通过导入矮牵牛属转录因子PetSPL2的基因以缩短花序节间的方法

摘要

本发明涉及编码DNA的基因,所述DNA选自a)或b):a)具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第190位—第807位之核苷酸序列的DNA;或b)在严格条件下能与a)之DNA杂交,并编码能改变植物特性的转录因子的DNA。

说明书

本发明涉及编码可改变植物特性之转录因子的基因及其用途，本发明更具体地涉及得自Petunia hybrida的新基因，即PetSPL2基因，与其相关的基因，及其用途。

为了阐明控制植物特性，如花的形态发生的调控机制，已使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)，金鱼草(Antirrhinum majus)和Petunia hybrida进行了分子生物学和分子遗传学方面的研究。其中特别优选Petunia hybrida用作研究对象是因为下列原因：作为园艺植物具有较高价值；种类多样；易于转化；因其花大而易于观察；和遗传学发现的积累(H.Takatsuji，“决定植物形状的分子机制”，细胞技术，植物细胞技术系列(SHUJUNSHA)，p96-106)。

已从上述植物的花器官有所改变的突变体中分离出导致突变的基因，结果，逐渐明白转录因子在花的分化和形态发生方面起着重要的作用，例如，拟南芥的SUPERMAN是具有锌指基元作为DNA结合区域的转录因子。已知在基因已突变的SUPERMAN突变体中，雄蕊的数目显著增加，而雌蕊是有缺陷的(THE IDEN，1997-4(Vol.51，No.4)，p34-38)。

为了理解控制植物特性的机制，重要的是鉴定参与这种控制的新的转录因子。通过使用基因工程方法可将控制花的形态发生的转录因子的基因导入植物。使用基因导入法所得植物的花具有新的特性，通过常规的繁殖方法未曾得到或也不可能得到这种新特性。据认为具有这种新特性的植物具有园艺学价值。

本发明的基因所具有的DNA选自a)或b)：a)具有序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第190位-第807位之核苷酸序列的DNA；或b)在严格条件下能与a)之DNA杂交，并编码能改变植物特性的转录因子的DNA。

本发明的基因所编码的转录因子选自i)或ii)：i)具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的第1位-第206位之氨基酸序列的转录因子；或ii)所具有的氨基酸序列为i)中的一个或多个氨基酸缺失，取代或添加所致，并能改变植物特性的转录因子。

在本发明的一个实施方案中，植物的特性选自植物高度和节间长度之一。

生产本发明转基因植物的方法包括的步骤有：将上述基因导入植物细胞；和由具有导入基因的植物细胞再生植物体。

在本发明的一个实施方案中，植物属于双子叶植物。

在本发明的另一个实施方案中，植物属于茄科。

在本发明的另一个实施方案中，植物属于矮牵牛属。

在本发明的另一个实施方案中，基因被掺入植物表达载体。

本发明的转基因植物是通过上述方法产生的。

因此，本发明的优点在于(1)提供了编码能改变植物特性，尤其是植物高度和节间长度之转录因子的基因；(2)提供了通过导入基因而生产特性有所改变之植物的方法；和(3)提供了转基因植物。

参照附图，阅读并理解下列详细的描述后，本发明的这些和其它优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

图1表示PetSPL2基因的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列。

图2图解表示PetSPL2高表达载体(pBIN-35S-PetSPL2)。

图3表示检测被PetSPL2基因转化的Petunia hybrida中PetSPL2基因之mRNA的变性琼脂糖凝胶电泳图的放射自显影。

图4表示野生型Petunia hybrida(右)和被PetSPL2基因转化的Petunia hybrida(左)的植物体形态学图。

图5表示野生型Petunia hybrida(左)和被PetSPL2基因转化的Petunia hybrida(右)的节间图。

下文中将详细描述本发明。

本文所用术语“转录因子”指的是与基因的DNA调控区域结合以控制mRNA合成的蛋白质。已知一些转录因子在它们的DNA结合区域具有被称为锌指基元的高度保守的氨基酸序列。

本发明的基因编码能改变植物特性的转录因子，这种基因可以具有下列DNA中的任一种：

a)具有序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第190位-第807位之核苷酸序列的DNA；或

b)在严格条件下能与a)之DNA杂交，并编码能改变植物特性的转录因子的DNA。

本发明基因也可具有编码能改变植物特性的转录因子，并与a)的DNA有约60％或更多，优选约70％或更多，更优选约80％或更多，再更优选约90％或更多的同源性的DNA。

优选本发明的基因含有a)的DNA。

本发明的基因也编码下列转录因子中的任一种：

i)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的第1位-第206位之氨基酸序列的转录因子；或

ii)所具有的氨基酸序列为i)中的一个或多个氨基酸缺失，取代或添加所致，并能改变植物特性的转录因子。

经缺失，取代或添加的氨基酸的数目约为130或更少，优选约为60或更少，更优选约为30或更少，再更优选约为20或更少，再更优选10或更少。

优选本发明的基因编码i)的转录因子。

本发明中特别优选的基因是PetSPL2基因。图1表示此基因的cDNA序列(SEQ ID NO：1)及其推定的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)。

“植物特性”的改变指的是植物至少一个特性的任何改变。植物特性包括但不限于植物高度和植物节间长度中的至少一个。通过将导入本发明基因而得到的植物的特性与导入基因前植物(野生型或园艺型)的特性相比较即可评估这些变化。

植物高度改变的例子包括但不限于矮化和半矮化，优选比导入基因前的植物标准高度矮约1/2或更少，更优选矮约1/3或更少。

节间的长度改变的例子包括但不限于节间的缩短。节间缩短包括繁殖枝条(即花序)之节间和营养枝条(即叶序)之节间的任何缩短，花序的缩短是特别优选的改变的例子。优选节间长度的改变与导入基因前植物标准节间相比，达到的长度约为1/2或更少，更优选约为1/5或更少，最优选约为1/10或更少。

改变的植物特性的例子是矮化和节间缩短的联合，更优选为矮化和花序节间缩短的联合。

通过例如用植物基因组DNA作为模板，使用一对对应于由已知转录因子的基因编码的氨基酸序列保守区域的简并引物进行聚合酶链反应(PCR)，使用由此得到的扩增DNA片段作为探针筛选相同植物的基因组文库即可分离出本发明的基因。一对引物的例子包括5’-CARGCNYTN GGNGGNCAY-3’(SEQ ID NO：3)或5’-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3’(SEQ ID NO：4)与5’-ARNCKNARYTCNARRTC-3’(SEQ ID NO：5)的联合，其中N是肌苷，R是G或A，Y是C或T，K是T或G。

根据厂商对商购试剂盒和仪器的说明，或根据本领域技术人员众所周知的方法可进行PCR。本领域技术人员熟知生产基因文库的方法，用于与探针杂交的严格条件，和克隆基因的方法，例见Maniatis等，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约(1989)。

通过本领域已知的核苷酸序列分析法或通过商购的自动化测序仪可测定所得基因的核苷酸序列。

本发明的基因并不限于分离自天然基因组的基因，也包括合成的多核苷酸。通过例如使用本领域技术人员熟知的方法修饰上述已测序的基因即可得到合成的多核苷酸。

通过本领域技术人员熟知的方法可将本发明的基因连接到适当的植物表达载体中，并通过已知的基因重组技术将所述载体导入植物细胞中。被导入的基因掺入植物细胞的DNA中，植物细胞的DNA包括植物细胞的多种细胞器(如线粒体，叶绿体等)以及染色体中所含的DNA。

“植物”包括单子叶植物和双子叶植物，优选的植物是双子叶植物。双子叶植物包括Archichlamiidae和Sympetalidae，优选Sympetalidae植物。Sympetalidae植物的例子包括龙胆目(Gentianales)，茄目(Solanales)，野芝麻目(Lamiales)，水马齿目(Callitrichales)，车前目(Plantaginales)，风铃草目(Campanulales)，玄参目(Scrophulariales)，茜草目(Rubiales)，川断续目(Dipsacales)，紫宛目(Asterales)等，优选茄目植物。茄目植物的例子包括茄科(Solanaceae)，田基麻科(Hydrophyllaceae)，花忍科(Polemoniaceae)，菟丝子科(Cuscutaceae)，旋花科(Convolvulaceae)等，优选茄科。茄科包括矮牵牛属，曼陀罗属(Datura)，烟草属(Nicotiana)，茄属(Solanum)，番茄属(Lycopersicon)，辣椒属(Capsicum)，酸浆属(Physali)s和枸杞属(Lycium)等，优选矮牵牛属，曼陀罗属和烟草属的植物，更优选矮牵牛属。矮牵牛属植物的例子包括P.hybrida，P.axillaris，P.inflata，P.violacea等，特别优选P.hybrida植物。除非另有说明，“植物”指的是具有花和/或果实的植物体和得自该植物体的种子。

“植物细胞”的例子包括得自如叶和根的植物器官，愈伤组织的细胞，和经培养的细胞的悬浮液。

本文所用的术语“植物表达载体”指的是核酸序列，其中调控本发明基因表达的多种调控元件，如启动子，互相连接以使其在植物宿主细胞中发挥作用。优选植物表达载体包括植物启动子，终止子，药物抗性基因和增强子。本领域技术人员都知道随着宿主细胞类型的不同，植物表达载体和调控元件的类型也会有所不同。本发明所用植物表达载体可另外含有T-DNA区域，T-DNA区域使得基因能被有效导入植物基因组，尤其是当使用农杆菌转化植物时更是如此。

本文所用术语“植物启动子”指的是在植物中行使功能的启动子。优选组成型启动子以及在包括花的植物体部分选择性地起作用的组织特异性启动子。植物启动子的例子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂氨酸合成酶启动子。

本文所用术语“终止子”指的是位于编码蛋白质之基因区域的下游的序列，该序列涉及mRNA转录的终止和polyA序列的加入。已知终止子有利于mRNA的稳定性，从而影响基因的表达水平。这种终止子的例子包括但不限于CaMV 35S终止子和胭脂氨酸合酶基因的终止子(Tnos)。

为了便于选择转基因植物，需要“药物抗性基因”，用于本发明的这种药物抗性基因的例子包括但不限于赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因，和赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因。

“增强子”可用于增强所需基因的表达水平，优选的增强子是含有上述CaMV 35S启动子之上游序列的增强子区域，在一个植物表达载体中可使用一个以上的增强子。

通过使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术可产生本发明的植物表达载体，构建植物表达载体的优选载体的例子包括但不限于pBI-型载体或pUC-型载体。

通过使用本领域技术人员熟知的方法，如用农杆菌感染植物细胞的方法或直接将载体导入细胞的方法，可将植物表达载体导入植物细胞中。使用农杆菌的方法可参照例如Nagel等，Microbiol.Lett.，67，325，1990，根据此方法，首先通过例如电穿孔用植物表达载体转化农杆菌，然后通过众所周知的方法，如叶盘法用经转化的农杆菌感染植物细胞。直接将植物表达载体导入细胞的方法的例子包括但不限于电穿孔法，微粒枪法，磷酸钙法和聚乙二醇法，这些方法是本领域熟知的方法，本领域技术人员可适当选择适于欲转化的特定植物的方法。

可根据其药物抗性，如卡那霉素抗性选择其中已导入植物表达载体的细胞，然后使用常规方法使细胞再生为植物体。

通过使用本领域技术人员熟知的方法可确证本发明的被导入基因在再生植物体中的表达，例如通过Northern印迹分析可进行这种确证。更具体地说，从所得植物的叶中提取总RNA，对总RNA进行变性的琼脂糖凝胶电泳，然后将RNA印迹到适当的膜上。印迹可与经标记的RNA探针杂交，所述探针与被导入基因的一部分互补，从而检测出得自本发明基因的mRNA。

本发明的植物是通过上述方法产生的转基因植物。优选转基因植物被改变的特性(即植物的高度和/或节间的长度)包括在已知的野生型或园艺型中未曾发现过的特性。也优选植物经改变的特性在园艺学上有价值。另外，优选植物经改变的特性在随后的传代过程中稳定保守。

实施例

下文中，将通过下列说明性的实施例描述本发明。用于下列实施例的限制性酶，质粒等可购自厂商。实施例1：PetSPL2基因的分离

将拟南芥SUPERMAN基因编码的蛋白质与特别地在大豆根瘤中表达的GmN479基因编码的蛋白质(Kouchi等，私人通讯)进行比较，根据共存于两种蛋白质中的氨基酸序列合成3个用于PCR的不同简并引物。基因5’至3’方向的两个引物的核苷酸序列分别为5’-CARGCNYTNGGNG GNCAY-3’(引物1，对应于氨基酸序列QALGGH；SEQ ID NO：3)和5’-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3’(引物2，对应于氨基酸序列LGGHMN；SEQ ID NO：4)，基因3’至5’方向的引物的核苷酸序列为5’-ARNCKNARYTCNARRTC-3’(引物3，对应于氨基酸序列DLELRL；SEQ ID NO：5)，其中N是肌苷，Y是C或T，R是G或A，K是T或G。

使用根据Boutry，M.和Chua N.H.(1985)EMBO J.4，2159-2165所述方法提取的矮牵牛属(Petunia hybrida var.Mitchell)基因组DNA作为模板，用引物1和引物3在下列条件下进行第一套PCR：94℃10分钟，接着进行30次94℃30秒，50℃30秒和72℃60秒的循环，然后72℃7分钟。另外，用引物2和引物3进行第二套PCR，使用的模板是第一套PCR产物的一部分，反应条件与第一套PCR中所用的相同。将扩增的DNA片段插入TA克隆载体(Invitrogen生产)，然后根据常规方法将所述载体导入E.coli。从被转化的E.coli中提取质粒并测定DNA片段的核苷酸序列。结果表明所得DNA片段内编码了SUPERMAN和GmN479中共同含有的锌指基元部分，衍生此DNA片段的基因被称为PetSPL2基因。在相同系列的实验中，阐明了所含核苷酸序列类似于PetSPL2的3个其它DNA(PetSPL1，3和4基因)的存在。有关PetSPL3基因的细节参见日本专利申请10-65921。

为了克隆PetSPL2基因的cDNA，使用上述DNA片段和GENETRAP cDNA筛选试剂盒(BRL生产)筛选使用BRL试剂盒已在pSPORT质粒载体(BRL生产)中制备的矮牵牛属(Petuniahybrida var.Mitchell)花蕾的cDNA文库。通过筛选此cDNA文库得到几个PetSPL2基因的克隆，因此分离出得自矮牵牛属的PetSPL2基因的cDNA。实施例2：分析PetSPL2基因的核苷酸序列和氨基酸序列

实施例1所得克隆中最长的克隆含有PetSPL2基因的约1.0kb的cDNA片段。测定此cDNA片段的DNA核苷酸序列(SEQ IDNO：1)，由所得DNA核苷酸序列中所含的开放阅读框推定蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

核苷酸序列的比较表明PetSPL2基因与SUPERMAN，PetSPL1和PetSPL4基因分别表现出58％，67％和51％的核苷酸序列同源性。PetSPL2基因与PetSPL3基因表现出52％的核苷酸序列同源性。这种核苷酸序列的比较仅在每个基因的编码区内进行。

PetSPL2推定的氨基酸序列含有与SUPERMAN类似的单个TFIIIA-型锌指基元，以此为基础，假定PetSPL2为转录因子。PetSPL2在全长氨基酸序列上与SUPERMAN和PetSPL3分别表现出约37％和23％的同源性。

表1将SUPERMAN和各种PetSPL的锌指基元之氨基酸序列进行了比较，PetSPL2与SUPERMAN的锌指基元的氨基酸同源性(约100％)与PetSPL1与SUPERMAN的相应同源性(约100％)相同，但高于PetSPL3与SUPERMAN的相应同源性(约76％)(其中假定锌指基元由第4个C延伸至第24个H以计算氨基酸序列的同源性)。表1也显示出SUPERMAN与各种PetSPL的C末端疏水区的比较。表1锌指C-末端疏水区

从上述结果可推定PetSPL2是新的转录因子，它与SUPERMAN的关系比与PetSPL3的关系更近，并属于不同于PetSPL3的一类转录因子。实施例3：构建含有编码PetSPL2之多核苷酸的植物表达载体

依次将含有质粒pBI221(购自Clontech)之CaMV 35S启动子的DNA片段(HindIII-XbaI片段)和含有NOS终止子的DNA片段(SacI-EcoRI片段)插入质粒pUCAP的多克隆位点(Van Engelen，F.A.等，Transgenic Res.4：288-290(1995))，产生pUCAP35S。另一方面，在KpnI和SacI位点(皆为载体中的位点)裂解含有PetSPL2的pSPORT/PetSPL2质粒，并插入pUCAP35的KpnI和SacI位点之间。再用AscI和PacI裂解此重组质粒，将所得的编码PetSPL2的DNA片段导入二元载体pBINPLUS(Van Engelen，F.A.等，(1995)，文献同上)的AscI和PacI位点中。

如图2a所示，构建的PetSPL2基因高表达载体(pBIN-35S-PetSPL2)包括CaMV 35S启动子区(P35S；0.9kb)，编码PetSPL2的本发明多核苷酸(PetSPL2；1.0kb)和胭脂氨酸合酶的终止子区(Tnos；0.3kb)。图2中，Pnos和NPTII分别表示胭脂氨酸合成酶和新霉素磷酸转移酶II基因的启动子区。LB和RB分别表示T-DNA左边界和T-DNA的右边界。实施例4：将PetSPL2基因导入矮牵牛属细胞(1)根瘤农杆菌的转化

于28℃，在含有250μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的L培养基中培养根瘤农杆菌LBA4404系(购自Clontech)。根据Nagel等(1990)(文献同上)的方法制备此菌株的细胞悬浮液。通过电穿孔将实施例3中构建的PetSPL2基因高表达载体导入上述菌株。(2)将编码PetSPL2的多核苷酸导入矮牵牛属细胞

在YEB培养基(D.M.Glover编，DNA克隆，IPL出版社，第2版，p78)中振荡培养(28℃，200rpm)(1)中所得的根瘤农杆菌LBA4404系，接着用无菌水稀释20倍。在此稀释溶液中培养矮牵牛属(Petunia hybrida var.Mitchell)的叶切片，2-3天后，使用含有羧苄青霉素的培养基除去农杆菌，然后通过每过2周即转移到新鲜培养基中，在选择培养基中传代培养这些叶切片。卡那霉素抗性性状被用作选择经转化的矮牵牛属细胞的标志，所述抗性是由得自pBINPLUS的，与上述PetSPL2基因一起导入的NPTII基因的表达所赋予的。使用常规方法由经转化的细胞诱导愈伤组织，然后重新分化成植物体。实施例5：PetSPL2基因在PetSPL2转化植物中的表达

从实施例4中所得的14株被PetSPL2转化的矮牵牛的叶中提取总RNA，根据常规方法对10μg各种提取物进行变性的琼脂糖凝胶电泳并印迹到Genescree plus滤膜(由DuPont制造)上。使用DIG RNA标记试剂盒(由Boeringer Mannheim制备)标记PetSPL2反义RNA。根据试剂盒的说明，用经标记的RNA进行杂交和滤膜的洗涤，洗涤后，室温下将滤膜暴露于XAR胶片(Kodak产)1小时，图3表示检测13株矮牵牛之PetSPL2基因mRNA的变性琼脂糖凝胶电泳图像的放射性自显影，这些结果表明13株独立的矮牵牛转化体中有4株在高表达启动子的控制之下以高水平表达了PetSPL2mRNA。实施例6：以高水平表达PetSPL2基因的矮牵牛转化体的表型

在以高水平表达PetSPL2基因的4株独立的矮牵牛转化体中的3株(除1株表达水平相对较低的矮牵牛)中普遍观察到下述表型，与上述3株矮牵牛相比，剩下的1株矮牵牛以相对较低的水平表达PetSPL2基因。在植物体中观察到的最显著的变化是花序节间长度的缩短(即对节间伸长的抑制)和与之相关的矮化(图4；左图表示PetSPL2-转化的矮牵牛，右图表示野生型矮牵牛)，相对于营养阶段而言，在繁殖阶段即花序中观察到的变化更为明显。花序的节间长度表现出比野生型的矮1/10(图5；左图表示野生型矮牵牛的节间，右图表示PetSPL3-转化的矮牵牛的节间)，其它变化是叶变圆，花适度变小等(图4)。

至于涉及控制花序节间伸长的基因，已报道了拟南芥的ERECTA基因(Torii等，1996，植物细胞，8：735)。然而，ERECTA基因与本发明的PetSPL2基因之间在核苷酸序列水平或氨基酸序列水平上都没有显著的同源性。已知一些涉及植物激素合成及其控制的基因(rolA，等)可缩短节间的长度，然而已知这些与植物激素相关的基因表现出多种作用并能控制节间的伸长(Dehio等，1993，植物分子生物学，23：1199)。

从上述结果看，被PetSPL2-转化的矮牵牛由于节间长度的缩短而变得更加矮化，以使花的外形与野生型的相比有显著改变。因此，可以理解导入PetSPL2基因是有用的，尤其是对于观赏花卉或节间长度趋于伸长的园艺型花卉更是有用。花外形的显著改变可赋予植物新的观赏价值。另外，对植物高度的抑制作用在使植物抗移动方面具有显著的园艺学价值，而且，其中导入了PetSPL基因的果树有望使其外形显得更加结实，这是有意义的，因为它使果实收获工作更加有效。

根据本发明，提供了编码能改变植物形态学等的转录因子的基因。通过利用本发明的基因，可产生具有经改变之特性的植物，所产生的植物在园艺学上是有用的，因为它所提供的特性在野生型和园艺型中未曾发现过或很少发现过。

对于本领域技术人员而言，在不背离本发明范围和精神的情况下，多种其它的修饰是显而易见的并易于做到。因此，本文所附权利要求书的范围不想局限于本文所示的说明书，相反权利要求书应被广义地解释。

                      序列表<110>农林水产省农业生物资源研究所长<120>通过导入矮牵牛属转录因子PetSPL2的基因以缩短花序节间的方法<130>J198412287<150>JP10-224852<151>1998-08-07<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>997<212>DNA<213>Petunia hybrida，var.Mitchell<220>1<220>CDS<222>(190)..(807)<400>CCCAGTGCCA TTTTTTCTCT CTAGTCAAGC TCTCTATATC ATCATCACTA TTCCCTTGGC  60TGCAGTAACA CTCCTATTTA ACCCTCACAA AAAAATTACC AGAGGGCAGC AAAAAATGCT 120TGAACATAAT TATTATACTT ACTATTAAGC TAGATTTCCT CTTGATCTTG CTAGGTTTGA 180CTGGAGAAA ATG GCA GGC ATG GAT AGA AAC AGT TTC AAC AGT AAG TAC TTC 231

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80                  85                  90TTG AGA CAA TCA CCA CCT AGA GAT ATT AAT AGG TAT TCT CTT CTA AAC   519Leu Arg Gln Ser Pro Pro Arg Asp Ile Asn Arg Tyr Ser Leu Leu Asn95                  100                 105                 110CTT AAT CTT GAA CCA AAC CCT AAC TTT TAC CCT AGT CAT AAC CCT AGT   567Leu Asn Leu Glu Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Pro Ser His Asn Pro Ser

            115                 120                 125TTT TCA AGA AAA TTC CCA CCT TTT GAA ATG AGG AAA TTA GGA AAA GGA   615Phe Ser Arg Lys Phe Pro Pro Phe Glu Met Arg Lys Leu Gly Lys Gly

        130                 135                 140GTT GTT CCA AAC AAT CAC TTG AAA AGT GCC AGA GGG CGT TTT GGA GTT   663Val Val Pro Asn Asn His Leu Lys Ser Ala Arg Gly Arg Phe Gly Val

    145                 150                 155GAG AAA ATT GAC TCT TTC ATG CAA GAA AAA GAA TGT ACT ACT ACA GTG   711Glu Lys Ile Asp Ser Phe Met Gln Glu Lys Glu Cys Thr Thr Thr Val

160                 165                 170ATC AAG AAG TCC GAG TTT CTA AGA TTG GAC TTG GGA ATT GGG TTG ATC   759Ile Lys Lys Ser Glu Phe Leu Arg Leu Asp Leu Gly Ile Gly Leu Ile175                 180                 185                 190AGT GAA TCA AAG GAA GAT TTA GAT CTT GAA CTT CGA CTG GGA TCC ACT   807Ser Glu Ser Lys Glu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ser Thr

            195                 200                 205TAACTATATC TAATTTTTAC GGCATTAAGG TTTGTAAATT GAGTCGACAG CTTAGTCAAA 867ACTACTTATG CACTTTAATA TGGCTTCTTG TGCTATATTT ATTTATTTTA CATGGCTGTA 927TCTAGGTTTG CATTTTAAGA TTTAGTACCT TGTCAGATTA AAAGAAAACG AAAGTTAAAT 987TAAAAAAAAA                                                        997<210>2<211>206<212>PRT<213>Petunia hybrida var. Mitchell<400>2Met Ala Gly Met Asp Arg Asn Ser Phe Asn Ser Lys Tyr Phe Lys Asn

            5                   10                15Lys Ser Ile Met Ala Arg Gln Met Glu Tyr Leu Asn Asn Asn Asn Gly

        20                  25                  30Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Asp Asn Tyr

    35                  40                  45Gly Asn Glu Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Trp Pro Pro Arg

50                  55                  60Ser Tyr Thr Cys Ser Phe Cys Lys Arg Glu Phe Arg Ser Ala Gln Ala65                  70                  75                  80Leu Gly Gly His Met Asn Val His Arg Arg Asp Arg Ala Ile Leu Arg

            85                  90                  95Gln Ser Pro Pro Arg Asp Ile Asn Arg Tyr Ser Leu Leu Asn Leu Asn

        100                 105                 110Leu Glu Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Pro Ser His Asn Pro Ser Phe Ser

    115                 120                 125Arg Lys Phe Pro Pro Phe Glu Met Arg Lys Leu Gly Lys Gly Val Val

130                 135                 140Pro Asn Asn His Leu Lys Ser Ala Arg Gly Arg Phe Gly Val Glu Lys145                 150                155                  160Ile Asp Ser Phe Met Gln Glu Lys Glu Cys Thr Thr Thr Val Ile Lys

            165                 170                 175Lys Ser Glu Phe Leu Arg Leu Asp Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ser Glu

        180                 185                 190Ser Lys Glu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ser Thr

    195                 200                 205<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>人工序列的描述：引物<223><220><221>修饰的碱基<222>(3)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(15)<223>i<400>3CARGCNYTNGGNGGNCAY                                        18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>Description of Artificial Sequence：primer<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(9)<223>i<400>4YTNGGNGGNCAYATGAAY                                        18<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<220><221>修饰的碱基<222>(3)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(6)<223>i<220><221>修饰的碱基<222>(12)<223>i<400>5ARNCKNARYTCNARRTC                                         17