甲醇脱氢酶的新活化剂和其基因

摘要

利用编码在下面(A)或(B)中定义的蛋白质的DNA导入的细胞,将所述细胞培养在培养基中以便在培养基中生产和积累具有促进甲醇脱氢酶活性的活性的蛋白质,并且从培养基中收集蛋白质。(A)具有序列表中显示的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质,(B)序列表中显示的SEQID NO:2的氨基酸序列的蛋白质,包括一个或几个氨基酸的取代,缺失,插入,叠加或置换,并且具有促进甲醇脱氢酶的活性的活性,促进活性的方式是将DNA编码的蛋白质可以表达本发明提供了甲醇脱氢酶的新活化剂,编码它的DNA,表达DNA的细胞,和生产活化剂的方法。

说明书

本发明涉及甲醇脱氢酶的新活化剂，编码它的DNA，表达该DNA的细胞，和生产活化剂的方法。

已知甲醇芽孢杆菌菌株C1具有甲醇脱氢酶(下文也缩写为(MDH))，该菌株是属于芽孢杆菌属的同化甲醇细菌，该酶氧化用作碳源的甲醇成为甲醛(微生物文献，152，280-288，1989)。MDH可以用于样品中甲醇含量的测量。在这样的目的中，重要的是增强酶的比活性，而且长期已来一直在期望着增强酶之比活性的方法。

Arfman等人最近已经报道在甲醇芽孢杆菌C1中有促进MDH的酶活性的因子。它们纯化了构成因子的蛋白质，和确定这一蛋白质的N末端的部分氨基酸序列(生物化学杂志，266，3955-3960)。但是，这一因子的整个结构和其遗传结构都没有全部被已知。

顺便，枯草芽孢杆菌不能利用甲醇作为唯一碳源生长，所以没有完全认为这一微生物具有用作甲醇同化的第一反应的甲醇脱氢酶。事实上，当本发明人在已知的枯草芽孢杆菌的染色体DNA序列中寻找明显同源于甲醇芽孢杆菌C1的MDH的氨基酸序列和核苷酸序列的基因产物或基因，这样的基因产物或基因还没有发现。所以，在不同化甲醇的微生物象枯草芽孢杆菌中，还未知任何MDH的活化剂，还不能预期它的存在。

本发明的目的是提供促进MDH活性的新方法。

当本发明人研究不是甲醇同化细菌的枯草芽孢杆菌的基因组上的各种基因序列时，他们偶然发现该细菌具有能够编码同源于甲醇脱氢酶活化剂(MDH活化剂)的蛋白质的基因。当这一基因强迫性地在大肠杆菌中表达，成功地检测到促进甲醇脱氢酶活性的活性。所以已经完成了本发明。

就是说，本发明涉及在下面(A)或(B)中定义的蛋白质：

(A)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加，或置换的SEQID NO：2的氨基酸序列，并且具有促进甲醇脱氢酶的活性的活性的蛋白质。

本发明也提供了编码下面(A)或(B)中定义的蛋白质的DNA：

(A)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或置换的SEQ IDNO：2的氨基酸序列，并且具有促进甲醇脱氢酶活性的活性的蛋白质。

上面的DNA的具体例子包括下面(a)或(b)中确定的DNA：

(a)含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；

(b)在严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或从该核苷酸制备的探针可杂交，并且编码具有促进甲醇脱氢酶活性的活性的蛋白质的DNA。

在60℃，和在对应于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度进行洗涤的条件举证了上面的严格条件。

本发明也提供了以可以表达DNA编码的蛋白质的方式导入前面的DNA的细胞。

本发明进一步提供了生产具有促进甲醇脱氢酶活性的蛋白质的方法，包括在培养基中培养前面提到的细胞以便生产和积累蛋白质并且收集蛋白质。

为了本发明的目的，“甲醇脱氢酶的活性”指催化反应的活性，所述反应氧化甲醇以便产生甲醛。当具有这一活性的因子与甲醇脱氢酶共存时，“促进甲醇脱氢酶活性的活性”指明显增强甲醇脱氢酶比活性的活性。

根据本发明具有促进甲醇脱氢酶活性的活性的蛋白质下文中将指“MDH活化剂”。

根据本发明，提供了甲醇脱氢酶的新活化剂。这一MDH活化剂可以用于甲醇脱氢酶的反应机制分析以及工业重要过程如在目的样品中乙醇浓度的检测的基本研究。另外，根据本发明，获得了编码乙醇脱氢酶活化剂的DNA，并且它能够有效地生产该因子。所以，可以大规模低耗价地提供这一因子。

下文中，将详细说明本发明。

通过PCR(聚合酶链式反应)，利用枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌菌株168，的染色体DNA作为模板，以及具有序列表(BsYqK-G1)中显示的SEQ IDNO：5的核苷酸序列的引物，和具有序列表(BsYqk-G2)显示的SEQ ID NO：6的核苷酸序列的引物可以获得本发明的DNA。因为这些引物在它们的5’序列中具有限制酶ClaI或BamHI识别位点，利用这些限制酶消化的扩增产物可以插入具有ClaI和BamHI消化的末端的载体。

根据功能未知的yqkG基因(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列和枯草芽孢杆菌的其基因产物(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列设计了前面提到的引物的核苷酸序列，通过根据这一序列(SEQ ID NO：7)的部分氨基酸序列信息的数据库检索，已经发现基因之一是具有高度同源于起源于同化甲醇的甲醇芽孢杆菌菌株C1的MDH活化剂的氨基酸序列。利用这些引物，可以获得含有yqkG基因的编码区和它的侧翼区(约390个碱基的3’非翻译区)的DNA片断。

SEQ ID NO：1中显示了如上所述获得的本发明的DNA的编码区的核苷酸序列和该序列可以编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：2中仅显示了氨基酸序列。这些序列相同于yqkG的已知序列。

首先，很难期望不同化甲醇的枯草芽孢杆菌在基因组上保留参与甲醇同化和代谢的酶如MDH活化剂的基因，另外，演化到现在，当保留这样形式的基因时，可以从中表达活化酶。这是因为通常认为，即使保留了已经变成对芽孢杆菌生长不需要的酶的这样的基因，在微生物的进化过程中已经经受了随机突变，并且失去了它的活性。

但是，本发明人敢于克隆开放读码框架(下文也缩写为ORF)，在利用大肠杆菌作为寄主的强制表达系统中表达它，目的是证实是否功能未知的yqkG基因真正编码了可以真正增强酶活性的乙醇脱氢酶活性。作为结果，表达产物显示了促进MDH活性的活性，正如在下文的实施例中叙述的。将编码本发明的MDH活化剂的DNA命名为amd(甲醇脱氢酶的活化剂)。

当如上所述通过PCR获得本发明的DNA，通过利用根据本发明的DNA的核苷酸序列制备的低聚核苷酸组成的探针杂交，从枯草芽孢杆菌的染色体DNA文库也可以获得本发明的DNA。

在Sambrook，J.，Fritsch，和E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港实验室出版，1.21(1989)叙述了构建基因组DNA文库，杂交，PCR，质粒DNA制备，DNA的消化和连接，转化和诸如此类的方法。

假如增强编码的MDH活化剂的MDH活性的活性没有损坏，本发明的DNA可以编码在一个或多个位置包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，叠加或置换的MDH活化剂。虽然根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或类型，“几个”氨基酸的数目有变化，它可以是2到100，优选地2到50，和更优选地2到10。

例如通过位点特异性诱变方法，通过修饰MDH活化剂基因的核苷酸序列，可以获得编码与如上所述的MDH活化剂基本相同的蛋白质的DNA，以致在基因的特异位点的一个或多个氨基酸残基包括取代，缺失，插入，叠加，或置换。通过常规的已知突变处理可以获得如上所述修饰的DNA。突变处理包括例如利用羟胺体外处理编码MDH活化剂的DNA的方法，和利用紫外线辐射或诱变剂如N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(NTG)和通常用于突变处理的亚硝酸处理微生物例如属于含有编码MDH活化剂的DNA的大肠杆菌属的细菌的方法。

如上所述的核苷酸的取代，缺失，插入，叠加或置换也包括天然存在的诱变(突变或变异体)，例如菌株，微生物的种类或属中的不同。

通过在适当细胞中表达具有如上所述的突变的DNA，和研究增强表达的产物的MDH的活性可以获得编码与MDH活化剂基本相同的蛋白质的DNA。通过从编码具有突变的MDH活化剂的DNA或从含有它的细胞分离在严格条件下与含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或从DNA制备的探针杂交，并且编码具有增强MDH活性的蛋白质的DNA也可以获得编码与MDH活化剂基本相同的蛋白质的DNA。“严格条件”在本文中指所谓形成特异杂合体，不形成非特异杂合体的条件。利用任何数值是难于清楚地表达这一条件的。但是，例如，严格条件包括具有高度同源性的DNA，例如具有不少于50％同源性的DNA相互杂交，并且具有低于上面的同源性的DNA不相互杂交的条件。可替代地，在盐浓度对应于Southern杂交中洗涤条件，即60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选地，0.1×SSC，0.1％SDS的普通条件相互杂交DNA的条件举证了严格条件。

在如上所述条件下杂交的基因包括该具有在基因中产生的终止密码的那些和由于活性中心的突变而没有活性的那些。但是，可以容易地通过将该基因与市场可得活性表达载体连接，和根据如下所述的方法测量增强MDH的活性除去这样的突变基因。

利用适当的寄主载体系统表达编码本发明的MDH活化剂的DNA(amd基因)可以生产MDH活化剂。

作为表达amd基因的寄主，可以提到各种原核生物细胞包括属于埃希氏肠杆菌，芽孢杆菌，短杆菌和棒杆菌属的细菌如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，短芽孢杆菌，甲醇芽孢杆菌，属于噬甲基菌，甲基菌，和甲基杆菌的甲醇同化杆菌，各种真核细胞包括啤酒酵母，动物细胞和植物细胞。在其中，原核细胞，特别是大肠杆菌和枯草芽孢杆菌是优选的。当枯草芽孢杆菌内在性地保留了amd基因，强制性地表达amd基因能够在其中积累MDH活化剂。

作为在前面提到的寄主中导入amd基因的载体，可以提到的是pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pWM219，pWM218，Inco型质粒如RSF1010，IncP型质粒如pRK310，IncW型质粒如pSa，pBBR1(分子微生物学，1992，卷6(13)，1785-1799)，pAM330(日本专利待审公开号58-67699)和诸如此类。也可以利用噬菌体载体DNA。利用连接amd基因到任何这些载体获得的重组DNA载体转化寄主可以在寄主中导入amd基因。通过利用转导，转座(Berg，D.E.和Berg，C.M.，生物技术.，1，417(1983))，Mu噬菌体(未审日本专利公开(KOKAI)号2-109985)，或同源重组(分子遗传学实验，冷泉港实验室(1972))的方法也可以在寄主的染色体中导入amd基因。

另外，为了获得amd基因的有效表达，在编码MDH活化剂的DNA序列的上游可以连接在寄主细胞中起作用的启动子如lac，trp，和P_L，tet和tac。通过利用含有启动子的载体作为载体，一步可以进行amd基因与载体和启动子的连接。这样的载体，可以提到的是含有trp启动子的pT13sNco(生物化学杂志，104，30-34，1988中叙述)。

例如，正如对大肠杆菌K-12菌株(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志，53，159(1970))报道的通过氯化钙处理感受态细胞增强DNA的渗透性的方法，或如对枯草芽孢杆菌报道的(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.，和Young，F.E.，基因，1，153(1977))从生长期的细胞产生的感受态细胞中导入DNA的方法可以获得转化。正如枯草芽孢杆菌，放线菌，和酵母已知的制备容易掺入DNA的DNA感受态细胞的原生质体或原生质球并且在其中导入DNA也是可能的(Changs，S.和Choen，S.N.，分子基因遗传学，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，自然，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.，和Fink，G.R，美国科学院学报，75，1929(1978))。此外，通过电穿孔可以进行转化。根据用作寄主的细胞，从这些可以适当选择方法。 

通过如上所述在培养基中培养导入amd基因的细胞以致在培养基中应该形成和积累MDH活化剂并且从培养基收集MDH活化剂可以生产MDH活化剂。根据利用的寄主可以适当地选择用于培养的培养基。当利用大肠杆菌作为寄主利用trp启动子表达MDH活化剂时，M9-酪蛋白氨基酸葡萄糖培养基是优选的。当在37℃进行培养时，在开始培养后几个小时，在培养基中加入trp启动子的诱导物吲哚丙烯酸(LAA)到最后浓度25微克/毫升，进一步继续培养，MDH活化剂将在细胞中积累。当产生MDH活化剂使利用适当的分泌系统应该细胞外分泌时，MDH活化剂在培养基中积累了。

正如要求的，利用酶的常用纯化方法，例如，离子交换层析，凝胶过滤层析，吸附层析，溶剂沉淀和诸如此类可以从细胞提取物或培养基中纯化如上所述生产的MDH活化剂。

通过在MDH反应混合物中加入本发明的MDH活化剂，可以增强MDH的比活性。所以，当利用MDH测量样品中甲醇的含量时可以利用它。只要是MDH，本发明的MDH活化剂增强其活性的靶酶没有特别限制，其中的例子包括短芽孢杆菌，甲醇芽孢杆菌，甲基短杆菌(Brevibacterium methylicum)和诸如此类生产的MDH。虽然加入到MDH反应混合物的MDH活化剂的量没有特别限制，例如MDH和MDH活化剂的分子数目比例应该是2∶1到1∶5的量可以考虑是利用的量的标准。

通过在大肠杆菌中表达编码MDH(mdh)的基因可以获得短芽孢杆菌的MDH。通过PCR(聚合酶链式反应)，利用短芽孢杆菌的染色体DNA，例如短芽孢杆菌菌株S1作为模板，和序列表(MDH-BM-1)显示的SEQ ID NO：3的核苷酸序列的引物和具有序列表(MDH-BM-2)显示的SEQ ID NO：4的核苷酸序列的引物可以获得短芽孢杆菌的mdh基因。

正如实施例中显示的，通过在波长340纳米的光的吸光值的测量，估计伴随甲醇氧化成甲醛的NAD⁺(尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸)还原可以确定MDH活性。

根据反应条件，MDH活化剂的浓度和诸如此类可以改变本发明的MDH活化剂产生的MDH比活性的增强程度，它通常在适当条件下增强特异的活性8倍或更多。

下文中，参考下面的实施例，将进一步特异地说明本发明。

<1>寻找编码展示与同化甲醇芽孢杆菌的乙醇脱氢酶活化剂同源的氨基酸序列的蛋白质的基因

正如对于甲醇芽孢杆菌菌株C1的甲醇脱氢酶活化剂的结构，小部分氨基酸序列，即来自N-末端的36个氨基酸已经知道(生物化学杂志，266，3955-3960，1991)。另外，最近确定和公开了一些微生物基因组的整个核苷酸序列。所以，根据蛋白质数据库SWISS-PROT(欧洲生物信息研究院(EBI))，Release 34.0利用Genetyx-Mac系统(软件发展公司)进行氨基酸序列同源性检索。结果，功能未知的枯草芽孢杆菌的yqkG基因获得高度的同源性得分。所以，利用大肠杆菌作为寄主强制性地表达了这一yqkG基因以便证实是否yqkG真正编码了作用为乙醇脱氢酶活化剂的蛋白质。

<2>枯草芽孢杆菌yqkG的克隆和它在大肠杆菌中的强制性地表达

根据枯草芽孢杆菌菌株168的已经报道的基因组核苷酸序列信息，通过PCR扩增含有yqkG的开放读码框架(ORF)的区域。利用的DNA引物是BsYqk-G1(序列表中的SEQ ID NO：5)，和Bsyqk-G2(序列表中的SEQ ID NO：6)。利用限制酶ClaI的识别序列在它的5’序列掺入Bsyqk-G1。利用限制酶BamHI的识别序列在它的5’序列掺入BsYqk-G2。

在另一方面，以常规方法从芽孢杆菌168制备基因组(Biochim.Biophy.Acta，72，619-629(1963))。PCR反应包括在94℃热处理90秒，以及98℃ 10分钟，58℃ 20秒，和70℃ 1分钟处理28个循环，和在73℃保持3分钟，并且利用LA-Taq(Takara Shuzo公司生产)进行。通过这一反应获得了需要的大小的DNA片断。纯化这一DNA片断，利用ClaI和BamHI限制性酶处理获得在两个末端具有ClaI和BamHI消化末端的yqkG片断。

在另一方面，利用具有色氨酸启动子(ptrp)的质粒pT13sNco(在生物化学杂志，104，30-34(1988))作为表达前面提到的DNA片断的高度表达质粒。利用限制酶ClaI和BamHI消化pT13sNco获得更大片断的载体部分。利用T4连接酶将这一片断与上面的yqkG连接以便构建yqkG表达质粒pT-Bsb-yqkG1。  

以常规方法利用质粒pT-Bsb-yqkG1转化大肠杆菌JM109以便获得转化体JM109/pT-Bsb-yqkG1。以秘密数目的AJ13484给出转化体JM109/pT-Bsb-yqkG1，将它在1998年8月12日保藏在国际贸易工业部，工业科学和技术局，国立生命科学和人体技术研究所日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，邮编305-8566，接受的登记号为FERM P-16938。在1999年6月30日根据布达佩斯条约从该原始保藏转移到国际保藏，并且已经以登记号FERM BP-6774保藏。作为对照，利用的是保留载体区段pT13sNco，pTTNco(JM109/pTTNco)的大肠杆菌JM109菌株。

在37℃，在含有100毫克/升的抗生素氨苄青霉素的M9-酪蛋白氨基酸葡萄糖培养基(M9-CA-Glc培养基)中培养这些转化体，将从ptrp转录的诱导物吲哚丙烯酸(LAA)加入培养基中直到约2小时后的最后浓度为25微克/毫升，继续培养6小时，然后从4毫升培养基中收获细胞。在这些细胞中加入1毫升悬浮缓冲液(50毫摩尔/升磷酸钾(pH7.6)，3毫摩尔/升氯化镁，1毫摩尔/升二硫苏糖醇)，在其中悬浮细胞。然后，通过超声波分裂细胞，离心(15000rpm，30分钟)获得可溶部分，用作测试样品。

<3>在大肠杆菌中克隆短芽孢杆菌mdb和强制性表达mdb

为了证实促进前面提到的测试样品活性的MDH活性，如下制备了甲醇脱氢酶。

以常规方法，从热耐受甲醇同化芽孢杆菌，短芽孢杆菌S1菌株(从NCIMB获得的NCIMB号，12524)制备了染色体DNA。利用这-DNA作为模板通过PCR克隆MDH基因。

利用的DNA引物是MDH-BM-1(序列表中的SEQ ID NO：3)，和MDH-BM-2(序列表中的SEQ ID NO：4)。由已知的甲醇芽孢杆菌C1的MDH基因的核苷酸序列(以完全名称BACMDH登记在基因库)生产这些。PCR反应包括在94℃加热处理90秒，以98℃ 10秒，55℃ 30秒，70℃ 4分钟处理30个循环，并保持在72℃ 10分钟热处理，并且利用LA-Taq(Takara Shuzo公司生产)进行。通过这一反应获得需要大小的DNA片断。纯化这一DNA片断，并且克隆进入商业可得载体pCR2.1以便获得pCP-mdh24-1。另外，在大肠杆菌JM109菌株中导入这一片断以便构建转化体pCR-mdh24-1/JM109。

在含有100毫克/升的氨苄青霉素的25毫升LB培养基在37℃(振摇过夜培养转化体pCR-mdh24-1/JM109。然后，正如前面提到的yqkG基因的制备，以同样的方式离心收集细胞。在这些细胞中加入缓冲液，在其中悬浮细胞。然后，通过超声波裂解细胞，再次离心制备含有甲醇脱氢酶的可溶部分。

测量前面提到的MDH酶制剂的MDH活性。通过在340纳米波长处光吸光值的测量估计伴随甲醇氧化成甲醛的NAD⁺(尼克酰胺二核苷酸)的还原确定MDH活性。

具体地，以0.9毫升每个(靶样品和对照)在分光光度计的比色杯中注入反应溶液[50毫摩尔/升甘氨酸/氢氧化钾缓冲液(pH9.5)，2毫摩尔/升硫酸镁，0.1毫摩尔/升二硫苏糖醇，和1毫摩尔/升NAD⁺]，保持在50℃5分钟。然后，在比色杯中加入0.05毫升可溶细胞部分作为样品，并且混合，测量吸光值的增加证实反应的背景。然后，在比色杯中加入0.1毫升水作为对照，或在样品的比色杯中加入0.05毫升12摩尔/升的甲醇开始反应，利用在340纳米的波长处的吸光值的增加伴随NAD⁺的还原作为指标测量甲醇脱氢酶的活性。 

结果，当利用从转化体pCR-mdh24-1/JM109获得的细胞提取液，比较对照菌株JM109/pTTNco的情况检测明显的甲醇脱氢酶的活性。

<4>通过yqkG促进MDH酶活性的效果

然后，证明是否如提到的<2>中叙述制备的转化体JM109/pT-Bsb-yqkG1的可溶酶部分可以促进MDH的酶活性。

预先混合0.04毫升JM109/pTTNco可溶部分(对照)，或JM109/pT-Bsb-yqkG1的可溶部分(目的样品)，和0.04毫升pCR-mdh24-1/JM109的可溶部分(MDH酶样品)。在包含在比色杯中的0.9毫升反应混合物[50毫摩尔/升甘氨酸/氢氧化钾缓冲液(pH9.5)，2毫摩尔/升硫酸镁，0.1毫摩尔/升二硫苏糖醇，和1毫摩尔/升NAD⁺]中加入0.08毫升每种混合物用于活性测量以便测量甲醇脱氢酶活性。

结果，发现JM109/pT-Bsb-yqkG1的可溶部分含有促进MDH活性的活性超过JM109/pTTNco的两倍(表1)。

表1：乙醇脱氢酶活化剂的酶反应的促进 

加入的样品¹⁾ΔOD340纳米/分钟活化比例2)(％)JM109/pT-Bsb-yqkG0.792250JM109/pTTNco(对照)0.3181001)加入含有乙醇脱氢酶的粗酶部分的样品2)根据确定为100％的对照样品中的乙醇脱氢酶活性计算的值

<5>说明序列表

SEQ ID NO：1；活化剂yqkG的氨基酸序列，

SEQ ID NO：2；yqkG3的编码区的核苷酸序列，

SEQ ID NO：3；用于MDH的PCR克隆的上游引物MDH-BM-1，

SEQ ID NO：4；用于MDH的PCR克隆的下游引物MDH-BM-2，SEQ ID NO：5；用于yqkG的PCR克隆的上游引物BS-YQKG1-1，SEQ ID NO：6；用于yqkG的PCR克隆的下游引物BS-YqkG2-2，SEQ ID NO：7；甲醇芽孢杆菌C1的MDH活化剂的氨基末端的序列。序列表<110>味之素公司<120>乙醇脱氢酶的新活化剂和其基因<130>OP884<140><141>1999-09-<150>JP 10-248297<151>1998-09-02<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>555<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<220><221>CDS<222>(1)...(555)<400>1atg aaa tca tta gaa gaa aaa aca att gcc aaa gaa cag att ttt tcg  48Met Lys Ser Leu Glu Glu Lys Thr Ile Ala Lys Glu Gln Ile Phe Ser  1               5                  10                  15ggt aaa gtc att gat ctt tat gtc gag gat gta gag ctg cca aac ggc  96Gly Lys Val Ile Asp Leu Tyr Val Glu Asp Val Glu Leu Pro Asn Gly

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130                 135                 140gaa gtg atg gag gtg acg ctt gaa gat gcg cta aag ctg gtt gaa tcg  480Glu Val Met Glu Val Thr Leu Glu Asp Ala Leu Lys Leu Val Glu Ser145                 150                 155                 160cgt gaa gta tat gat gct aaa aca gcc tac gcg att cag tat ctt cag  528Arg Glu Val Tyr Asp Ala Lys Thr Ala Tyr Ala Ile Gln Tyr Leu Gln

            165                 170                 175ctg aaa gaa gcg ctc caa gca caa aaa                              555Leu Lys Glu Ala Leu Gln Ala Gln Lys

        180                 185<210>2<211>185<212>蛋白质<213>枯草芽孢杆菌<400>2Met Lys Ser Leu Glu Glu Lys Thr Ile Ala Lys Glu Gln Ile Phe Ser  1               5                  10                  15Gly Lys Val Ile Asp Leu Tyr Val Glu Asp Val Glu Leu Pro Asn Gly

         20                  25                  30Lys Ala Ser Lys Arg Glu Ile Val Lys His Pro Gly Ala Val Ala Val

     35                  40                  45Leu Ala Val Thr Asp Glu Gly Lys Ile Ile Met Val Lys Gln Phe Arg

 50                  55                  60Lys Pro Leu Glu Arg Thr Ile Val Glu Ile Pro Ala Gly Lys Leu Glu 65                  70                  75                  80Lys Gly Glu Glu Pro Glu Tyr Thr Ala Leu Arg Glu Leu Glu Glu Glu

             85                  90                  95Thr Gly Tyr Thr Ala Lys Lys Leu Thr Lys Ile Thr Ala Phe Tyr Thr

        100                 105                 110Ser Pro Gly Phe Ala Asp Glu Ile Val His Val Phe Leu Ala Glu Glu

    115                 120                 125Leu Ser Val Leu Glu Glu Lys Arg Glu Leu Asp Glu Asp Glu Phe Val

130                 135                 140Glu Val Met Glu Val Thr Leu Glu Asp Ala Leu Lys Leu Val Glu Ser145                 150                 155                 160Arg Glu Val Tyr Asp Ala Lys Thr Ala Tyr Ala Ile Gln Tyr Leu Gln

            165                 170                 175Leu Lys Glu Ala Leu Gln Ala Gln Lys

        180                 185<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物MDH-BM-1<400>3taaaaaggat ccccgatgat acaacaccaa acgg          34<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人序列的描述：引物MDH-BM-2<400>4gaccgaattc catgtagttt ttcctcattc acc           33<210>5<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物BS-YQKG1-1<400>5gggaatcgat aaaatgaaat cattagaaga aaaaacaatt gcc   43<210>6<211>38<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物Bs-YgkG2-2<400>6taaatggatc cttttcagcc gggctgacag ccagtttg    38<210>7<211>36<212>蛋白质<213>甲醇芽孢杆菌<400>7Gly Lys Leu Phe Glu Glu Lys Thr Ile Lys Thr Glu Gln Ile Phe Ser  1               5                  10                  15Gly Arg Val Val Lys Leu Gln Val Asp Asp Arg Glu Tyr Pro Asn Gly

         20                  25                  30Gln Thr Val Lys

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