抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷

摘要

本发明提供一种抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷，其DNA序列是：5’AGG TGC AGC TGC CTG GACAT3’。它能抑制细胞内bcl－2基因的表达，以阻止Bcl－2蛋白的合成，而Bcl－2的高表达与多种肿瘤发生和发展有关，从而排除了肿瘤细胞走凋亡途径的障碍，达到杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞发展，最终达到治疗人体恶性肿瘤的目的。对于治疗小细胞肺癌和前列腺瘤效果尤为显著。

说明书

本发明涉及一种生物技术治疗药物，特别是涉及一种抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷。

反义核苷(Antisense)是90年代诞生的一种新型生物技术治疗药物，该药物特异地、选择性地攻击引起疾病的基因其特定的碱基序列，从而阻断其活性和某种蛋白质的完成，最终达到治疗效果。反义核苷作为生物技术治疗药物已被公认，对于人体多种疾病，它的特异性和特效性在动物模型上已经得到证实。目前在国外多种反义核苷药物，包括治疗恶性肿瘤、爱滋病及其它病毒类疾病、炎症等均已进入人体临床试验阶段。肿瘤基因之一bcl-2的高表达与多种人体肿瘤，包括小细胞肺癌、非恶性淋巴癌、白血病、前列腺癌的发生和发展有关。Bcl-2蛋白的大量合成导致肿瘤细胞走凋亡(Apopolosis)的途径受抑制，利用序列特异性的反义核苷来抑制细胞内bcl-2基因的复制，以阻止Bcl-2蛋白的合成，排除肿瘤细胞走凋亡之路的障碍，达到杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤发展的目的。利用反义核苷技术的碱基序列特异性地抑制与疾病相关的蛋白质产生，已成为当今分子药物领域中的一个崭新产业。

本发明的目的在于提供一种尤其对小细胞肺癌细胞和前列腺癌细胞有最强抑制活性的抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷。

本发明抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷的DNA序列是：

5’AGG TGC AGC TGC CTG GAC AT3’。

本发明抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷的合成是采用修饰过的固相磷酸硫代合成方法(Phosphorothioate)，利用先进的核酸合成仪自动合成，其基本原理是，根据氰乙基磷酸胺化学合成程序，即把起始核苷的3’端通过连接链接到固相载体上，从此末端开始逐步接长寡核苷酸链，每接长一个核苷，则为一个反应循环。接长的寡核苷酸链一直固定在固相载体(DMP CPG)上。过量的反应物及副产物，通过乙腈洗涤除去。当寨核苷酸合成到所需长度后，它将被从固相载体上切除下来，然后再脱出保护基，分离纯化，最终得到所需产物。每个所接的核苷都需经过保护、脱保护、缩合、戴帽、氧化的循环过程。本发明为20碱基，需要经过20个循环才能完成。其合成反应通过磷酸酯和羟基的缩合而形成3’,5’-磷酸二酯链。对于反义核苷的合成，采用硫代替磷以保护其结构在生物体内不被核酸酶所降解。合成的反义核苷经反相高压液相层析(RHPLC)纯化，其纯化度可达98％以上，最终产品冷冻干燥后贮存于4～-20℃暗处。

本发明抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷是一种治疗效果特异的新型分子药物，与传统药物的特性相比，其优点在于1)本发明攻击的目标基因具有特异的mRNA序列。2)本发明与所攻击的目标基因是以Watson-Crick碱基配对结合，所以具有其特异性和亲和性。

下面结合附图详细说明本发明实施例制备及性质。

图1：本发明粗合成物的高压液相(HPLC)色谱图

图2：本发明粗合成物经反相高压液相(RHPLC)提纯后的谱图

图3：核酸杂交法鉴定本发明对肿瘤细胞A549bcl-2mRNA表达的影响谱图

图4：蛋白杂交法鉴定本发明对肿瘤细胞A549Bcl-2蛋白合成的影响谱图

图5：本发明对诱导细胞走凋亡途径的作用谱图

图6：本发明对小鼠体内肿瘤细胞生长的抑制作用曲线图

图7：本发明的浓度对小鼠体内肿瘤细胞生长作用结果图

本发明抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷合成工艺流程如下：

1、本发明由美国Applied Biosyslems公司出品的ABI392全自动DNA合成仪自动合成，合成条件严格按照该机的操作手册进行，所得粗产品，收集在4毫升的玻璃瓶内。

2、合成粗产品用真空离心方法(42℃)使氢氧化铵挥发，并用酒精萃取两次，乾燥后溶于10mM Tris-HCI·0.4mM EDTA(PH7.6)的缓冲液中。

3、使用FPLC离子交换层析柱，型号MonoOHR5/5PH12.5(从Pharmacia购买)进行提纯，去离子和盐。提纯前、后的分析监定如图1、图2所示。

4、提纯后的产品在冷冻干燥器内降温和去水，冷冻干燥，得反义核苷白色粉末，于4～-20℃储存。

其中：

合成原料：

         β氰乙基DNA磷酰胺(美国Applied Biosystems)

         腺苷(美国Synthegen)

         鸟苷(美国Synthegen)

         胸腺嘧啶苷(美国Synthegen)

         胞嘧啶苷(美国Synthegen)

         乙睛(美国Applied Biosystems)

         腺苷磷酰胺(美国APPlied Biosystems)

         四氮唑(美国Applied Biosystems)

         氢氧化铵(美国Applied Biosystems)

盖髓物试剂：

         醋酸酐/二甲基吡啶/四氢呒喃

氧化反应试剂：

         四乙基硫代硫化物/水/比啶/四水呒喃

脱三苯甲基作用试剂：

         三氯醋酸/二氯甲烷

1号瓶：(装有腺苷磷酰胺)乙睛流量1.7毫

         升/分，用于控制和校准磷酰胺和四唑的流速。

18号瓶：(装有乙睛)乙睛流量1.8毫升/分，用于控制和校准盖髓物试剂，

        四乙基硫代硫化物，三氯醋酸和乙睛流量。

合成柱：孔径1000唉玻璃柱，0.2微摩尔流量控制孔。

柱上合成步骤如下：

1、脱保护：核苷酸是一个多功能团的化合物，在合成中除了反应所需的基团需要发生反应外，其它基团都需要保护，否则会产生副产物。在固相合成第一步时，要脱去5’末端的DMT保护基，使5’末端的羟基暴露，以便进行下一步核苷的缩合反应。

2、缩合反应：当核苷脱保护后，5’末端的羟基与核苷的3’末端上的亚磷酰胺基团反应，脱去二异丙基胺。反应在供给体四氮唑的催化下，活化了磷酸酯键，使反就速度大大加快。

3、戴帽：在固相合成寡核苷酸时，载体上少部分5’末端核苷末起反应，使用乙酰氯试剂封闭，以减少核苷合成的错误。

4、氧化反应：为稳定3价磷的不稳定状态，氧化3价磷成为5价磷，使合成的磷酸二酯键不易因PH值的变化而断裂。

氧化反应后，固相合成完成了接长一个核苷的循环，需进一步加长所需合成的反义核苷，进行上述四个步骤的循环，直到合成所需的长度。然后把寡核苷酸从载体上切割下来，得反义核苷粗产品。

本发明抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷对bcl-2信息核酸和Bcl蛋白合成有明显的抑制作用。其中利用Norlhern blot核酸杂交法鉴定本发明对A549细胞mRNA表达的抑制作用。5×10⁶细胞经处理后用一步提取法提取总的RNA,(Trizol方法，购自Gibco公司)，每个样品取15ugRNA走电泳，然后转移到尼龙膜上(Hybom公司)，用³²P标记的bcl-2探针与RNA杂交，再用β-actin探针作为样品浓度鉴定的对照，经冲洗和放射显影后，结果如图3所示。利用WesternBlot蛋白杂交法来鉴定本发明对A549细胞的Bcl-2蛋白合成的影响。细胞经处理后培养48小时，然后提取可溶性蛋白，蛋白浓度用BioRad方法测定(购自BioRad公司)，每个样品取100ug走12％的SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDF膜上(Hybond公司)，用小鼠抗入Bcl-2单克隆抗体与蛋白膜杂交，再用酶标的兔抗鼠I9(Peoxidase)第二抗体与之杂交，最终用EGL方法测定(Amersham公司)，结果如图4所示。

本发明抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷对肿瘤的杀伤作用为诱导细胞走凋亡途径。利用免疫荧光法测定，对照无处理A549细胞与本发明处理过的细胞(1.5×10⁵)，经收获后用PBS洗涤两次，室温下用4％的中性福尔马林液处理10分钟，取50毫升细胞悬浮液滴在玻璃片上固定，用PBS冲洗两次后用细胞凋亡免疫荧光试剂盒“ApopTag”(购自Onecor公司)测试细胞凋亡的比例。分析结果表明，无处理的细胞所含凋亡数量大约在3～5％，而经本发明处理后的细胞，其凋亡比例高达70～80％。如图5所示。

本发明抑制人体恶性肿瘤生长的反义核苷具有抑制生物体内肿瘤生长的活性。利用A549引发的肿瘤(约20mg)植入去脚腺裸鼠表皮内，一周后开始观察和处理，此时肿瘤长到约0.1cm³小，无处理、本发明、其它对照DO1040和DO1050均每日点滴处理一次，剂量5mg/公斤/每天，每周测定一次肿瘤大小，肿瘤生长情况如图6所示；同时本发明对肿瘤的抑制作用是随浓度增加而增加。采用低浓度剂量25nM和高浓度剂量250nM分别点滴处理植入肿瘤的小鼠，对照采用生理盐水，6周后观察，对照组肿瘤大小为2cm³，低浓度剂量处理，肿瘤微小，约0.2³m，而高浓度剂量处理，无明显的肿瘤形成。其结果如图7所示。(注：DO1040的DNA序列是：5’GTC AGT CAG GCA CGT CTG AG3’,DO1050 DNA序列是：5’ATGTCC AGG GAG CTG CAC CT3’)。