无保护剂双重病毒灭活制备静注免疫球蛋白工艺

摘要

本发明涉及生物制品的制备方法。本工艺中不加任何保护剂,采用巴氏灭活与低pH孵放处理相结合的双重病毒灭活方法,不但能有效杀灭病毒,保持免疫球蛋白分子的完整性和天然生物活性以及制品的纯洁性和安全性,在工艺中选择了制备免疫球蛋白液体剂型而不是冻干制剂,有利于大规模生产,其产品质量稳定而可靠。在本制品中加入5%葡萄糖以维持其溶液的等渗度,避免了一些患者在使用中出现的不良反应。

说明书

本发明涉及生物制品的制备方法。特别是无保护剂双重病毒灭活制备静脉注射用人血免疫球蛋白。

免疫球蛋白的生产开始于1949年。静脉注射用免疫球蛋白(IVIG)自六十年代问世至今，已陆续有12个国家的29个生产厂家的30多种IVIG制品出现在国际市场。我国1985年首次有入胎盘血IVIG问世，其制造与检定规程已载入《中国生物制品规程》，1992年国家卫生部批准了冻干低pH静脉注射用人血免疫球蛋白的试生产。由于静脉注射用免疫球蛋白注射量大且常需反复多次注射，而引起丙型肝炎流行的事例已有不少报道，越来越多的证据证明，如果生产过程中没有病毒灭活步骤，其安全性是难以保证的。故从九十年代起，“病毒灭活”已作为IVIG生产工艺中必不可少的步骤被世界各国所规定。目前的病毒灭活方法有巴氏灭活法，即60℃10小时加热灭活法，并在加热过程中加入保护剂。由于艾滋病(AIDS)的快速传播，针对人免疫缺陷病毒(HIV)又发展了用去污剂破坏病毒脂质性包膜的方法。相继发展的还有低pH孵放法、干热法、照射法和过滤法。以上这些病毒灭活方法虽然可以对包括HIV、人乙型肝炎病毒(HBV)、人丙型肝炎病毒(HCV)和一些常见病毒致病因子进行灭活，但不同的方法对不同的病毒的灭活能力也有一定的差异，尤其是有保护剂存在时，对病毒也有一定保护作用，制品中就可能残存微量病毒，去污剂灭活法又存在有机溶剂残留的问题，不但影响制品的纯洁性，患者在使用中还可能出现一些不良反应。目前国内外生产的IVIG制品大都以蔗糖为保护及赋型剂的冻干制剂，在近年据文献报道，保护剂的存在尽管对蛋白质的天然活性起一定的作用，但也会对病毒产生一定的保护作用，同时报道了数例因使用以蔗糖作为保护剂，所致急性肾功能衰竭的病例。另有不少文献指出，冻干IVIG的临床副作用明显大于液体制品，因为在冻干过程中部分IVIG分子发生聚合，加之冻干制剂不利于大规模生产。

本发明的目的正是为了克服上述现有技术中的不足之处而提供一种无保护剂双重病毒灭活制备静注免疫球蛋白的工艺，即采用两种不同机理的病毒灭活方法，在无保护剂条件下，以达到对病毒的完全灭活作用，使静注免疫球蛋白更安全有效地应用于临床。

本发明的制备工艺如下：第一步巴氏灭活：以Cohn’s组分II(FII)为原料用2～10倍的冰蒸馏水溶解，调节pH3.5～5.0，用0.2～2.0mmol/L醋酸，分子量10～100kDa(道尔顿)超滤膜超滤脱醇、脱盐至电阻率≥5kΩ·cm(NaCl＜2mmol/L)，调节免疫球蛋白浓度＜2％，装瓶，充CO₂使内压＞700Pa，在无任何保护剂条件下封口。60±1℃，10小时灭活。第二步低pH孵放处理：经巴氏灭活的FII溶液用10～100kDa超滤膜切割精制，如果免疫球蛋白纯度仍＜97％时，可用DEAE-Sephadx A-50凝胶吸附提高纯度，然后浓缩至免疫球蛋白浓度≥5％，调pH4.1±0.3，除菌过滤，室温放置21天，加入5％葡萄糖调节渗透压，除菌后进行半成品理化检查和生物学试验。半成品检测合格后，除菌过滤，分装25ml/瓶或50ml/瓶，按静脉注射用人血免疫球蛋白规程进行全面质量检查。

为有效地保证静注免疫球蛋白的质量及其安全性，对按上述方法生产的静注免疫球蛋白进行了检测(由华西医科大学进行检测)，采用的指示病毒为水疱性口炎病毒(VSV)，脊髓灰质炎病毒(Polio-I)，乙型脑炎病毒(Sindbis)三种，灭活病毒的方法采用了巴氏灭活法、低pH灭活法以及双重病毒灭活法(本发明)，其结果见表1、表2、表3。

1.巴氏灭活法

表1 60℃加热对三种病毒的灭活效果灭活             VSV                  Polio-I            Sindbis时间       Log TCID₅₀/0.1ml     Log TCID₆₀/0.1ml      Log PFI/ml(小时)   对照样品  处理样品    对照样品   处理样品    对照样品  处理样品0           6                   6.5                   4×10⁵1           6         4         6.5          2        4×10⁶     10⁴4           6         3         6.3          -        4×10⁶     ＜10⁴5           5.8       2         6.3          -        4×10⁶     ＜10³7           5.8       1         6.3          -        4×10⁶     ＜10²10          5.8       -         6            -        4×10⁶     -

从表1中可见，巴氏灭活法对Polio-I病毒灭活效果相当显著，对VSV的灭活效果次之，对Sindbis的作用较差。

2.低pH灭活法

          表2 pH4.0，23℃放置对两种病毒的灭活效果时间    VSV(Log.TCID₅₀/0.1ml)   Sindbis(Log PFU/ml)(天)    对照样品     处理样品     对照样品    处理样品0          6.5                     4×10⁶3          6.5           1         4×10⁶     ＜10⁴7          8             -         3.5×10⁶   ＜10³14         6             -         3.5×10⁶   ＜10²21         5.5           -         3.5×10⁴   -

从表2中可见，VSV对pH4.0的酸环境非常敏感容易被灭活，从处理后第7天，病毒已无活性。而Sindbis病毒对pH4.0的敏感性善差，在自处理后的第21天，其病毒才被完全灭活。

3.双重病毒灭活法

表3双重病毒灭活法(本发明)对三种病毒的灭活效果

 灭活        VSV                   Polio-I               Sindbis

 时间    Log TCID₆₀/0.1ml      Log TCID₅₀/0.1ml       LogPFI/ml

(小时)  对照样品  处理样品     对照样品  处理样品    对照样品  处理样品60℃   0        6                     6.5                 4×10⁶

   5        6         2           6.5       -         4×10⁶    10³加热   10       6         -           6.5       -         4×10⁶    -pH4.0  7天      5.5       -           6         -         3.5×10⁶  -23℃   14天     5.5       -           6         -         3.5X10⁶   -放置   21天     5         -           5.5       -         3.5X10⁶   -

从表3中可见，巴氏灭活法10小时，三种指示病毒已被全部灭活，继续进行低pH灭活可使制品的安全性更佳。

将本发明所制备的产品送中国药品生物制品检定所和中国人民解放军艾滋病检测确认实验室检测，其结果见表4、表5。

1．巴氏灭活法

            表4  60℃加热对四种病毒的灭活效果

      VSV              Polio-I           HIV           Sindbis时间 Log TCID₅₀/0.1mlLog TCID₆₀/0.1mlLog TClD₅₀/0.1mlLog TCID₅₀/ml(小时) 对照    处理    对照    处理    对照    处理    对照    处理

   样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品0      7.00    5.00    6.00    3.13    6.00    5.77    -       6.630.5    ≤-0.50 ≤0.50  ≤-0.50 ≤0.50  -       -       -       ND1      ≤-0.50 ≤0.05  ≤-0.50 ≤0.50  -       -       -       ND4      ≤-0.50 ≤0.50  ≤-O.50 ≤0.50  -       -       -       ND5      ≤-0.50 ≤0.50  ≤-0.50 ≤O.50  -       -       -       -6      ≤-0.50 ≤0.50  ≤-0.50 ≤0.50  -       -       -       ND10     ≤-0.50 ≤0.50  ≤-0.50 ≤0.50  ≤5.80 ＜2.00    -       -

本实验中病毒最低检测限为≤0.50 Log TCID₅₀/0.1ml。

Sindbis基础病毒滴度：7.70Log PFU/ml。

ND：末检测出病毒。

检测结论：对送检样品，经巴氏灭活法(60℃加热10小时)处理，对指示病毒VSV、Sindbis及Polio-I灭活显著，加热30分钟后，病毒滴度均降至试验检测限之下。病毒减少分别为VSV：≥4.50-4.63，Po lio-I：≥2.63-3.63，HIV：≥3.77-4.17(单位Log TCID₅₀/0.1ml)Sindbis：≥6.32-6.41 Log PFU/ml，且对加热6小时、10小时样品盲传3代，均为阴性。

2.低pH灭活法

       表5低pH室温孵放对三种病毒的灭活效果

          VSV              HIV^*          Sindbis时间    Log TCID₅₀/0.1ml Log TCID₅₀/0.1ml  Log PFU/ml(天)

    酸性      中性    酸性      中性    酸性    中性0       3.88      6.38    5.77      6.00    3.75    7.343       3.13      6.13    -         -       ND      7.097       1.75      5.88    ＜2.00    5.80    ND      7.0914      ≤0.50    5.18    -         -       ND      6.6021      ≤0.50    4.88    -         -       ND      6.23

本实验中病毒最低检测限为≤0.50 Log TCID₅₀/0.1ml

*：巴氏灭活后样品

Sindbis基础病毒滴度：8.35 Log PFU/ml

DN：未检测出病毒

检测结论：送检样品在pH4.0±0.2经22-24℃孵放21天，灭活VSV≥5.88-6.63 Log TCID₅₀/0.1ml，且经盲传三代均无特异CPE。

综上所述实验结果得出结论：

1.巴氏灭活法60℃，10小时能灭活四种指示病毒，尤其是对VSV和Polio-I病毒更有效。

2.低pH孵放法能有效灭活VSV和Sindbis病毒。对VSV、HIV有很强的灭活作用，7天即能彻底灭活。

3.双重病毒灭活法，巴氏灭活10小时后，再经pH4.0室温放置21，更能稳妥地灭活全部指示病毒，确保血液制品的安全性。

按本发明工艺制作静注免疫球蛋白与现有技术相比具有的优点是：

1.本工艺中不加任何保护剂，不但能有效杀灭病毒，保持IVIG分子的完整性和天然生物活性以及制品的纯洁性和安全性，并有良好的稳定性，制品的病毒灭活效果及全面质量标准均通过国家卫生部的验证和检定达到《中国生物制品规程》95年版标准。

2.本工艺中选择了制备IVIG液体剂型而不是冻干制剂，有利于大规模生产，其产品质量稳定而可靠。

3.在本制品中加入5％葡萄糖以维持其溶液的等渗度，避免了一些患者在使用中出现的不良反应。

本发明以下将结合实施例作进一步详述：

实施例1.无保护剂双灭活制备静脉注射用人血免疫球蛋白工艺，第一步巴氏灭活：取FII沉淀16.5千克，加0℃的蒸馏水165升溶解，调节pH3.5，用1mmol/L醋酸100kDa超滤膜超滤脱醇、脱盐至电阻率5kΩ·cm(NaCl 1.2mmol/L)，调节免疫球蛋白浓度＜2％，装瓶，充CO₂使内压720Pa条件下封口。60士1℃，10小时灭活。第二步低pH孵放处理：经巴氏灭活的FII溶液，100kDa超滤膜切割精制，如果免疫球蛋白纯度仍＜97％时，可用DEAE-Sephadx A-50凝胶吸附提高纯度，然后浓缩至免疫球蛋白浓度5％，调pH4.1，除菌过滤，放置21天，加入5％葡萄糖，除菌后送半成品做理化检查、热原质检验及无菌试验。半成品检测合格后，除菌过滤，分装25ml/瓶或50ml/瓶，按静脉注射用人血免疫球蛋白规程进行全面质量检查。

实施例2.无保护剂双灭活制备静脉注射用人血免疫球蛋白工艺，第一步巴氏灭活：取FII沉淀15千克，加0℃的蒸馏水150升溶解，调节pH5.0，用0.2mmol/L醋酸10kDa超滤膜超滤脱醇、脱盐至电阻率5.2kΩ·cm(NaCl 1.8mmol/L)，调节免疫球蛋白浓度＜2％，装瓶，充CO₂使内压700Pa条件下封口。60±1℃，10小时灭活。第二步低pH孵放处理：经巴氏灭活的FII溶液，10kDa超滤膜切割精制，如果免疫球蛋白纯度仍＜97％时，可用DEAE-Sephadx A-50凝胶吸附提高纯度，然后浓缩至免疫球蛋白浓度5％，调pH4.1，除菌过滤，放置21天，以后操作同实施例1。

实施例3.无保护剂双灭活制备静脉注射用人血免疫球蛋白工艺，第一步巴氏灭活：取FII沉淀16.5千克，加0℃的蒸馏水165升溶解，调节pH4.2，用2.0mmol/L醋酸50kDa超滤膜超滤脱醇、脱盐至电阻率5.2kΩ·cm(NaCl 1.0mmol/L)，调节免疫球蛋白浓度＜2％，装瓶，充CO₂使内压700Pa条件下封口。60士1℃，10小时灭活。第二步低pH孵放处理：经巴氏灭活的FII溶液，50kDa超滤膜切割精制，如果免疫球蛋白纯度仍＜97％时，可用DEAE-Sephadx A-50凝胶吸附提高纯度，然后浓缩至免疫球蛋白浓度5.8％，调pH4.1，除菌过滤，放置21天，以后操作同实施例1。