消旋四氢萘酮的立体选择性微生物还原

摘要

本发明涉及进行消旋四氢萘酮的下列立体选择性微生物还原的方法:该方法包括:使结构式(Ⅰ)的化合物与一种微生物或酶还原系统接触,该酶还原系统能实现本发明的还原,其包括一种来源于该微生物的酶和该酶的一种辅因子,以及在足以产生结构式(Ⅱ)的(4R)四氢萘酚并使结构式(Ⅴ)的(4S)四氢萘酮或“手性四氢萘酮”基本上不反应的条件下温育所得混合物。该手性四氢萘酮能用于舍曲林的合成。本发明的方法另外任选地包括结构式(Ⅴ)(4S)四氢萘酮与结构式(Ⅱ)(4R)四氢萘酚的分离。能再利用(4R)四氢萘酚,产生结构式(Ⅰ)的化合物,并重复该本发明的方法,产生更多的希望的结构式(Ⅴ)(4S)四氢萘酮。

说明书

发明领域

本发明涉及制备4-(3，4-二氯苯基)-3，4-二氢-1(2H)-萘酮的(4S)对映体(以下也称作“手性四氢萘酮”或“(4S)四氢萘酮”)的新型方法，尤其涉及消旋4-(3，4-二氯苯基)-3，4-二氢-1(2H)-萘酮(以下也称作“消旋四氢萘酮”)向手性四氢萘酮的立体选择性微生物还原。

发明背景

通过本发明的方法制备的手性四氢萘酮可进一步反应，以制备纯的顺-(1S)(4S)-N-甲基-4-(3，4-二氯苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺，通常称作舍曲林(sertraline)。众所周知舍曲林例如可用作抗抑郁剂和减食欲剂，并用于化学依赖性、焦虑相关病症、早泄、癌症和心肌梗死后的治疗。

制备舍曲林的方法在本领域中已知，例如，美国专利号4,536,518；4,777,288；4,839,104；4,855,500；4,940,731；4,962,128；5,082,970；5,130,338；5,196,607；5,248,699；5,442,116；5,463,126；5,466,880；5,597,826；和5,750,794；以及W.M.Welch，Jr.等人的论文中所述的方法，该论文发表于药物化学杂志(the Journal of MedicinalChemistry)27卷，11号，1508页(1984)。

上述专利中的几种涉及消旋N-甲基-4-(3，4-二氯苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺的顺式和反式异构体混合物的合成。如其中所述，可通过本领域熟练的技术人员已知的方法包括如分步结晶或层析法分离顺式和反式异构体及其(S)和(R)对映体。

在舍曲林合成的较早期选择最终所需的手性也是已知的。例如，上述美国专利号5,750,794公开了一种制备手性四氢萘酮的方法，包括使消旋四氢萘酮与一种不对称酮还原剂反应，产生相应的顺式或反式醇，这取决于所用不对称试剂的手性，然后分离该醇，将(1S，4S)和/或(1R，4S)醇氧化为(4S)-四氢萘酮。

在本领域中也知，能使用微生物如真菌例如酵母合成手性化合物。例如，酵母将酮还原为手性醇的应用是众所周知的。然而，相关领域的熟练技术人员理解，这类微生物还原的化学和光学产物例如特定对映体及其数量通常是变化的，其基本上取决于例如所选用的特定微生物以及起始材料的替代物。

美国专利号5,049,497公开了一种拆分双环[4.2.0]辛烷的消旋衍生物的方法，方法是在足以产生高对映体纯度的酮和醇混合物的条件下使该衍生物与面包酵母接触。据其中所述，受试消旋酮只有一种对映体被还原，产生一种醇。

美国专利号5,580,764公开了一种不对称还原方法，该方法使用一种完整的微生物或其破碎的细胞制品将一种环酮转化为相应的手性醇。

美国专利号5,618,707公开了用于酮底物的立体选择性还原的一种方法，包括向拜列氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)ATCC(美国典型培养物保藏中心)号38924或八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)ATCC号2479的培养液中加入底物，温育产生的混合物，通过常规方法如用有机溶剂抽提、吸附于树脂或层析法分离羟基化合物，随后作为中间物用于一种降血清胆固醇剂的制备。用手性高效液相层析(HPLC)、反相HPLC或此两者一起分析其中所述的分离的羟基化合物。按照一名相关技术人员应当理解的，据其中所述，在研究了其还原所选底物酮基能力的大量微生物中，有许多种不能以希望的特异性或生产力还原酮基。

现在意外地发现，一系列微生物包括真菌(如酵母)和放线菌基本上能立体选择性地还原消旋四氢萘酮。特别地，本发明的立体选择性微生物还原选择性地还原消旋混合物的(4R)四氢萘酮，而使(4S)四氢萘酮基本上不反应。此外，本发明的方法产生的不需要的(4R)四氢萘酚可被氧化，然后消旋为消旋四氢萘酮，并重复本发明的方法产生更多的(4S)四氢萘酮。本发明的方法产生的(4S)四氢萘酮能用于舍曲林的合成。

在此引用的、包括上述所有文件在此完全引入作为参考。

发明概述

本发明涉及羰基的微生物还原，包括使一种酮化合物，即结构式(I)的消旋四氢萘酮，与一种微生物或酶还原系统接触，该酶还原系统能实现本发明的还原，其包括一种来源于该微生物的酶和该酶的一种辅因子，以及在合适的条件下温育所得混合物，使得在培养基中能形成并积累含羟基的化合物，特别是结构式(II)的(4R)四氢萘酚，而具有希望的立体化学的化合物，即下列结构式(V)的(4S)四氢萘酮，基本上不反应。然后能用任何合适的方法如层析或结晶法分离以下结构式(V)的(4S)四氢萘酮，即手性四氢萘酮。另外，能将结构式(II)的(4R)四氢萘酚与结构式(III)-(V)的化合物分离，氧化并消旋为消旋四氢萘酮，并重复本发明的立体选择性微生物还原，产生更多所需的手性酮。

因此，本发明提供进行下列立体特异性微生物还原的方法：

该方法包括：使结构式(I)的化合物与一种微生物或酶还原系统接触，该酶还原系统能实现本发明的还原，其包括一种来源于该微生物的酶和该酶的一种辅因子，以及在足以产生比结构式(III)化合物更多的结构式(II)化合物的条件下温育所得混合物，于是使比结构式(IV)化合物更多的结构式(V)化合物不反应。

本发明的立体特异性还原也可表示为：

该方法包括：使结构式(I)的化合物与一种微生物或酶还原系统接触，该酶还原系统能实现本发明的还原，其包括一种来源于该微生物的酶和该酶的一种辅因子，以及在足以产生结构式(II)的(4R)四氢萘酚并使结构式(V)的(4S)四氢萘酮基本上不反应的条件下温育产生的混合物。

立体选择性还原此外任选地包括结构式(V)的(4S)四氢萘酮与结构式(II)的(4R)四氢萘酚的分离。然后可氧化(4R)四氢萘酚产生(4R)四氢萘酮，然后使(4R)四氢萘酮与例如一种碱反应，产生结构式(I)的消旋四氢萘酮，并可重复本发明的立体选择性微生物还原，产生更多希望的结构式(V)的(4S)四氢萘酮，即结构式(I)的消旋四氢萘酮的(4S)对映体。

本发明提供包括结构式(I)的化合物向结构式(II)的化合物立体选择性微生物还原的方法：使结构式(I)的化合物与一种微生物或酶还原系统接触，该酶还原系统能实现本发明的还原，其包括一种来源于该微生物的酶和该酶的一种辅因子，以及在足以产生结构式(II)的化合物的条件下温育所得混合物，因此比结构式(IV)化合物更多的结构式(V)化合物未反应，并产生比结构式(III)化合物更多的结构式(II)化合物。

在一种优选实施方案中，结构式(I)的化合物与一种酶还原系统相接触。在另一种优选实施方案中，结构式(I)的化合物与一种酶还原系统相接触，其中酶是固定化的。在一种特别优选的实施方案中，结构式(I)的化合物与一种来源于多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)ATCC号26012的酶还原系统相接触。

在另一种优选实施方案中，微生物是其破碎的细胞制品。在又一种优选实施方案中，微生物是其丙酮粉酶制品。

在本发明的一种特别优选的实施方案中，使用一种完整的微生物。在一种优选实施方案中，其中微生物是一种完整的微生物，结构式(I)的化合物与包含该微生物的发酵培养基、培养液或溶剂相接触。在另一种优选实施方案中，其中微生物是一种完整的微生物，结构式(I)的化合物与经洗涤的完整微生物相接触。在又一种优选实施方案中，其中微生物是完整的，结构式(I)的化合物与固定化的完整微生物相接触。

在本发明的一种特别优选的实施方案中，微生物是在发酵培养基中生长的一种完整微生物，通过向其中加入结构式(I)的化合物发生接触。

在本发明的另一种特别优选的实施方案中，微生物是在生长培养基中生长约48小时的一种完整微生物，通过向其中加入结构式(I)的化合物在这种生长培养基中发生接触，并且温育大约5天。

在本发明的另一种优选实施方案中，微生物是一种真菌如酵母，或一种放线菌，或能进行立体选择性还原的突变体。

在本发明的又一种优选实施方案中，微生物是一种真菌。在又一种实施方案中，其中微生物是一种真菌，该真菌是蓝色犁头霉(Absidiacoerulea)ATCC号20137。

在本发明的一种特别优选的实施方案中，微生物是一种酵母。在本发明的一种特别优选的实施方案中，其中微生物是一种酵母，该酵母是多形汉逊酵母ATCC号26012，也保藏为ATCC号74449。

将多形汉逊酵母ATCC号26012，也保藏为ATCC号74449，用作其微生物时，本发明的立体选择性微生物还原仅明显还原结构式(I)化合物的一种对映体，产生相应的醇，即结构式(II)的化合物，而使结构式(I)化合物的其它对映体，即结构式(V)的化合物，基本上不反应。

如前所述，本发明的方法另外任选地包括结构式(V)的化合物与结构式(II)-(IV)化合物的分离，例如使用结晶或层析法进行的分离，以及这种分离的结构式(V)的化合物在使用任何已知方法的舍曲林合成中的应用。

也如前所述，将分离的结构式(II)的(4R)四氢萘酚氧化为结构式(IV)的(4R)四氢萘酮是优选的。然后更优选的是将结构式(IV)的(4R)四氢萘酮消旋为结构式(I)的消旋四氢萘酮，优选地通过使(4R)四氢萘酮与一种碱反应而消旋。氧化和消旋作用再利用不需要的(4R)四氢萘酚，用于根据本发明的方法的另一轮立体选择性微生物还原。不需要的(4R)四氢萘酚的再利用提高了希望的(4S)四氢萘酮的量，降低了舍弃的不需要的(4R)四氢萘酚的量。可使用任何合适的已知方法进行氧化产物的氧化和消旋。发明详述

本领域熟练的技术人员将完全理解在此使用的、描述本发明的术语；尽管如此，下面直接描述了在此使用的下列术语。

“辅因子”意思是酶还原系统所含的任何合适的辅因子，例如NADH、NADPH、FADH、FMNH和/或PQQ，或在微生物中与酶共存的任何合适的辅因子。

“酶还原系统”意思是一种合适的微生物氧化还原酶和该氧化还原酶的辅因子的还原形式，其中该辅因子既可来源于所选的微生物也可来自任何合适的来源。包含酶还原系统的酶可以是游离形式或固定形式，例如固定于柱中或附着于珠上。

“微生物还原”意思是本发明的立体选择性还原，它是由酶还原系统、包含酶还原系统的微生物还原酶、完整微生物或其任何制品等实现的。

“微生物”包括任何完整的微生物或其制品，包括如微生物的破碎的细胞制品；微生物的脱水制品，如丙酮粉酶制品；经洗涤的不含如发酵培养基、培养液等的微生物；固定于如柱中、附着于珠上等的微生物。

本发明提供的方法包括结构式(I)化合物向结构式(II)化合物的立体选择性微生物还原：

其是使结构式(I)的化合物与一种微生物或酶还原系统接触，该酶还原系统能实现本发明的还原，其包括一种来源于该微生物的酶和该酶的一种辅因子，以及在足以产生结构式(II)化合物的条件下温育所得混合物，因此比结构式(IV)化合物更多的结构式(V)化合物未还原，并产生比结构式(III)化合物更多的结构式(II)化合物。

本领域熟练的技术人员应当理解，结构式(I)的化合物消旋四氢萘酮，是如下所示(4S)四氢萘酮和(4R)四氢萘酮的混合物：

  (4S)四氢萘酮               (4R)四氢萘酮

该化合物，或者更明确地，结构式(II)的四氢萘酚是：

  (反式)(1S，4R)               (顺式)(1R，4R)

该化合物，或者更明确地，结构式(III)的四氢萘酚是：

  (顺式)(1S，4S)            (反式)(1R，4S)

结构式(II)和(III)的化合物在前述美国专利号5,750,794中公开并申请专利。

如下所述可从不希望的结构式(II)化合物中和结构式(III)或(IV)任一化合物中分离希望的结构式(V)化合物，这些化合物分别可以是产生的或未反应的，这取决于如所选的微生物和温育条件。

可通过如氧化和消旋将结构式(II)的化合物转化为结构式(I)的化合物，并进行本发明的立体选择性微生物还原，产生一定量的结构式(V)的(4S)四氢萘酮。

本发明的方法易于实行。因此，可在结构式(I)所代表的消旋四氢萘酮存在下将微生物发酵(完整的微生物)或温育(微生物的破碎细胞制品、脱水制品或其它任何合适的制品)，以改变消旋四氢萘酮，更具体而言，将消旋酮的不希望的(4R)对映体还原为结构式(II)所代表的相应醇，而使结构式(V)所代表的希望的(4S)对映体基本上不反应，由此，一步产生光学增强的(4S)对映体。然后可用相关领域的熟练技术人员所熟知的方法使该(4S)对映体进一步反应，最终产生舍曲林，如前述美国专利号4,536,518；4,777,288；4,839,104；4,855,500；4,940,731；4,962,128；5,082,970；5,130,338；5,196,607；5,248,699；5,442,116；5,463,126；5,466,880；5,597,826；和5,750,794；以及前述W.M.Welch，Jr.等人的论文中所述的方法。

例如在前述美国专利号4,536,518；4,777,288；和4,839,104；以及前述W.M.Welch，Jr.等人的论文中阐述了关于舍曲林的活性、检测活性的方法、剂量、剂型、施用方法和背景信息。

本发明的方法中可使用任何合适的微生物。如前所述，本发明的方法中使用的微生物可以是完整的、任何合适的制品，例如其破碎的细胞制品、其脱水制品，并且可以是游离的或固定化的。然而，在本发明中使用不完整的微生物时，例如破碎的细胞制品，如细胞提取物、丙酮粉酶制品或由其衍生的酶，本领域熟练的技术人员应当理解也包括该酶的合适的辅因子。

本领域熟练的技术人员从在此提供的描述中以及有关知识中将理解如何制备合适的破碎细胞制品，例如R.N.Patel等人发表于《应用与环境微生物学》(Applied and Environmental Microbiolgy)，38(2)：219-223(1979)的文章“酵母使仲醇向甲基酮的氧化”中所述。

本领域熟练的技术人员从在此提供的描述中以及有关知识中将理解如何制备合适的丙酮粉酶制品，例如K.Nakamura等人发表于《四面体信件》(Tetrahedron Letters)，37(10)：1629-1632(1996)的文章“白地霉(Geotrichum candidum)的丙酮粉对酮的不对称还原”中所述。

另外，在本发明的方法中也可使用任何合适的微生物的酶(例如氧化还原酶)，并可用本领域熟练技术人员已知的任何合适方法从微生物中分离该酶，至于完整的微生物，可以以游离的或固定化的形式在本发明的方法中使用。本领域熟练的技术人员从在此提供的描述中以及有关知识中将理解如何分离和纯化合适微生物的酶，例如在下列文章中所普遍描述的：M.Wada等人，“来源于Candida magnoliae、参与4-氯-3-氧代丁酸乙酯立体选择性还原的NADPH-依赖型羰基还原酶的纯化和表征”，发表于《生物科学、生物工程学与生物化学》(Biosci.Biotechnol.Biochem.)，62(2)：280-285(1998)，P.Trost等人，“甜菜细胞的NAD(P)H：(醌接受体)氧化还原酶的纯化和性质”，发表于《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)，234：452-458(1995)，K.M.Madyastha和T.L.Gururaja，“来源于真养产碱菌(Alcaligeneseutrophus)的一种新仲醇脱氢酶的纯化和某些性质”，发表于《生物化学与生物物理学研究通讯》(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications)，211(2)：540-546(1995)，O.Bortolini等人，“嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)双乙酰还原酶对邻二醇的动态分解”，发表于《四面体：不对称》(Tetrahedron：Asymmetry)，9：647-651(1998)，R.N.Patel等人，“4，5-二氢-4-(4-甲氧苯基)-6-(三氟甲基-1H-1)-苯并氮杂卓-2-酮的立体特异性微生物还原”，发表于《酶微生物学技术》(Enzyme Microb.Technol.)，3：906-912(1991)以及R.N.Patel等人，“(外，外)-7-氧杂二环[2.2.1]庚烷-2，3-二甲醇向相应的手性内半缩醛和内酯的立体选择性微生物/酶氧化”，发表于《酶微生物学技术》，14：778-784(1992)；以及美国专利号5,523,223和前述的5,580,764。

合适的微生物包括多形汉逊酵母ATCC号26012、多形汉逊酵母ATCC号74449、蓝色犁头霉ATCC号20137、白地霉ATCC号34614、白地霉ATCC号62401、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)ATCC号42613、深黄被孢霉ATCC号38063、葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea)ATCC号09515、特异青霉(Penicillium notatum)ATCC号36740、Blastoschizomyces capitatus ATCC号28575、橄榄色单孢霉major变种(Monosporium olivaceum v.major)ATCC号36300、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ATCC号16623、多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus)ATCC号20280、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC号15248、Candida schataviiATCC号24409、Pichia fabianii ATCC号16755和龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus ss.rimosus)ATCC号10970；以及相关领域的熟练技术人员知道或另外可获得的突变体，尽管突变，这些突变体仍能实现在此公开的立体选择性微生物还原。

优选的完整微生物将基本上还原(4R)四氢萘酮，而使(4S)四氢萘酮基本上不反应，其中反应包括还原或其它任何内在活性，这些活性可降解或另外负性影响本发明的方法任何阶段所希望的(4S)四氢萘酮。熟练的技术人员从此处的公开内容中应当理解，例如相对于完整微生物使用来源于所选微生物的酶可基本上阻止(4S)四氢萘酮的这种不需要的反应。

用相关领域的熟练技术人员已知的任何合适方法可制备适用于本发明的立体特异性微生物还原的微生物。以下提供了从市售原种中制备微生物的合适方法的一个实施例。以下提供的方法可用于在本发明的方法中适用的任何微生物，熟练的技术人员从在此提供的描述中应当理解如何修改该方法的任何部分，例如，制备微生物的方法，该微生物是完整的或制品，如其破碎的细胞制品或脱水制品，是游离的或固定化的；制备来源于这些微生物的合适的酶的方法；使消旋四氢萘酮与微生物或酶接触的方法，该酶组成由其衍生的酶还原系统；生长培养基成分和条件，例如温度、pH等；或温育条件；以达到任何特定的方法中希望的结果。

熟练的技术人员从在此提供的描述中以及有关知识中将理解如何制备合适的固定化的完整微生物，例如A.Bauer等人在发表于《生物工程学信件》(Biotechnology Letters)，18(3)：343-348(1996年3月)的文章“用于腈的生物转化的聚乙烯醇固定的全细胞制品”中所述。

在本发明中可应用使结构式(I)的化合物与微生物或酶还原系统接触的任何合适方法。可按任何合适的顺序将结构式(I)的化合物与微生物或酶还原系统接触。例如，可将结构式(I)的化合物加入培养基如培养液中，该培养基中含有游离的或固定化的微生物或其组合；或者培养基中可含有结构式(I)的化合物，然后可向这种培养基中加入微生物；或者可将结构式(I)的化合物和微生物一起加入这种培养基中；或者可将结构式(I)的化合物加入破碎的细胞制品中；或者可将结构式(I)的化合物加入该微生物的脱水制品中；或者可将结构式(I)的化合物或微生物(或酶还原系统)之一加入含有两者中另一种的合适溶剂中等等。熟练的技术人员从在此提供的描述中将理解如何按所需修改本发明的方法的任何部分。

本发明中特别优选的是，微生物或酶还原系统来源于多形汉逊酵母ATCC号26012。多形汉逊酵母ATCC号26012(最初由D.W.Levine捐赠)的冻干样品依《布达佩斯条约》的条款在1998年6月26日由ATCC保藏，ATCC位于10801 Boulevard大学，Manassas，Virginia，20110-2209，美国。这种新保藏的培养物被给予了新的保藏号，ATCC号74449，保藏日期为1998年6月26日。因此，微生物是多形汉逊酵母ATCC号74449在本发明中也是特别优选的。本发明说明书的专利授权后，对公众这样保藏的微生物培养物之可得性的所有限制将不可逆地去除。

多形汉逊酵母ATCC号26012的培养物能从ATCC获得，以下提供了从市售原种中进行制备的合适方法的一种实施例。将获得的培养物加入合适的生长培养基中，振摇温育直到生长，熟练的技术人员应当理解这两个步骤。这样制备的培养物可用来接种斜面，这些斜面的一部分作为原种冻存。另外，能制备液体储用培养物，向其中加入约10％-约20％的甘油，然后在约-80℃下优选地冷冻于小冻存管中。

本领域熟练技术人员对于所选的任何微生物应当理解，并且以下在对于蓝色犁头霉ATCC号20137和特别优选的多形汉逊酵母ATCC号26012或ATCC号74449的实施例中特别提供，制备微生物的一种合适方法如下：从如上所述的冻存储用培养物(约17％甘油贮存液)中将微生物接种于具有金属罩的摇瓶或玻璃管中，其中含有生长培养基(含一等份包括Tween^80、甘油和蒸馏水的无菌溶液)，其成分在以下更详细地描述。于约22℃-约32℃、优选地29℃，在优选地约200转/分-约220转/分、最优选地约210转/分的适当振摇下进行发酵。希望时，生长培养基的pH可通过用合适的缓冲液掺入发酵培养基中来保持，和/或通过加入希望的碱或酸定期调节。

在微生物生长的任何适当的持续期本发明中可应用微生物与结构式(I)的化合物的接触，以及结构式(I)的化合物与微生物的温育。可在如大约24小时内达到微生物的适当生长，此时可向培养物中加入适当等份的溶于适当溶剂优选地乙醇中的消旋四氢萘酮溶液。然后可使发酵继续进行例如约2天到约6天，优选地例如约5天，此时可使用任何合适的提取方法抽提发酵液，通过适当的溶剂如乙酸乙酯、甲基异丁酮、甲基乙酮、二氯甲烷等，优选地乙酸乙酯，除去发酵液中的有机成分。发酵液的抽提以及有机相和水相分离后，可使用任何合适的方法如层析法优选地手性HPLC测定含有有机残余物的化合物。

本发明的方法中可使用任何合适的生长培养基，合适的生长培养基包含可同化的碳源、可同化的氮源和含有必需无机物的无机盐来源。通常，许多碳水化合物如葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、甘油、粟浆、糖蜜、大豆等能用作可同化的碳源。可同化的氮源包括例如，如酵母和酪蛋白水解物的物质、初生酵母、酵母提取物、棉籽粉、大豆固体、麦芽、肉膏、蛋白胨、玉米浆和铵盐。在本发明的培养基中使用的合适的无机盐养分包括，例如，含钠、铁、镁、钾、钴、磷酸盐等的常用盐。更具体而言，适用于本发明的生长培养基包括，例如：

(a)右旋糖(约20克(g))、酵母提取物(约5g)、豆粉

  (约5g)、NaCl(约5g)、K₂HPO₄(约5g)和蒸馏水(约

  1升(L))，用H₂SO_4(水溶液)调节pH至约pH7.0；

(b)糊精(约10g)、牛肉膏(约3g)、ardamine pH(约5g)、

  E型NZ胺(约5g)、MgSO₄·7H₂O(约0.5g)、KH₂PO₄(约

  0.37g)、CaCO₃(约0.5g)和蒸馏水(约1L)，用HCl_(水溶液)

  调节pH至约pH7.1，随后是第二阶段，葡萄糖(约10g)、

  Hy-Case SP^(约2g)、牛肉膏(约1g)、玉米浆(约3g)

  和蒸馏水(约1L)，调节pH至约pH7.0；

(c)葡萄糖(约10g)、玉米浆(约6g)、KH₂PO₄(约3g)、

  CaCO₃(约3.5g)、豆油(粗制，约2.2毫升(ml))、酵母

  提取物(约2.5g)和蒸馏水(约1L)，用HCl_(水溶液)调节pH

  至约pH7.0到约pH7.3；

(d)麦芽糖浆(约20g)、大豆粉(约5g)、酪蛋白(约1g)、

  干酵母(约1g)、NaCl(约5g)和蒸馏水(约1L)；

(e)乳糖(约75g)、Pharmamedia^(代替酵母提取物，约

  40g)、CaCO₃(约10g)、Na₂SO₄(约4g)和蒸馏水(约1L)；

(f)ISP#2(见，例如，R.M.Atlas的《微生物培养基手册》第460

  页，L.C.Parks编辑，CRC Press，Inc.，1993，(《手册》))；

(g)ISP#3(见《手册》第460页)；

(h)ISP#4(见《手册》第461页)；

(i)ISP#5(见《手册》第461-462页)；等等。

一种特别优选的生长培养基是2×的上述(a)。

对特定缓冲液、培养基、试剂、接触或培养条件等的提及并不是要限制，但应当理解包括所有这些相关材料，本领域普通的技术人员应当认识到，它们在具有此处讨论的特定上下文中是有意义或有价值的。例如，将一种缓冲系统或培养基替换为另一种常常是可能的，使得用一种不同的但是已知的方法达到与涉及的建议方法、材料或组成的应用相同的目的。此外，应当理解本发明包括本发明的方法用于商业目的的放大。

因此，本领域普通技术人员应当理解，可改变生长培养基、发酵条件和/或消旋四氢萘酮的量，以控制产生的化合物的产量及其相对生产率。通常，根据工业效能选择在本发明中使用的方法。生长培养基、发酵条件和微生物或酶还原系统和在此所述的消旋四氢萘酮的相对量，仅仅是说明培养基、发酵条件和原材料的量的多种变化，本领域熟练技术人员应理解它们可适用于本发明，并不意在以任何方式限制。

在本发明中可使用分离和/或纯化本发明的方法的任何产物的任何合适方法，包括过滤、提取、结晶、柱层析、薄层层析、制备低压液相层析或HPLC，或这些方法的任何合适的组合。

另外，一名本领域熟练技术人员应当理解，在此公开的方法所产生的不需要的(4R)四氢萘酮的相应醇，即结构式(II)的化合物，可被再利用，例如，如前所述用任何合适的已知方法氧化并消旋为结构式(I)的消旋四氢萘酮，并重复本发明的方法再次产生希望的结构式(V)的(4S)四氢萘酮。可通过本领域熟练技术人员已知的方法进行(4R)四氢萘酚向(4R)酮的氧化。消旋反应可以以任何合适的方法进行，但通常在约0℃-约100℃、优选地约25℃-约65℃进行。在约25℃-约85℃、优选地约50℃-约65℃使(4R)四氢萘酮与一种碱反应。用于该消旋反应的合适的碱包括叔丁氧钾、氢氧化钠、甲氧钠和氢氧化钾。一种优选的碱是叔丁氧钾。

下列详细实施例显示，一系列微生物包括真菌(如酵母)和放线菌立体选择性地还原消旋四氢萘酮，产生希望的结构式(V)的(4S)四氢萘酮，即手性四氢萘酮，然后可将其与不需要的化合物相分离，并根据本领域众所周知的方法进一步反应产生舍曲林。

下列实施例说明了本发明。本发明的前述和下列描述以及多种实施方案不是本发明的限制，而是其说明。因此，应当理解本发明并不限制这些实施例的特定细节。实施例I应用多形汉逊酵母ATCC号26012消旋四氢萘酮的还原A.    酵母多形汉逊酵母ATCC号26012的发酵

如下制备一种“对照”培养液(C1)和一种“测试”培养液(T1)：将约2.5ml无菌生长培养基(约40g/l右旋糖、约10g/l营养豆粉(nutrisoy)粉、约10g/l酵母提取物、约10g/l NaCl和约10g/l K₂HPO₄，用H₂SO₄调节pH至约7.0)加入两个16×125mm玻璃管的每一个中，每管具有一个金属罩(C1、T1)，随后向两种培养液的每一种中加入约0.2ml溶液A(约25g Tween^80、约100g/l甘油和约250ml蒸馏水，过滤除菌)。

将约25μl约17％的多形汉逊酵母ATCC号26012冷冻甘油贮存液接种于T1中。在约29℃、约210转/分振摇下温育两管培养物。大约24小时后，向C1和T1中加入约50μl消旋四氢萘酮(结构式(I)的化合物(其含有结构式(IV)和(V)的化合物)，以约5mg/ml溶于乙醇中)的贮存液(约5mg/ml于约100％乙醇中，终浓度约100μg/ml)。

大约5天后，向两管培养物的每一管中加入1ml NaCl(饱和)。用等体积的乙酸乙酯(纯)抽提每管培养物的发酵液(约3.6ml)：加入乙酸乙酯，振荡该管培养物，然后以约2000转/分离心(IEC^离心机，300 Second Avenue，Needham Heights，Massachusetts 02194)。去除乙酸乙酯层，第二次抽提水层。在约50℃水浴中于氮下干燥结合的有机提取物。B.    残余的酮的构型：结构式(IV)和(V)的化合物

将如上所述制备的每种提取物重悬浮于约1ml乙醇中，通过注入HPLC柱：与Chiralcel OK柱(4.6×250mm，Daicel)相连接的ChiralcelOK保护柱(4.6×50mm，Diacel化学工业有限公司.，730 SpringdaleDrive，邮政信箱564，Exton，Pennsylvania 19341)分析约20μl的每种重悬浮的提取物。以流动相(乙醇∶乙酸乙酯，85∶15)每分钟约0.8ml的速率等度(isocratically)分离注入的每种重悬浮提取物中所含的化合物，使用设定于254nm的996 PDA检测仪(Waters^，34 MapleStreet，Milford，Massachusetts 01757)检测该提取物所含的化合物。

以下表I中C1和T1的数据表明，手性HPLC分析显示，含有微生物即多形汉逊酵母ATCC号26012产生16∶1的比例(未反应的结构式(V)的(4S)四氢萘酮：未反应的结构式(IV)的(4R)四氢萘酮)，这进一步说明本发明微生物还原方法的立体特异性。以下报告的结果基于加入的已知量的每种对映体(约50μg/ml结构式(IV)和(V)的每种化合物)。如上所述，结构式(I)的起始消旋四氢萘酮浓度约为100μg/ml。

表I

  培养物4S四氢萘酮  (μg/ml) 4R四氢萘酮  (μg/ml)  4S∶4R    C1    42.63    43.04    1    T1    37.92    2.37    16

手性分析的结果显示，多形汉逊酵母ATCC号26012培养物(T1)基本上还原(4R)四氢萘酮，而使(4S)四氢萘酮基本上不反应(相对于约76％的(4S)四氢萘酮，剩余约4.7％的(4R)四氢萘酮)。这种手性HPLC确定(4S)四氢萘酮以约88％ee(“对映体过量的百分量”)存在。表I的数据，尤其是(4S)∶(4R)的比例即16也显示，比(4R)四氢萘酮更多的(4S)四氢萘酮未反应。

因此，包含了完整的微生物即多形汉逊酵母ATCC号26012，导致比结构式(V)起始(4S)四氢萘酮更多的结构式(IV)起始(4R)四氢萘酮立体特异性还原((4S)∶(4R))，相比结构式(III)(4S)四氢萘酚，主要产生结构式(II)(4R)四氢萘酚(数据未显示)。产生的(4R)四氢萘酚大多数是(1S，4R)四氢萘酚，而产生的较少量的(4S)四氢萘酚大多数是(1S，4S)四氢萘酚。实施例II应用蓝色犁头霉ATCC号20137消旋四氢萘酮的还原A.    真菌蓝色犁头霉ATCC号20137的发酵

如下制备一种“对照”培养液(C2)和一种“测试”培养液(T2)：将约2.5ml无菌生长培养基(约20g/l右旋糖、约5g/l营养豆粉、约5g/l酵母提取物、约5g/l NaCl和约5g/l K₂HPO₄，用H₂SO₄调节pH至约7.0)加入两个16×125mm玻璃管的每一个中，每管具有一个金属罩(C2、T2)。

将约25μl约17％的蓝色犁头霉ATCC号20137冷冻甘油贮存液接种于T2中。在约29℃、约210转/分振摇下温育两管培养物。大约48小时后，向C2和T2中加入约50μl(约5mg/ml于乙醇中，终浓度约100μg/ml)消旋四氢萘酮(如实施例I所述，约5mg/ml于约100％乙醇中)。

大约5天后，向两管培养物的每一管中加入1ml NaCl(饱和)。用约3ml乙酸乙酯(纯)抽提每管培养物的发酵液(约3.6ml)：加入乙酸乙酯，振荡该管培养物，然后以约2000转/分离心(IEC离心机)。去除乙酸乙酯层，第二次抽提水层。在约50℃水浴中于氮下干燥结合的有机提取物。B.  残余的酮的构型：结构式(IV)和(V)的化合物

将如上所述制备的每种提取物重悬浮于约1ml乙醇中，通过注入HPLC柱：与Chiralcel OK柱(4.6×250mm)相连接的Chiralcel OK保护柱(4.6×50mm)分析约20μl的每种重悬浮的提取物。以流动相(乙醇∶乙酸乙酯，85∶15)每分钟约0.8ml的速率等度分离注入的每种重悬浮提取物中所含的化合物，使用设定于254nm的996 PDA检测仪(Waters^)检测该提取物所含的化合物。

以下所示C2和T2的HPLC数据表明，包含了微生物即蓝色犁头霉ATCC号20137，导致比结构式(V)起始(4S)四氢萘酮更多的结构式(IV)起始(4R)四氢萘酮立体特异性还原。

尤其是，手性分析的结果显示，蓝色犁头霉ATCC号20137培养物还原(4R)四氢萘酮，而使(4S)四氢萘酮基本上不反应(相对于约40.5％的(4S)四氢萘酮，剩余约13.6％的(4R)四氢萘酮)。这种手性HPLC确定(4S)四氢萘酮以约50％ee存在。

以下表II中C2和T2的数据表明，手性HPLC分析显示，包含了微生物即蓝色犁头霉ATCC号20137(T2)，产生至少两倍于未还原(4S)四氢萘酮比未还原(4R)四氢萘酮的比例，这进一步证明了本发明的微生物还原方法的立体特异性。以下报告的结果基于加入的已知量的每种对映体(如实施例I所述，每种约50μg/ml)。如上所述，起始消旋四氢萘酮浓度约为100μg/ml。

表II

  培养物 4S四氢萘酮  (μg/ml)  4R四氢萘酮   (μg/ml)  4S∶4R    C2    39.53     39.47     1    T2    20.24     6.81     3实施例III应用真菌、酵母和放线菌消旋四氢萘酮的还原

相关领域的熟练技术人员应当理解，对于本发明的还原中使用的、表III所列出的微生物，白地霉ATCC号62401、深黄被孢霉ATCC号38063、葡酒色被孢霉ATCC号09515、特异青霉ATCC号36740、Blastoschizomyces capitatus ATCC号28575、橄榄色单孢霉major变种(Monosporium olivaceum v.major)ATCC号36300、出芽短梗霉ATCC号16623、Pichia fabianii ATCC号16755和龟裂链霉菌ATCC号10970如实施例II所述制备；白地霉ATCC号34614、深黄被孢霉ATCC号42613、多形德巴利酵母ATCC号20280和酿酒酵母ATCC号15248除重复抽提外如实施例II所述制备；Candida schatavii ATCC号24409如下所述制备。

根据本发明如下制备和使用Candida schatavii ATCC号24409：将约2.5ml无菌生长培养基(约20g/l右旋糖、约5g/l营养豆粉、约5g/l酵母提取物、约5g/l NaCl和约5g/l K₂HPO₄，用H₂SO₄调节pH至约7.0)加入具有金属罩的16×125mm玻璃管中，随后向培养液中加入约0.1ml过滤除菌的溶液，该溶液含有约25g Tween^80、约100g甘油和约250ml蒸馏水。其次，将约25μl约17％的Candida schatavii ATCC号24409冷冻甘油贮存液接种于培养液中。在约29℃、约210转/分振摇下生长培养物。大约48小时后，向培养物中加入约50μl消旋四氢萘酮(结构式(I)的化合物，含有结构式(IV)和(V)的化合物，约5mg/ml于约100％乙醇中)的贮存液(约5mg/ml于约100％乙醇中，终浓度约100μg/ml)。

另外4天后，用等体积的乙酸乙酯(纯)抽提该培养物的发酵液(约2.6ml)，振荡培养物，然后以约2000转/分离心(IEC^离心机)。重复抽提。在约50℃水浴中于氮下干燥提取物。然后将该提取物重悬浮于约1ml乙醇中，通过注入HPLC柱：与Chiralcel OD柱(4.6×250mm，Daicel)相连接的Chiralcel OD保护柱(4.6×50mm，Diacel化学工业有限公司。)分析约5μl的重悬浮的提取物。以流动相(己烷∶异丙醇，95∶5)每分钟约0.9ml的速率等度分离注入的重悬浮提取物中所含的化合物，使用设定于210nm的996 PDA检测仪(Waters^)检测该提取物所含的化合物。

表III中报告的手性HPLC(如实施例I和II中进行的)数据显示，下列表III中列出的每种微生物立体特异地还原(4R)四氢萘酮多于(4S)四氢萘酮，通常产生至少约两倍于未反应(4S)四氢萘酮比未反应(4R)四氢萘酮的比例。

表III

培养物ATCC号，生物类型4S四氢萘酮(μg/ml)4R四氢萘酮(μg/ml)  4S∶4R白地霉-134614，真菌    18.23    7.85    2.32白地霉-262401，真菌    12.16    6.17    1.97深黄被孢霉-142613，真菌    3.33    1.36    2.45深黄被孢霉-238063，真菌    2.74    0.95    2.88葡酒色被孢霉09515，真菌    6.01    1.45    4.14特异青霉36740，真菌    10.39    5.50    1.89Blastoschizomycescapitatus28575，真菌    9.47    4.5    2.10橄榄色单孢霉major变种36300，真菌    10.39    0.71    14.6出芽短梗霉16623，真菌    11.76    3.65    3.22多形德巴利酵母20280，酵母    7.18    3.67    1.96酿酒酵母15248，酵母    24.33    14.42    1.69Candida schatavii24409，酵母    7.18    1.03    6.97Pichia fabianii16755，酵母    17.89    8.97    1.99龟裂链霉菌10970，放线菌    3.21    1.68    1.91

应当指出，尽管如表III的数据所示，橄榄色单孢霉major变种ATCC号36300基本上还原(4R)四氢萘酮多于(4S)四氢萘酮，因而是用于本发明的方法中的一种优选微生物，但是，对于该培养物也报道有不希望的(4R)四氢萘酮和(4S)四氢萘酮两者的降解。不希望的降解可能是由于例如完整微生物所含的其它酶等。因此，熟练的技术人员从在此提供的描述中将理解，相对于完整的橄榄色单孢霉major变种ATCC号36300，使用自橄榄色单孢霉major变种ATCC号36300分离的酶是优选的。