颈癌。土贝母苷乙或土贝母皂苷制成栓剂，置入子宫颈局部，不仅对慢性子宫颈炎有良好的治疗效果，而且还能预防子宫颈癌的发生，使子宫颈局部的原位癌发生逆转。对慢性子宫颈炎的治疗效果，土贝母皂苷略逊于土贝母苷乙，但优于土贝母苷甲(参见专利CN 1110133 A)。

8.土贝母苷乙或土贝母皂苷作为制备防治对虾病毒性疾病药物及药饵的用途80年代以来，世界养虾业迅速发展，产量从80年代初的几万吨增加到90年代的70多万吨。在养殖业迅速发展的同时，也暴发了世界性的虾病，给养殖业造成了严重的危害。仅1993-1994年我国虾病暴发流行，就使我国的养殖业大副度减产，损失达数十亿元。现已查明，近年世界虾病暴发性流行主要是由病毒感染引起的。现已发现对虾病毒病有20多种，引起近年对虾疾病的主要是杆状病毒(一种DNA病毒)。对虾感染病毒后有时间长短不同的潜伏期，呈隐性感染状态。对虾感染病毒后一旦发病，即进展迅速，1-2日内就出现不摄食等症状，很难治疗。对虾病毒对土贝母苷乙或土贝母皂苷很敏感。土贝母苷乙或土贝母皂苷对对虾和哺乳动物的毒性低。土贝母苷乙和土贝母皂苷都易溶于水，室温下稳定时间长，经胃肠道吸收好。以土贝母苷乙或土贝母皂苷制成药饵投喂，可预防未感染或隐性感染状态的对虾发病。若虾已发病，与土霉素混合使用，对虾病有一定的治疗效果。对对虾病毒性疾病的防治效果，土贝母皂苷略逊于土贝母苷乙(资料未显示)。二.毒理试验

1.急性毒性试验选用ICR小鼠用肌肉和腹腔注射给药法进行试验。试验结果：肌肉注射土贝母苷乙的LD₅₀为45.66mg/Kg，土贝母皂苷的LD₅₀为42.36mg/Kg。腹腔给药的土贝母苷乙的LD₅₀为20.9mg/Kg，土贝母皂苷的LD₅₀为19.6mg/Kg。

2.对正常培养细胞的毒性作用采用比色法测试了土贝母苷乙对体外培养的T-淋巴母细胞样细胞株(MT-2细胞)的毒性作用，试验结果(见表5)表明，当土贝母苷乙的浓度由80μg/ml降至40μg/ml时，细胞毒性显著下降，浓度低于40μg/ml时，毒性很低。土贝母苷乙细胞毒的CD₅₀为68μg/ml，土贝母苷甲细胞毒的CD₅₀为59μg/ml。土贝母皂苷细胞毒的CD₅₀为64μg/ml。表5  土贝母苷乙对MT-2细胞的毒性作用

                浓度(μg/ml)            细胞中毒百分率(％)  土贝母苷乙             10                        1.5

                     20                        2.0

                     40                        10.0

                     80                        84.6  土贝母苷甲             10                        2.2

                     20                        6.5

                     40                        13.0

                     80                        96.4

图1：土贝母苷甲、苷乙和苷丙的化学结构式

三.实施例

下面的配方举例说明了本发明的剂型。

                    实施例1：片剂

NO          组分                           用量

                                     mg/片      mg/片

1  土贝母苷乙(或土贝母皂苷)            50        100

2  乳糖USP                             122       123

3  玉米淀粉，食品级，呈                30        40

    10％的纯水浆状物

4  玉米淀粉，食品级                    95        130

5  硬脂酸镁                            3         7

                               合计    300       400

制造方法

在适当的混合机中混合第1项和第2项组分15分钟，第3组分与混合物粒化。如果需要，通过一个初筛研磨潮湿的颗粒，并使之干燥。如果需要，将干燥的颗粒过筛，并与第4项混合10-15分钟。加入第5项混合1-3分钟。在适当的压片机中将混合物压成适当的尺寸和重量。

                        实施例2：胶囊剂

NO           组分                      用量

                                  mg/粒     mg/粒

1  土贝母苷乙(或土贝母皂苷)        50        100

2  乳糖USP                        106       120

3  玉米淀粉，食品级               40        73

4  硬脂酸镁NF                     4         7

                         合计     200       300

制造方法

将第1、2和第3项在适当的混合机中混合10-15分钟，加入第4项混合1-3分钟。在适当的包囊机上将该混合物装入适当的胶囊中。

                       实施例3：注射液

土贝母苷乙(或土贝母皂苷)        10g或50g

葡萄糖                               500g

注射用水                        加至10000ml

制造方法

取土贝母苷乙(或土贝母皂苷)、葡萄糖溶于适量60℃的注射用水中，按配制量加0.05％针剂用活性炭搅拌，静置15分钟，过滤。加注射用水使终体积为10000ml，搅匀。取样测定PH值及含量，合格后过滤，灌封115℃热压灭菌30分钟，即得。

                       实施例4：栓剂以生产发明产品10000粒为例，所用的原料及其配比为：土贝母苷乙(或土贝母皂苷)              300g或600g吐温80                                      800g可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)          加至10000g制造方法

混合：按本实施例的配比称取土贝母苷乙(或土贝母皂苷)、吐温80和可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)，将可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)放入不锈钢锅水浴加热至大部分溶化，停止加热。然后分别加入吐温80和土贝母苷乙(或土贝母皂苷)，用不锈钢搅拌机搅拌至混合均匀，便得到本发明的混合药物。

润滑剂的配制：用软肥皂和甘油各一份与5倍的80％医用酒精充分混合搅拌均匀，制成润滑剂。

成型：在栓模上涂上已配制的润滑剂。将本发明的混合药物倒入栓模中至溢出模口，让其自然冷却。待完全凝固后，用刀切去溢出部分。然后开启模具，将栓剂从模具中取出。

无菌包装：将所制备的拴剂进行质量检查，每粒重量应为1g，含土贝母苷乙(或土贝母皂苷)30mg或60mg。检查合格后包装，钴60灭菌。

                      实施例5：滴眼液土贝母苷乙(或土贝母皂苷)                1g羟苯乙酯                                0.3g氯化钠注射液                        加至1000ml制造方法

取羟苯乙酯溶于适量的热氯化钠注射液中，放冷，过滤。加氯化钠注射液使体积为1000ml，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，制成无菌羟苯乙酯氯化钠溶液备用。按无菌操作法取土贝母苷乙(或土贝母皂苷)，溶于适量的无菌羟苯乙酯氯化钠溶液中，使接近950ml。取出少许测定PH(必要时以0.1mol/L氢氧化钠液调PH至5.0-7.0)。再加羟苯乙酯氯化钠溶液使成1000ml，混匀。必要时过滤，无菌分装即得。本品含土贝母苷乙(或土贝母皂苷)应为0.09-0.11％(g/ml)。

                       实施例6：眼膏剂土贝母苷乙(或土贝母皂苷)                   1g眼膏基质                               加至1000g制造方法

眼膏基质配方：羊毛脂100g，无菌液体石蜡100g，凡士林800g。取羊毛脂和凡士林置适当的有盖容器中加热熔化。加灭菌液体石蜡，混匀，必要时趁热过滤，150℃干热灭菌1小时，放冷备用。按无菌操作法取土贝母苷乙(或土贝母皂苷)，置灭菌乳钵中，加少量灭菌液体石蜡研磨，使成细腻糊状，再分次加入眼膏基质。边加边研匀，使成1000g，无菌分装。本品含土贝母苷乙(或土贝母皂苷)应为0.09-0.11％(g/g)。

                        实施例7：软膏土贝母苷乙(或土贝母皂苷)               10g羊毛脂                                 90g凡土林                                 900g制造方法

按无菌操作法取土贝母苷乙(或土贝母皂苷)，加入适量熔化的羊毛脂、凡士林研磨，再分次加入剩余的羊毛脂、凡士林，使成1000g，研匀即得。

                        实施例8：滴鼻液土贝母苷乙(或土贝母皂苷)                5g盐酸麻黄硷                              10g甘油                                    300ml蒸馏水                              加至1000ml制造方法

按无菌操作法取土贝母苷乙(或土贝母皂苷)溶于热蒸馏水中，加盐酸麻黄硷使溶，过滤，加甘油。搅匀，加水至1000ml混匀，分装，即得。

                        实施例9：糖浆剂土贝母苷乙(或土贝母皂苷)                   2g蒸馏水                                     20ml单糖浆                                 加至1000ml制造方法

按无菌操作法取土贝母苷乙(或土贝母皂苷)，加入20ml蒸馏水中溶解。加单糖浆至1000ml，搅匀，分装，即得。

                        实施例10：溶液土贝母苷乙(或土贝母皂苷)                    50g无菌蒸馏水                              加至10000ml制造方法

按无菌操作法取土贝母苷乙(或土贝母皂苷)，加入10000ml无菌蒸馏水溶解，分装，即得。使用时，按鱼虾的体重计算每公斤饲料的加药量。若鱼虾已发病，则应与土霉素混合使用。