通过提高外运载体的活性而进行微生物生产氨基酸的方法

摘要

本发明涉及一种微生物生产氨基酸的方法。本发明涉及相应氨基酸生产微生物的相应氨基酸特异性外运载体活性和/或相应氨基酸特异性外运基因表达活性提高。根据本发明,发现了一种负责一给定的氨基酸的外运,在此基础上首次建立一种微生物生产氨基酸的方法,涉及相应氨基酸生产微生物的相应氨基酸特异性外运载体活性和/或相应氨基酸特异性外运基因表达活性提高由这种方法引起的外运载体的活性和表达的提高提高了分泌速度,从而提高了所需氨基酸的转运。

说明书

本发明涉及根据权利要求1至20的细菌生产氨基酸的方法，根据权利要求21至26的外运基因(Ex-portgene)，根据权利要求27和28的调节基因，根据权利要求29和30的基因构建物，根据权利要求31至33的载体，根据权利要求34至40的转化细胞，41和42的膜蛋白，以及根据权利要求43至48的应用。

氨基酸具有巨大的经济价值，其中氨基酸的多种应用是：例如L-赖氨酸、以及L-苏氨酸，和L-色氨酸作为饲料添加剂的需要，L-谷氨酸盐作为调味品添加剂，L-异亮氨酸和L-酪氨酸在制药工业中，L-精氨酸和L-异亮氨酸作为药物，或L-谷氨酸盐和L-苯丙氨酸作为精细化学品的合成的起始材料的需要。

生产上述多种氨基酸的一种优选的方法是借助于微生物的生物技术生产；因为以此种方式直接生产具有生物活性和光学活性形式的氨基酸。而且可利用简单的和廉价的原材料。作为微生物可利用谷氨酸棒杆菌和其近亲flavam的各亚种，和乳发酵棒杆菌的各亚种(Lieblet al.，Int J Systen Bacteriol(1991)41：255-260)，以及大肠杆菌和其近亲细菌。

这些细菌以正常的但仅以生长所需的量生产氨基酸，因此没有过量的氨基酸形成和分泌。这是基于，在细胞中氨基酸的生物合成以多种方式调控。已知的多种可能的方法是，通过切断调控机制而提高产物之生成。在这种方法中例如通过加入氨基酸类似物以切断生物合成的有效调节。描述了一种方法，其中利用的棒杆菌菌株是L-酪氨酸和L-苯丙氨酸类似物抗性的(JP 19037/1976和39517/1978)。同样，还描述了一种方法，采用L-赖氨酸或L-苏氨酸类似物抗性菌株，以克服调节机制(EP 0 205 849 131，英国专利申请GB 2,152,509 A)。

另外还知道通过重组DNA技术构建的微生物，借助于克隆和表达编码不再是可反馈抑制的关键酶的基因同样地消除生物合成的调节。例如已知的一种带有质粒编码的，反馈抗性的天冬氨酸盐激酶的L-赖氨酸生产菌株重组子(EP 0 381 527)。同样还描述了一种带有反馈抗性Prephenat-脱氢酶的L-苯丙氨酸生产菌株重组体(JP124375/1986，EP 0 488 424)。此外还有通过过量表达编码氨基酸合成的非反馈敏感的酶的基因，来得到提高的氨基酸的产量。例如通过提高二氢2.6吡啶二羧酸合成酶而提高赖氨酸合成(EP 0 197 335)。同样地，还有通过提高苏氨酸脱氢酶的合成而得到提高的苏氨酸形成(EP 0436 886 A1)。

其他用以提高氨基酸产量的努力以提高中心新陈代谢的细胞初级代谢物的制备为目的。如此的有，通过重组技术得到转酮酶的过量表达，使L-色氨酸、L-酪氨酸，或L-苯丙氨酸的提高的产物生成成为可能。(EP 0 600 463 A2)。另外导致在棒杆菌中诱导磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的降低以改善芳香族氨基酸(EP 03331145)的形成。

这些用于提高产率的多种努力总体上说来其目标在于，克服氨基酸胞质合成的限制。而另一种限制则是在原则上考虑在细胞内形式的氨基酸输出至培养基中，所以产生这样一种个别的倾向，提高了氨基酸的输出因而提高了氨基酸生产的经济性。这样，通过生物素缺乏(Biotinmangel)去垢剂或青霉素处理棒杆菌，可改善细胞通透性。然而这种分泌方式(Ausschleusehilfe)只有在谷氨酸盐生产中是奏效的，而以此种方式不能提高其它氨基酸的合成。而且菌株的进展是：其分泌系统的活性由于化学或物理学突变而提高。因此，例如获得了一种谷氨酸棒杆菌菌株、它由于分泌活性的改善特别适用于L-赖氨酸的生产(DE 42 03 320)。

所有的迄今进行的用以提高细胞内生成的氨基酸的分泌试验的特点是，通过基于选择的无目的的或非特异的方法而偶然地提高氨基酸的流出。唯一例外的是在德国专利申请号195 23 279.8-41描述的方法。该方法使完全有目的的提高细胞内生成的氨基酸的分泌成为可能，在其中，用于氨基酸输入的编码基因的表达被提高。这种现有的方法是基于这一认识，用于氨基酸的输出的细胞输入蛋白，尽管事实上天然的微生物体没有过量氨基酸生成、亦无分泌，这一认识近于为这一假说打下基础：氨基酸转运特异性输出基因或输出蛋白质根本就不存在，然而，氨基酸通过其他运输系统分泌出来。

迄今已知的输出体系输出有毒的金属离子，毒性抗生素及高分子毒素。输出体系的构成相当复杂：一般说来是整合到细胞质膜上的膜蛋白，然而只起到输出部分反应作用，因而猜想就输出而言，还必需另外有胞质外的助蛋白。(Dinh，T.et al.，允许大分子跨葛兰氏阴性菌外膜输运的胞质外蛋白家族J.Bacteriol.1994，176：3825-3831)。另外还知道在胞外蛋白质的sec-依赖输出系统中，至少有6个不同的蛋白质组分是输出所必需的。本领域技术现状近乎为以下假说打下基础，即负责氨基酸外运的，迄今未知的系统由多个蛋白质组分构成，即多个基因负责氨基酸外运。在赖氨酸外运缺陷突变株中，对此的提示有多种，  参见Vrliic等人的描述(J.Bacteriol(1995)177：4021-4027)。

现在出乎意料地发现，只有一种唯一的，特异的基因负责氨基酸外运，因而本发明第一次提出用于微生物生产氨基酸的方法。在此方法中有目的地提高相应的氨基酸生产微生物外运基因的表达和/或外运载体的活性。由这种方法导致的、提高的外运载体的表达和活性带来了提高的分泌比率，因而相应的氨基酸外运提高了。这样经改变的微生物的在培养基中也积累相应的氨基酸的提高的份额。

为了提高外运载体的活性，要特别提高氨基酸生产微生物的内源基因活性。酶活性的提高可以例如下述途径达到：通过改变催化中心而提高底物转化或通过消除酶活抑制效应。另外可以通过提高酶的合成来提高酶活性，例如通过基因扩增或通过阻断引起酶生物合成阻遏(reprimieren)的因子。内源基因的外运载体活性优选地通过内源外运基因的突变而提高。这样的突变或者按传统的方法无目的地得到，例如UV照射或者致突变剂，或者是有目的地，借助于基因工程方法，如缺失，插入和/或核苷酸改变。

外源基因表达可以通过提高基因拷贝量和/或通过增加正向影响外运基因表达的调节因子而提高。调节因子的增强优选在转录水平上完成。特别是通过转录信号的提高。这样可以例如通过改变控制结构基因的启动子存到而提高启动子的效能。或者是在完整的启动子情形之下。更换更有效能的启动子。转录亦可以通过相应地影响列入外运基因的(zugeordneren)调节基因而加强，如下面所进一步实施的。然而，此外还可能增强翻译，例如提高mRNA的稳定性。

为提高其基因拷贝数，应该将外运基因构建到一个基因构建物如一个载体中，优选具有低拷贝数的载体。该基因构建物尤其含有外运基因相关的调节性基因序列、优选是增强基因表达的调节序列。特别指明的调节性序列是编码表1所示氨基酸序列或其等位变异的核苷酸序列，如表2中从954至82位核苷酸的核酸序列的调节序列或其基本上等功能的DNA序列。等位变异即等功能DNA-序列特别包含功能性衍生物，由相应序列通过一个或多个核苷酸缺失、插入和/或替换而获得，然而其仍保持调节蛋白活性或功能甚至于更高：通过调节性基因序列的突变来影响调节蛋白与DNA的结合的效力，其中DNA是调节蛋白所调节的外运基因的DNA，因而转译增强，基因表达提高。另外作为调节性序列，还可能将所谓“增强子”列入外运基因，增强子是在必要时，提高RNA-聚合酶和DNA之间的相互作用而提高外运基因表达。

为将外运基因构建到基因构建物中，该外运基因优选地从棒杆菌属微生物菌株中分离，用含有该外运基因的基因构建物转化相应的氨基酸生产微生物菌株，优选棒状杆菌。相应的转化基因的分离和转化按常规方法完成：当转运基因(die Transporgen)是从棒杆菌中分离和克隆时，例如外运缺陷突变体同源互补的方法是适用的(J.Bacteriol(1995)177：4021-4027)。在不能够直接克隆结构基因的情形下，首先将载体序列插入到转运基因中，以使随后经“质粒获救”分离无活性形式的片段。本发明相关的方法特别适合于来自谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032或谷氨酸棒状杆菌黄色变种ATCC 14067或谷氨酸棒状杆菌乳酸发酵变种ATCC 13869。分离该基因并以已知载体体外重组以后(App/Env Microbiol(1989)55：684-688；Gene 102(1991)93-98)，通过电穿孔(Liebl et al(1989)FENS Microbiol letl 65：299-309)或接合(Schafer et al(1990)J Bacteriol 172：1663-1666)而完成其在氨基酸生产菌株中的转化。为进行这种转染(die Ubertragung)优选采用低拷贝数的载体。而宿主细胞则优选采用这种氨基酸生产菌，在其相应的氨基酸合成中脱调节(deregulieren)和/或含有提高的中心新陈代谢中的组分。

分离之后，可获得具有这样的核苷酸序列的外运基因：其编码表3所示氨基酸序列或其等位变异(die Allelvariation)，即具有表2的1016至1725位核苷酸的核酸序列，或其基本上等功能的DNA序列。在此还包括上文所定义的调节性序列的等位变异及等功能DNA序列特别是功能性衍生物。外运基因优选地用于本发明的方法中。

具有或不具有相连结的启动子或者列入或不列入调节基因的外运基因可以连结在一个或多个DNA-序列之前或之后，因而该基因可以被包含在基因构建物之中。

通过外运基因克隆可获得这样的质粒或载体：其含有外运基因而且-如上文所述-适合于氨基酸生产菌的转化。通过转化而获得的细胞，优选涉及谷氨酸棒杆菌的转化细胞，含有以可复制形式的基因-即染色体上的附加的拷贝，该基因拷贝通过同源重组而整合到基因组的任意座位上和/或在质粒或载体上存在。

已知多种序列，其编码功能未知的膜蛋白。通过本发明相关的外运基因的制备，例如具有表2中1016至1725位核苷酸的核酸序列的外运基因、及相应的外运蛋白，即例如表1所示氨基酸序列的外运蛋白，可以通过序列对仗(das Seqenzverglich)鉴定其功能为转运氨基酸的膜蛋白。如此鉴定的外运基因可以随后按本发明相关的方法用于提高氨基酸生产。

由现有技术知道膜蛋白通常有12个，部分有4个跨膜螺旋。现在惊奇地发现、负责或适合于氨基酸外运的膜蛋白具有6个跨膜螺旋(见表3所示的外运蛋白的氨基酸序列，其中的6个跨膜区用下划线标出)。因而在此关系到一种迄今未被描述，因而是一种新的膜蛋白。实施例a)从谷氨酸棒杆菌中克隆外运基因和调节子

如Scharzer等人所述(FEMS Microbiol Letl(1989)65：299-304)从谷氨酸棒状菌R127中分离染色体DNA。将其用限制酶Saa 3A酶切，并如Sambroo等人(分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社)所述通过蔗糖梯度离心拆分。将个别级分电泳，以分析其大小，将大约6-10kb片段大小的片段用于与载体PJC₁连接。为此将载体pJC₁用BamHI线性化和脱磷酸化。以此种5ng载体与20ng染色体6-10kb片段连接。将全部连接混合物通过电穿孔(FEMS MicrobiolLetl(1989)65：299-304)转化外运缺陷型突变株NA8(JBacteriol(1995)177：4021-4027)。转化子将在含15μg卡纳霉素/ml的LBHIS(FEMS  Microbiol Lett(1989)65：299-304)上筛选。将这些转化子进行大规模质粒分析获得的总共4500个克隆中有200个先行筛选。确实其质粒的有无和大小。平均约有一半研究的卡那霉素抗性克隆带有平均大小为8kb的插入片段的重组质粒。因此在建立的基因文库中，来自谷氨酸棒杆菌的任一X基因的出现的几率是0.96。将4500个获得的转化子的每一个就其赖氨酸分泌的重新获得进行研究。就此采用Vrliic描述系统用于在谷氨酸棒状菌中诱导L-赖氨酸外泌(JBacteriol(1995)177：4021-4027)。为此制备所谓的基本培养基指示平板，每升含有20g(NH₄)₂SO₄，5g尿素，1g KH₂PO₄，1g K₂HPO₄，0.25g MgSO₄·7H₂O，42g吗啉代丙磺酸，1ml CaCl₂(1g 1100ml)，750ml蒸馏水，1ml cg Spurensalze，1ml生物素(20mg/100l)，pH7，4％葡萄糖，1.8mg原儿茶酸(Prototechusaure)，1mg FeSO₄·7H₂O，1mg MnSO₄·H₂O，0.1mg ZnSO₄·7H₂O，0.02mg CaSO₄，0.002mgNiCl₂·6H₂O，20g琼脂，及10⁷细胞1ml赖氨酸营养缺陷型谷氨酸棒杆菌突变株49/3借助于牙签将所有起始4500个转化子点到指示平板上，用起始的不外泌的NA8(J  Bacteriol(1995)177：4021-4027)和起始菌株R127。平行接种2个平板其中只有一个含有追加的5mm  L-甲硫氨酸，以诱导赖氨酸外泌。指示平板在30℃温孵，在15、24和48小时观察。总共获得29个在加入甲硫氨酸培养基上，通过指示菌株49/^*-+/3显示了生长场所(Wachstumshof)的克隆。这些克隆将个别的，办是再次的如上文所述证实生长场所的再次获得，用此方法得到了两个克隆NA8 pMV8-5-24和NA8 pMV6-3，其具有重新获得的赖氨酸分泌的能力。

如Schwarzer等人所述(Biol Technology(1990)9：84：87)从这些克隆中进行质粒制备。通过重新转化到NA8中，证实了L-赖氨酸流出的质粒相关效应，这两个质粒将经受限制性分析。质粒pMV8-5-24带有8.3kb的插入片段，pMV6-3带有9.5kb的插入片段。插入片段的物理图谱见图1所示。b)DNA-片段的亚克隆，该片段重构了赖氨酸外运

从质粒pMV6-3的插入片段利用确定的限制性酶切位点产生一个亚克隆。因此将3.7kb Xho I-SalI-片段，2.3kb  BamHI片段和7.2kb BamHI片段与相应酶切和处理的pJC₁载体(Mol GenGenet(1990)220：478-480)连接。用连接产物直接转化谷氨酸棒杆菌，如上述方法就赖氨酸外泌的重新获得检测转化子，通过质粒制备和限制性分析验证该亚克隆的存在。借助于此种方法，获得具有质粒pMV2-3较小亚克隆的菌株(各1)，这些菌株含有作为来自pMV6-3的2.3kb BamHI片段的将赖氨酸外运介导其中的片段。c)赖氨酸外运基因Lys E和其调节子Lys G的序列测定

按Sanger等人的双脱氧链中止法进行2.3kb BamHI片段的核苷酸测序(Proc Natl Acad Sci USA(1977)74：5463-5467)，用Pharmacia自动读序测序试剂盒进行测序反应(Uppsala，Sweden)。用Pharmacia-LKB(Piscataway，NJ.USA)的自动激光-荧光DNA测序仪(A.I.F)进行电泳分析。获得的核苷酸序列用德国癌症研究中心(Heidelberg)的HUSAR(Release 3.0)软件包进行分析。核苷酸序列及分析的结果在表2中复述。该分析结果给出了该测序的DNA片段的两个全长的开放的读码框架(ORF)。ORF₁编码长度为236个氨基酸的一个蛋白质，ORF₂编码长度为290个氨基酸的蛋白质。从ORF₁推导出的蛋白质显示出有大量的疏水氨基酸，这正是膜结合蛋白的特征。表3中给出了用PHD·HTM软件程序(Protein Sciena(1995)4：521-533)详细分析的亲水和疏水氨基酸的分配。由此得出结论，该蛋白质含有穿越膜的6个疏水螺旋区(das Helixbereich)。该蛋白质涉及所研究的氨基酸L-赖氨酸的外运。相应的基因在以下称为lys E。相应地在表2中标出。ORF₂以与ORF₁相反的方向转录。序列分析表明，ORF₂与构成了一个家族的调节基因有高度的同一性(Aun RevMicrobiol(1993)597-626)。该家庭的基因调节多种以正调节方式参与合成代谢与分解代谢过程的基因的表达。下文中将ORF2称为lysG(Govern＝Regulieren)。由于翻译(die Zuoranang)，以及因为lys EZ只能与lys G一起克隆(见a)和亚克隆(见b)，lys G是lys E的调节子，同样参与赖氨酸外运。lys G及其推导的氨基酸序列在表2及表1中给出。d)通过序列对仗鉴定一个来自大肠杆菌的未知膜蛋白

借助于表3的建立的序列，对现有的序列文库进行搜寻，以对于从序列区域推导的蛋白质进行功能划分。相应地将来自谷氨酸棒杆菌的赖氨酸外运的氨基酸序列，借助于德国癌症研究中心(Heidelberg)的HUSAR软件包(Release 3.0)，与所有其中贮存的DNA序列推导出的蛋白质-序列进行对仗。来自于大肠杆菌的一个迄今未知功能的序列显示了39.3％同一的氨基酸，和64.9％类似的氨基酸的高度同源性。对仗在图2中给出。这个来自大肠杆菌的迄今未被表征的开放读码框架用此种方法被鉴定为氨基酸外运基因。e)提高细胞内积累的L赖氨酸的外运

用质粒pMV2-3转化菌株谷氨酸棒杆菌NA8(JBacteriol(1995)177：4021-4027)并比较菌株的L-赖氨酸的外泌。因而将NA8和NA8 pMV2-3先培养在如Vrljic等人(JBacteriol(1995)177：4021-4027)描述的复合培养基，然后分别接种发酵培养基CGXII(J Bacteriol(1993)175：5595-5603)。该培养基含有补加的5mM  L-甲硫氨酸，以诱导细胞内L-赖氨酸合成。于30℃140Upm将床培养24小时后，对胞内和胞外的L-赖氨酸进行测定。为了胞内测定进行硅油离心(die Silikonolzentrifagation)(MethodsEnzymology LV(1979)547-567)；用高压液相色谱进行氨基酸测定(JChromat(1983)266：471-482)。如图3所示，该测定在不同时间点进行。根据所利用的方法，积聚的细胞内的L-赖氨酸通过pMV-2的增殖分泌和积累。据期细胞内现有的L-赖氨酸被强烈地减低。因而提出了一种利用己发现和描述的外运基因的方法，对L-赖氨酸形成进行关键性的改进。f.通过LysE或LysEG提高L-赖氨酸的积累

含有pJC₁中的定序为2374bP BamHI片段的亚克隆pMV2-3与相应的，pZ₁中载有lysE的1173bp PvuII-HindII片段的序列信息CApp(Env Microbiol(1989)55：684-688)连接，因而获得质粒plysE。该质粒，以及载有LysE LysG的质粒pMV2-3通过电穿孔导入谷氨酸棒杆菌菌株d，该菌株的染色体区域是缺失的。获得的菌株谷氨酸棒杆菌d pMV2-3。谷氨酸棒杆菌d plysE，谷氨酸棒杆菌pJC₁将如e)中所述首先在复合培养基上生长，然后在补加了4％葡萄糖和5mM的L-甲硫氨酸的生产基本培养基CGXII中培养，且取样以测定积累的L-赖氨酸。如图4所示，通过LysE LysG与对照相比较，赖氨酸的积累提高了。通过这种方法，plysE达到非常高的，4.8至13.2mML赖氨酸的积累。图表说明：表1：来自谷氨酸棒杆菌的赖氨酸外运-调节子的氨基酸序列，具有DNA-结合蛋白的典型的螺旋-转折-螺旋基序。表2：(3页)：谷氨酸棒杆菌的赖氨酸外运和赖氨酸外运-调节子编码区核苷酸序列。表3；谷氨酸棒杆菌的赖氨酸外运的氨基酸序列，具有鉴定的跨膜螺旋TMH1至TMH6。图1：在pMV6-3和pMV8-5-24中的通过克隆获得的DNA片段，其起到赖氨酸分泌的作用，以及从pMV6-3制备的亚克隆pMV-2-3，其亦起赖氨酸外泌作用并测序。B.BamHI：Sm，SmaI；SC，Sac I；Sl.Sal I；H，HindII；X，XhaI。图2.来自谷氨酸棒杆菌的LysE的推导的氨基酸序列(上)，与来自大肠杆菌的迄今功能未知的基因产物(下)的对仗，后者借此被鉴定为外运蛋白。图3.通过pMV 2-3而对于谷氨酸棒杆菌NA8的赖氨酸外运的提高。上，对照具有较小的赖氨酸外泌和大约是150mM的胞内积累。下，通过pMV2-3的作用，而有较高的外泌，和胞内较低的大约30mM的积累。图4：谷氨酸棒杆菌中，通过lysE lysG(pMV2-3)造成的赖氨酸积累的提高(中间曲线)、及LysE(plysE)造成的积累(上面曲线)。1   MNPIQLDTLL SIIDEGSFEG ASLALSISPS AVSQRVKALE HHVGRVLVSR

                      螺旋-转折-螺旋-基序51  TQPAKATEAG EVLVQAARKM VLLQAETKAO LSGRLAEIPL TIAINADSLS101 TWFPPVFNEV ASWGGATLTL RLEDEAHTLS LLRRGDVLGA VTREANPVAG151 CEVVELGTMR HLAIATPSLR DAYMVDGKLD WAAMPVLRFG PKDVLQDRDL201 DGRVDGPVGR RRVSIVPSAE GFGEAIRRGL GWGLLPETQA APMLKAGEVI251 LLDEIPIDTP MYWQRWRLES RSLARLTDAV VDAAIEGLRP表1

     .         .         .         .         .         .    60GGTAAACGACTTCCACAATGAGACGGACCGGGTTAAGGACGCCCGCTTCTTCACTTTTTG

     .         .         .         .         .         .    120

                     LysGGGACTTGGAAAAGTCTTCATTGATTCCGGCGTTAGGGAGCTAACGACGTAGTTGCTGCCG

                   -  P  R  L  G  E  I  A  A  D  V  V  A

     .         .         .         .         .         .    180CAGACACTCAGATCGATCTCTAGATCTAAGGTCCGCGGTAGCAACGGTTATGTAGCCACAD  T  L  R  A  L  S  R  S  E  L  R  W  R  Q  W  Y  M  P  T

     .         .         .         .         .         .    240CAGTTACCCATAGAGTAGCTCCTCCTAGTGAAGAGGACGAAAATCGTACCCTCGTCGAACD  I  P  I  E  D  L  L  I  V  E  G  A  K  L  M  P  A  A  Q

     .         .         .         .         .         .    300CCAAAGCCCTTCTTCAGGGGTTGGTTCCGGAGCCGCTTAACGGAGTGGTTTTGGAAGGCGT  E  P  L  L  G  W  G  L  G  R  R  I  A  E  G  F  G  E  A

     .         .         .         .         .         .    360GCTGCCCTGTTACCTATGCGCGGACGCGGGGTGTCCTGGTAGCTGCGCGGGCAGGTCCAGS  P  V  I  S  V  R  R  R  G  V  P  G  D  V  R  G  D  L  D

     .         .         .         .         .         .    420TGCCAGAACTTCGTGTAGAAACCCTGGCTTCGCATTCTGCCCGTAGCGTCGGGTTAGATCR  D  Q  L  V  D  K  P  G  F  R  L  V  P  M  A  A  W  D  L

     .         .         .         .         .         .    480AAAGGGTAGTTGGTACATCCGTAGGGCGTTACTCCCCCAACGTTACCGGTTCACCGCGTAK  G  D  V  M  Y  A  D  R  L  S  P  T  A  I  A  L  H  R  M

     .         .         .         .         .         .    540CCAAGGTTCAAGATGATGAAGTGTAGGGCGGTGCCCTAATCGAAGTGCCCAATGGCGAGGT  G  L  E  V  V  E  C  G  A  V  P  N  A  E  R  T  V  A  G

     .         .         .         .         .         .    600ATTTTGTAGAGGTGCGGCGTCGTTCCTATTACACACGCGAAGTAGAAGGTTCGCGTCGCAL  V  D  G  R  R  L  L  S  L  T  H  A  E  D  E  L  R  L  T

     .         .         .         .         .         .    660CTCGCAACGAGGTGGGGTTCTTCGATGGAGCAACTTGTGCCCTCCTTTGGTACACCTATCL  T  A  G  G  W  S  A  V  E  N  F  V  P  P  F  W  T  S  L

     .         .         .         .         .         .    720GCTTAGACGCAACTACCGCTACCAATTGCCCTAAAGTCGTTCCGCAGGTCTATCAACGCGS  D  A  N  I  A  I  T  L  P  I  E  A  L  R  G  S  L  Q  A

     .         .         .         .         .         .    780AAATCAAAGACGAACGTCGTTGTGGTAAAAGGCGCGACGAACGTGTTCCTGAAGTGGGCGK  T  E  A  Q  L  L  V  M  K  R  A  A  Q  V  L  V  E  G  A

     .         .         .         .         .         .    840AAGCCAACGAAACCGGCCAACCCACGCGCTATGGTTGTGAGCTGGGTGCACTACGAGCTCE  T  A  K  A  P  Q  T  R  S  V  L  V  R  G  V  H  H  E  L

     .         .         .         .         .         .    900TCGAAATTGCGCGACTGAGTGGCGGCTCCCCCTTTACCTTTCCCGATTCCTCCGCGGAAGA  K  V  R  Q  S  V  A  S  P  S  I  S  L  A  L  S  A  G  E表2

                                                            960

                                          <---LysGCTTCGACGGAAGTAGTTACTAACTCTCGTTTCACAGGTCAACTTACCCCAAGTA-----5′5′---TGCCTTCATCAATGATTGAGAGCAAAGTGTCCAGTTGAATGGGGTTCATGAAGCTF  S  G  E  D  I  I  S  L  L  T  D  L  Q  I  P  N  M

     .         .         .         .                        1020ATATTAAACCATGTTAAGAACCAATCATTTTACTTAAGTACTTCCATAGGTCACGATGGT

                                                   M  V

                                                  LysE--->

     .         .         .         .         .         .    1080GATCATGGAAATCTTCATTACAGGTCTGCTTTTGGGGGCCAGTCTTTTACTGTCCATCGGI  M  E  I  F  I  T  G  L  L  L  G  A  S  L  L  L  S  I  G

     .         .         .         .         .         .    1140ACCGCAGAATGTACTGGTGATTAAACAAGGAATTAAGCGCGAAGGACTCATTGCGGTTCTP  Q  N  V  L  V  I  K  Q  G  I  K  R  E  G  L  I  A  V  L

     .         .         .         .         .         .    1200TCTCGTGTGTTTAATTTCTGACGTCTTTTTGTTCATCGCCGGCACCTTGGGCGTTGATCTL  V  C  L  I  S  D  V  F  L  F  I  A  G  T  L  G  V  D  L

     .         .         .         .         .         .    1260TTTGTCCAATGCCGCGCCGATCGTGCTCGATATTATGCGCTGGGGTGGCATCGCTTACCTL  S  N  A  A  P  I  V  L  D  I  M  R  W  G  G  I  A  Y  L

     .         .         .         .         .         .    1320GTTATGGTTTGCCGTCATGGCAGCGAAAGACGCCATGACAAACAAGGTGGAAGCGCCACAL  W  F  A  V  M  A  A  K  D  A  M  T  N  K  V  E  A  P  Q

     .         .         .         .         .         .    1380GATCATTGAAGAAACAGAACCAACCGTGCCCGATGACACGCCTTTGGGCGGTTCGGCGGTI  I  E  E  T  E  P  T  V  P  D  D  T  P  L  G  G  S  A  V

     .         .         .         .         .         .    1440GGCCACTGACACGCGCAACCGGGTGCGGGTGGAGGTGAGCGTCGATAAGCAGCGGGTTTGA  T  D  T  R  N  R  V  R  V  E  V  S  V  D  K  Q  R  V  W

     .         .         .         .         .         .    1500GGTAAAGCCCATGTTGATGGCAATCGTGCTGACCTGGTTGAACCCGAATGCGTATTTGGAV  K  P  M  L  M  A  I  V  L  T  W  L  N  P  N  A  Y  L  D

     .         .         .         .         .         .    1560CGCGTTTGTGTTTATCGGCGGCGTCGGCGCGCAATACGGCGACACCGGACGGTGGATTTTA  F  V  F  I  G  G  V  G  A  Q  Y  G  D  T  G  R  W  I  F

     .         .         .         .         .         .    1620CGCCGCTGGCGCGTTCGCGGCAAGCCTGATCTGGTTCCCGCTGGTGGGTTTCGGCGCAGCA  A  G  A  F  A  A  S  L  I  W  F  P  L  V  G  F  G  A  A

     .         .         .         .         .         .    1680AGCATTGTCACGCCCGCTGTCCAGCCCCAAGGTGTGGCGCTGGATCAACGTCGTCGTGGCA  L  S  R  P  L  S  S  P  K  V  W  R  W  I  N  V  V  V  A表2(续)

     .         .         .         .         .         .    1740orf3

                                         -  N  E  R  T  K5′    CTACTGGCGTAACCGGTAGTTTGACTACAACTACCCAATCAAAAGCGCCCAAAAAGTTGTGATGACCGCATTGGCCATCAAACTGATGTTGATGGGTTAGTTTTCGCGGG    5′V  V  M  T  A  L  A  I  K  L  M  L  M  G  -

                                  LysE

     .         .         .         .         .         .    1800CCTTAGCCACCGGAAGCGGGTTTACAACTACGGCCGCAGCACCCTTTAGAGTAGCTAGCGS  D  T  A  K  A  W  I  N  I  G  A  D  H  S  I  E  D  I  A

     .         .         .         .         .         .    1860GAGGTTGAGCCGCAGTCTTTTGAGGTTCAACAACTCACTTAGTTCCGACAACAGGTCGACE  L  E  A  D  S  F  E  L  N  N  L  S  D  L  S  N  D  L  Q

     .         .         .         .         .         .    1920GAGTTGACTGCTTCGTGGTTAGTTACGTGACCAGTGCCATAGGCGCGGCATGAGAGGAACE  V  S  S  A  G  I  L  A  S  T  V  T  D  A  G  Y  E  G  Q

     .         .         .         .         .         .    1980GAGCGCGTCGTGGGTACGTTCGCGGTAGACGCGTTCACTGACGGGCGCAAGGACCCGCTAE  R  L  V  W  A  L  A  M  Q  A  L  S  Q  G  R  E  Q  A  I

     .         .         .         .         .         .    2040CAGTAACTCGAACGCCTGGTATAGTTATAACAAGTGCAAGTTGTACGGGAGTCTGTCCCTD  N  L  K  R  V  M  D  I  N  N  V  N  L  M  G  E  S  L  S

     .         .         .         .         .         .    2100GAATGGGACCGACCGCGCCCTTGGGAGACCTTAAGGTAGCTCTATAAACAGGCACTCGTCK  G  Q  S  A  R  S  G  E  P  I  G  D  L  Y  K  D  T  L  L

     .         .         .         .         .         .    2160CGGGACGCGTTCACCACTCTTTCGTTACTGCGGTTCTGGTAACAACCGTCGACTGACGTTG  Q  A  L  P  S  F  A  I  V  G  L  G  N  N  A  A  S  Q  L

     .         .         .         .         .         .    2220GTTCAAGAGTGGCAGTAGCGGGCCAAGGAGGTGGGTTGCTAATTACTACCTTATCGAACCL  N  E  G  D  D  G  P  E  E  V  W  R  N  I  I  S  Y  S  P

     .         .         .         .         .         .    2280GACTACTTAGTCTTCGCCCGTCGGGAGGAGGCGGTACTTGAGTCGGCGGAGGCGACACTCQ  H  I  L  L  P  C  G  E  E  A  M  F  E  A  A  E  A  T  L

     .         .         .         .         .         .    2340GAGACCTGGCATCCTTCTTTATGGGTGCATTTCTCGGAAAGGTCTGCGTTGTTACAGTGCE  P  G  Y  S  S  I  G  V  Y  L  A  K  G  S  A  V  I  D  R

     .         .         .         .         .         .    2374

                               <-orf3GTTACGCATGTACCAAAGAAGGTTTCCTCATAGAL  A  Y  M  T  E  E  L  P  T  D表2(续)1   MVIMEIFITG LLLGASLLLS IGPQNVLVIK QGIKREGLIA VLLVCLISDV

            TMH1                                TMH251  FLFIAGTLGV DLLSNAAPIV LDIMRWGGIA YLLMFAVMAA KDAMTNKVEA

                              TMH3101 PQIIEETEPT VPDDTPLGGS AVATDTRMRV RVEVSVDKOR VWVKPMLMAI151 VLTWLNPNAY LDAFVFIGGV GAQYGDTGRW IFAAGAFAAS LIWFPLVGFG

      TMH4                                  TMH5201 AAALSRPLSS PKVWRWINVV VAVVMTALAI KLMLMG

                  TMH6表3