抗肿瘤药物筛选和临床化疗效果判断的方法

摘要

本发明提供一种抗肿瘤药物筛选和临床化疗效果判断的方法。该法是基于本发明人在世界上首次证明的哺乳类凋亡细胞(除神经细胞和红细胞外)表达脑型乙酰胆碱酯酶,分子量为66KDa,与神经中的乙酰胆碱酯酶相似。根据这个原理,通过检测正常不表达乙酰胆碱酯酶的细胞中的乙酰胆碱酯酶活性,就可以鉴定是否发生细胞凋亡。可用于新抗肿瘤药物筛选,临床帮助医生判断化疗药物效果,针对患者找到最佳化疗药物。

说明书

本发明涉及抗肿瘤药物效果判断方法，尤其是关于通过检测正常不表达乙酰胆碱酯酶的哺乳类细胞中的乙酰胆碱酯酶活性，鉴定是否发生细胞凋亡，用于抗肿瘤药物筛选和临床化疗效果判断的方法。

已经知道临床用于治疗肿瘤的化疗药物，都是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用的。那么抗癌药物治疗肿瘤的效果如何，是否诱导肿瘤细胞凋亡，至今没有一种鉴定体内细胞凋亡的手段。人们不可能为了检测抗肿瘤药物的效果而每次从人体内取出组织进行电泳分析是否发生了细胞凋亡。而且，不同的肿瘤，不同的患者，对各种化疗药物的反应是不同的，有的抗肿瘤药物在这个患者身上疗效很好，而对另一个患者疗效就不好。如果有一种新的鉴定细胞凋亡的手段，就象对细菌的药敏实验那样，对于临床指导选择肿瘤化疗药物和药物学研究中抗癌药物的筛选那就会有的放矢。给患者带来福音。

体外实验鉴别细胞凋亡常用的可靠手段是琼脂糖电泳显示DNA片段梯形(Wylie AH，et al.Am J Pathol 109：78-87，1982；Peitsch MC，et al.The EMBOJournal 12：371-377，1993；)，涂片或组织切片原位标记断裂DNA，如TUNEL方法(Stammler G and M Volm，Apoptosis 1：95-99，1996)以及FACS显示凋亡峰(Bergamaschi G et al.Haematologica 79：86-93，1994)。然而，有些凋亡细胞既追踪不到DNA片段梯形也没发现FACS显示凋亡峰(Di-Pietro R，et al.Cytokine9：463-470，1997)，由此可见，探索一种新的鉴定凋亡细胞的手段很有必要。

本发明目的是提供一种抗肿瘤药物筛选和临床化疗效果判断的方法，该法是通过检测由抗肿瘤药物体外作用于不表达乙酰胆碱酯酶的细胞后，细胞表达的乙酰胆碱酯酶活性，或测定血清乙酰胆碱酯酶活性来鉴定细胞是否发生凋亡，籍此筛选抗肿瘤药物及对肿瘤病人临床化疗效果进行判断。

经过反复实验论证，本发明人首次在国际上证明哺乳动物细胞(除神经细胞和红细胞外)在发生细胞凋亡时，凋亡细胞表达乙酰胆碱酯酶。归纳如下：1.哺乳动物，如人，小鼠和大鼠细胞(除神经细胞和红细胞外)，一旦发生了凋亡，均表达乙酰胆碱酯酶，说明其进化过程的保守性。2.不论是肿瘤细胞株还是原代培养的正常二倍体细胞，一旦发生了凋亡，就表达乙酰胆碱酯酶，说明乙酰胆碱酯酶的表达与肿瘤发生关系不大，而与细胞凋亡密切相关，通过实施例3、实施例7和实施例8，提供了非肿瘤细胞凋亡时表达乙酰胆碱酯酶的直接证据。另外Zakut等作者(Zakut H，et al.Cancer 61：727-737，1988)调查的肿瘤病人治疗前血清乙酰胆碱酯酶活性不高，和Karpel等作者(Karpel R，et al。ExperimentalCell Research 210：268-277，1994)报道在原发性肿瘤的活检组织中追踪不到任何乙酰胆碱酯酶mRNA的表达，都有力地支持我们的论点。

本发明根据这个原理，以检测正常不表达乙酰胆碱酯酶的哺乳动物细胞(除神经细胞和红细胞外)是否表达了乙酰胆碱酯酶为依据，判断该细胞是否发生了凋亡。通过检测由抗肿瘤药物体外作用于不表达乙酰胆碱酯酶的细胞后，细胞表达的乙酰胆碱酯酶活性，或测定血清乙酰胆碱酯酶活性，作为判断细胞凋亡的手段，籍此筛选抗肿瘤药物，帮助医生选择针对病人特别敏感的化疗药物，以提高治疗效果。

1.体外实验筛选抗肿瘤药物：研究抗肿瘤新药，要在众多的候选药物中进行筛选，能否诱导肿瘤细胞凋亡是一个重要指标。本发明方法可用以体外实验筛选抗肿瘤新药。

体外培养的人肿瘤细胞株，加入所要检测的不同剂量的抗肿瘤候选药物，在18-20小时后，采用“血浆凝块法”或“聚丙烯酰胺凝胶法”，使悬浮的细胞处于半固体凝块中。1％多聚甲醛固定10分钟，用滤纸吸干水分，再作乙酰胆碱酯酶活性染色。配制乙酰胆碱酯酶底物反应液(0.1M磷酸缓冲液Ph 6.0150ml，乙酰硫代胆碱100mg/200ml，0.1M柠檬酸钠11ml，30mM硫酸铜20ml，5mM铁氰化钾20ml)，进行酶反应。检测细胞乙酰胆碱酯酶活性时，使细胞在反应液中室温孵化6-12小时，呈黄褐色为阳性反应。抑制实验是在反应液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂。如果活性反应被抑制，证明该活性是由乙酰胆碱酯酶催化所至。本实验中非变性电泳分离的蛋白，乙酰胆碱酯酶活性反应阳性，该活性可被BW284c51抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。上述阳性反应，说明该药物已经诱导了细胞凋亡，是有效的抗肿瘤药物。

2.临床肿瘤患者化疗效果判断

在用抗菌素治疗细菌引起的疾病时，由于抗菌素的广泛使用，耐药菌株不断出现，对某些人的感染性疾病，有的抗菌素效果不佳。这时，医生往往取出患者病灶部细菌进行药物敏感实验，以便找到针对性抗菌素治疗有耐药菌株的病人，取得最佳效果。

对于不同的肿瘤，不同的患者，对各种化疗药物的反应是不同的，有的抗肿瘤药物在这个患者身上疗效很好，而对另一个患者疗效就不好。本发明方法，就象上述对细菌的药敏实验那样，能帮助临床医生有针对性选择肿瘤化疗药物，有的放矢，在最短时间内找到最佳药物，给患者带来福音。

化疗药物是针对肿瘤细胞，使之发生凋亡，从而达到治疗的目的。本发明建立在科学研究新发现的基础之上。其原理是正常情况下不表达乙酰胆碱酯酶的细胞在细胞凋亡过程中大量表达乙酰胆碱酯酶，主要集中到细胞核内，随着细胞核被形成凋亡小体，乙酰胆碱酯酶就存在于凋亡小体内。正常人或肿瘤患者在没有治疗的情况下，体内虽然不断有细胞凋亡，但数量少，凋亡细胞很快被周围的巨噬细胞吞噬，凋亡细胞内的乙酰胆碱酯酶不释放到血液中。但是，如果有效的化疗药物，使得肿瘤细胞大量凋亡，巨噬细胞还不能很快吞噬所有的凋亡细胞，或者受药物影响，巨噬细胞吞噬能力降低，不能很快吞噬凋亡细胞，这时大量的乙酰胆碱酯酶随凋亡细胞及凋亡小体进入血液中。此时取患者血清测定血清乙酰胆碱酯酶活性，就会发现它的活性比正常人或治疗前高出3-6倍。因此，测定患者治疗前后血清乙酰胆碱酯酶活性，就知道化疗效果如何，帮助临床医生在最短时间内找到有针对性最佳的肿瘤化疗药物，有的放矢，为挽救病人的生命，争取宝贵的时间。

如果患者是白血病，可直接取病人血液，用FICOLL 400(Gibco BRL公司)分离，去红细胞后，分成若干分，培养在35mm的培养皿中，加入不同的化疗药物，18-20小时后，采用“血浆凝块法”或“聚丙烯酰胺凝块法”，使悬浮的细胞处于半固体凝块中。1％多聚甲醛固定10分钟，用滤纸吸干水分，再作乙酰胆碱酯酶活性染色。配制乙酰胆碱酯酶底物反应液(0.1M磷酸缓冲液Ph 6.0 150ml，乙酰硫代胆碱100mg/200ml，0.1M柠檬酸钠11ml，30mM硫酸铜20ml，5mM铁氰化钾20ml)，进行酶反应。检测细胞乙酰胆碱酯酶活性时，使细胞在反应液中室温孵化6-12小时，呈黄褐色为阳性反应。抑制实验是在反应液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂。如果活性反应被抑制，证明该活性是由乙酰胆碱酯酶催化所至。本实验中非变性电泳分离的蛋白，乙酰胆碱酯酶活性反应阳性，该活性可被BW284c51抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶，表明患者使用的化疗药物诱导了细胞凋亡，是有效的化疗药物。

如果是实体肿瘤则可通过测定治疗前后的血清乙酰胆碱酯酶活性来判断，如果治疗后酶活性比治疗前活性高出3-6倍，这表明肿瘤细胞发生了凋亡，说明化疗效果好，可以帮助临床医生针对性选择化疗药物。测定血清乙酰胆碱酯酶的方法，参见Uete T，et al：Clin.Biochem.J 327-333，1970。

还有一种测定血清乙酰胆碱酯酶被抑制后剩余活性的方法，本发明人借助Zakut H et al：Cancer 61：727-737，1988的方法.Zakut等作者测定了77例治疗后患者、11例治疗前患者和21例正常人血清乙酰胆碱酯酶BW抑制后的剩余活性，结果经过1×10^-5BW抑制后测定的乙酰胆碱酯酶发现治疗后酶活性明显升高，但是他们没有证明与肿瘤细胞凋亡有关，更没有提出作为判断细胞凋亡和治疗效果的作用。根据本发明人证明凋亡细胞表达乙酰胆碱酯酶的结果，提出借助他们测定血清乙酰胆碱酯酶的方法，鉴定化疗效果。

本发明的优点：本发明方法是通过检测由抗肿瘤药物体外作用于不表达乙酰胆碱酯酶的细胞后，细胞表达乙酰胆碱酯酶活性，或测定血清乙酰胆碱酯酶活性来鉴定是否发生凋亡，凋亡细胞乙酰胆碱酯酶反应阳性，说明该药物已经诱导了细胞凋亡，是有效的抗肿瘤药物，籍此能方便有效地筛选抗肿瘤药物，还可帮助医生选择针对病人特别敏感的化疗药物，以提高治疗效果。用本发明方法检测乙酰胆碱酯酶活性来鉴定体外培养的凋亡细胞的结果与经典方法是一致的。而且定位准确，方法简单易行，不需要昂贵的设备，也不要太昂贵的试剂，可以定性也可以定量分析。

本发明通过以下的附图和实施例作进一步阐述，但并不限止本发明的范围。

附图说明

图1.HLF和HL-60细胞凋亡的DNA梯形片段琼脂糖电泳图。

(1)123 DNA标记，(从Sigma公司购买)；

(2)人肺成纤维细胞株(HLF)，经过诱导后的凋亡细胞，显示DNA梯形片段；

(3)人白血病细胞株(HL-60)，经过诱导后的凋亡细胞，显示DNA梯形片段；

(4)人白血病细胞株(HL-60)，生长良好，无DNA梯形片段，证明没有发生细胞凋亡。

图2.FACS显示HL-60细胞凋亡的凋亡峰图。其中A是凋亡峰，B是G0-G1期，C是G2-M期。

图3.光学显微镜显示HL-60细胞，左侧园而光滑并无底物阳性反应的细胞是正常细胞，右侧形态不规则，棕色反应的细胞是凋亡细胞。×300。

图4.光学显微镜显示HL-60细胞，左侧园而光滑并无底物阳性反应的细胞是正常细胞，右侧形态不规则，棕色反应的细胞是凋亡细胞。×300。

图5.光学显微镜显示HL-60细胞，左侧园而光滑并无底物阳性反应的细胞是正常细胞，右侧形态不规则，已经形成凋亡小体，棕色反应的细胞是凋亡细胞。×300。

图6.光学显微镜显示HL-60细胞，细胞形态不规则，已经形成凋亡小体，棕色反应的细胞是凋亡细胞。×300。

图7.HL-60细胞的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

(1)PCR标记(bp)：1,543 994 695 515 377；

(2)使用引物1和引物2的RT-PCR产物电泳图谱，PCR产物是482bp，证明凋亡过程中的HL-60细胞转录的是脑型乙酰胆碱酯酶mRNA；

(3)使用引物1和引物3的RT-PCR产物电泳图谱，证明产物不是通读型；

(4)使用引物1和引物4的RT-PCR产物电泳图谱，证明产物不是红细胞型。

图8.用聚丙烯酰胺凝胶块法检测HLF细胞，棕色反应的是凋亡细胞，×500。

图9.直接检测贴壁的HLF细胞，棕色反应的是凋亡细胞，其中有凋亡小体，×300。

图10.用血浆凝块法检测PC-3细胞，棕色反应的是凋亡细胞。×300。

图11.用血浆凝块法检测M07e细胞，棕色反应的是凋亡细胞，凋亡小体尤其明显。×400

图12.用血浆凝块法检测HELA细胞，棕色反应的是后期凋亡细胞，并且出现泡状突起。×400。

图13.用血浆凝块法检测HELA细胞，棕色反应的是早期凋亡细胞，酶分布于整个细胞。×400。

图14.用血浆凝块法检测HELA细胞，棕色反应的是中期凋亡细胞，酶集中于细胞核内。×500。

图15.用血浆凝块法检测HIH/3T3细胞，棕色反应的是凋亡细胞，×300。

图16.大鼠主动脉平滑肌凋亡细胞透射电子显微镜图，核内乙酰胆碱酯酶阳性，核开始形成凋亡小体，×11500。

实施例1抗肿瘤药物作用于HL-60细胞引起凋亡的鉴定

悬浮培养人白血病细胞株(HL-60)，培养液RPMI Medium 1640(GibcoBRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养。对照组不加抗肿瘤药物，实验组加入1μM抗肿瘤药物柔红霉素(daunorubicin，Italy)，18-20小时后收集凋亡细胞。为了确认细胞处于凋亡状态，本发明人首先用经典的方法鉴别细胞凋亡，然后，用本发明的方法鉴定凋亡细胞，并且进行比较。

经典的方法鉴别细胞凋亡

(1)琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA片段

HL-60细胞的DNA抽提方法参见文献(Jaffrezou JP，et al The EMBOJournal 15：2417-2424，1996)，正常及凋亡的细胞(2-3×10⁶)分别离心，沉淀物用PBS洗涤，再离心后沉淀物用40μl的0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸(192∶8)重悬，室温放置60分钟。然后2000g离心30分钟，上清转入1.5ml Eppendorf管，加入3μl 0.25％NP-40及3μl RNase A(10mg/ml)，37℃温育60分钟，再加入3μl蛋白酶K(10mg/ml)，50℃温育30分钟。反应完毕加入5μl加样缓冲液，1％琼脂糖凝胶电泳。见图1中的3，显示DNA片段呈梯形，而正常组则无梯形变化(图1中的4)，这是细胞凋亡最可靠的证据。

(2)流式细胞仪检测凋亡峰(参见Bedi A，et a1.Blood 83：2-38-2-44，1994)50％乙醇固定诱导的HL-60细胞，0.1％曲通(Triton X-100)室温处理细胞5分钟，再用5μg/ml RNAse在37℃孵化15分钟，50μg/ml PI(Propidium iodide)在4℃染色60分钟，然后用流式细胞仪(FACscan，USA)追踪特征性的DNA碎片形成的凋亡峰和G0/G1，S/G2和M期的细胞(见图2)。

(3)凋亡细胞形态学：图3-图6中可见部分细胞核固缩，细胞膜呈泡状结构，凋亡小体，这些是典型的凋亡细胞(Kerr JFR，et al.26：239-257，1972；Plunkett W.Apoptosis-the story of suicide in the cell，CBC Oxford，UK，1995)。

本发明对体培养的HL-60细胞进行乙酰胆碱酯酶活性检测

对体外培养的细胞进行乙酰胆碱酯酶活性鉴定可在细胞水平实施。细胞可以在悬浮状态进行酶活性反应，也可以在贴壁状态进行酶活性反应，采用血浆凝块法，目的是使细胞处于半固体的网状支架中，以避免酶反应后的游离生成物附着在细胞表面，造成假阳性。整个步骤是：血浆凝块法(使细胞处于半固体的网状支架中)-固定-吸干-酶反应-显微镜观察。

操作过程：

血浆凝块法：取上述经过抗肿瘤药物作用后，并且用经典方法证明是凋亡的同一批的细胞悬液(凋亡细胞和原培养液)0.8ml，3.4％CaCl₂ 0.1ml，牛纯血浆(Gibco公司)0.1ml，将三者混匀后，立即加入到直径35mm的塑料培养碟中，放置在37℃孵化15分钟，凝固后固定。

固定：1％多聚甲醛1ml加入塑料培养碟中固定10分钟，倒掉固定液。

吸干：用直径34mm的滤纸5张，吸干剩余的水分。加入底物进行酶反应。

酶反应：配制乙酰胆碱酯酶底物反应液(0.1M磷酸缓冲液Ph 6.0 150ml，乙酰硫代胆碱100mg/200ml，0.1M柠檬酸钠11ml，30mM硫酸铜20ml，5mM铁氰化钾20ml)。在室温下反应6-12小时，去反应液，在光学显微镜下观察结果。

光学显微镜下观察：乙酰胆碱酯酶的细胞出现黄褐色反应(图3，图4，图5，图6)，而正常细胞没有阳性反应。图3-5中，左侧的细胞正常，细胞表面平滑，细胞内无酶阳性反应；右侧的细胞是凋亡细胞，细胞固缩，表面有小泡状突起，有些细胞内已经出现凋亡小体(图6十分明显)，正是这样的凋亡细胞，乙酰胆碱酯酶呈阳性反应。这个结果与经典方法判断细胞凋亡是一致的。而且，非常具体地显示那个细胞凋亡，还可定量分析各个阶段凋亡数和凋亡细胞与正常细胞数的比例，不象电泳和FACS显示的是总体细胞内有凋亡细胞。抑制实验是在反应液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂，酶活性可被抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。关于乙酰胆碱酯酶的类型证明，见实施例2。

从这个结果可见，HL-60凋亡细胞乙酰胆碱酯酶反应阳性，正常细胞则阴性反应，将细胞形态与文献报道的凋亡细胞形态比较，结果完全相吻合，表明该肿瘤药物已经诱导HL-60细胞凋亡，是有效的抗肿瘤药物。

实施例2乙酰胆碱酯酶类型的鉴定

实施例1中证明HL-60凋亡细胞表达乙酰胆碱酯酶，那么是哪个类型的AChE呢？这里作了进一步的证明。鉴定乙酰胆碱酯酶从两个层次进行，一是在转录水平，即用RT-PCR的方法，检测细胞是否有AChE mRNA的转录。二是翻译后的蛋白质水平，即通过检测该酶的活性和分离到该酶。

1.转录水平：

正常的和诱导的HL-60细胞核酸分别抽提后，获得mRNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板作PCR，PCR引物及RT-PCR步骤：

PCR引物设计序列如下：

(1)1522(+)5’-

CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3′

(2)2003(-)5′-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3′

(3)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3’

(4)5’-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3’

引物1和引物2分别位于AChE基因的E3及E6内，用以检测脑型AChEmRNA(E1-E2-E3-E4-E6)；引物1和引物3用以检测通读型，即E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI连接通读型)；引物1和引物4用以检测红细胞型，即E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI连接疏水型)。本实验中未检测到红细胞型和通读型。

RT-PCR步骤：总RNA抽提使用Boehringer，Mannheim公司的Tripure^TM分离试剂。cDNA合成使用Promega公司的随机六引物，逆转录使用Boehringer，Mannheim公司的Expend^TM逆转录酶，方法按照该试剂的操作程序。PCR扩增使用Perkin-Elmer公司的480扩增仪，条件如下：变性，94℃，1分钟；退火65℃，1分钟；延伸，72℃，1分钟(最后一个循环5分钟)；循环数，39次。PCR扩增产物于1.6％的琼脂糖凝胶电泳检测。

检测到凋亡细胞中有大量AChEmRNA，其剪切形式是E1-E2-E3-E4-E6型(亲水型也即脑型)见图  7(该引物扩增的范围在1522到2003之间，PCR产物应该是482bp)，而不是E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI连接疏水型，也即红细胞型)也不是E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI连接通读型)。

2.蛋白质水平检测：

第一步，裂解细胞，参照《分子克隆》一书配制裂解液(50mmol/Tris。Cl Ph8.0，150mmol/LNaCl，0.02μg叠氮钠，1μg/ml抑蛋白酶肽(Aprotinin)，1％曲通(Triton X-100)。将裂解液加入细胞中裂解细胞，1000g离心5分钟，去除未裂解的细胞碎片。

第二步，tacrine亲和柱分离凋亡细胞的乙酰胆碱酯酶，参照文献(RichardTet al.Protein Expression and Purification 6，389-393，1995)，用环氧活化琼脂糖凝胶6B(Epoxy-activated Sepharose 6B)10g，＂Sigma公司，E-6754＂，和13g 9-aminoacridine HCl，＂Aldrich公司No.A3840-1＂制备Tacrine亲和柱，首先用0.2M NaCl 50mMTris-HCl Ph8.0缓冲液平衡柱，样品放在平衡液中上样，流速0.3ml/分钟。洗脱用10mM Tacrine，50 mM Tris-HCl Ph8.0洗脱液，洗脱的乙酰胆碱酯酶，再用10mM Tris-HCl Ph8.0透析，换透析液三次，透析24小时。冷冻干燥。

第三步，乙酰胆碱酯酶活性鉴定(参照文献Richard T et al.ProteinExpression and Purification 6，389-393，1995)

活性鉴定和活性抑制实验可在细胞水平和电泳凝胶上进行。配制乙酰胆碱酯酶底物反应液(0.1M磷酸缓冲液Ph 6.0 150ml，乙酰硫代胆碱100mg/200ml，0.1M柠檬酸钠11ml，30mM硫酸铜20ml，5mM铁氰化钾20ml)。本实验中使用了Bio-RAD mini-PROTEIN II电泳仪，6％PAGE凝胶，取细胞裂解液，加入0.2％曲通X-100，进行非变性电泳，电压20伏，12小时，电泳后取出凝胶，放置在配制的乙酰胆碱酯酶底物反应液中反应4小时。结果有乙酰胆碱酯酶的地方出现黄褐色阳性带，而其它蛋白质则没有阳性反应。抑制实验是在反应液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂，酶活性可被抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。

SDS-PAGE进行分子量鉴定：使用SDS-PAGE电泳方法测定分子量，证明从凋亡的HL-60细胞中分离的有活性的蛋白质为66KDa，是脑型乙酰胆碱酯酶。

实施例3凋亡的非肿瘤细胞人肺成纤维细胞(HLF)能表达乙酰胆碱酯酶的实验

贴壁生长的人肺成纤维细胞，培养液RPMI 1640(Gibco公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养，4天不换培养液，让其自然衰老凋亡，4天后收集细胞。

用经典的方法鉴定细胞凋亡(见图1中的2)同实施例1。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶块法，使用该法的原理与“血浆凝块法”相同，也是为了避免出现假阳性反应。步骤是细胞+聚丙烯酰胺凝胶块(使细胞处于半固体的网状支架中)-固定-酶反应-干胶-显微镜观察。

聚丙烯酰胺凝胶的配制参照《分子克隆》方法，配制8％的聚丙烯酰胺凝胶5ml，各个组分如下：

悬浮的凋亡细胞及原培养液3.65ml

30％丙烯酰胺溶液1.3ml

10％过硫酸胺0.05ml

TEMED 0.003ml

混合加入Bio-RAD mini-PROTEIN II的凝胶玻璃板间，室温20分钟后，凝块形成，取出凝胶，固定。

固定：将凝胶块放置在盛有1％多聚甲醛20ml的平底容器中室温固定10分钟，倒掉固定液。用0.1M磷酸缓冲液Ph6.0洗涤三次。

然后进行酶-底物反应。反应条件同实施例1。

干胶：放置在Model 583 Gel Dryer(Bio-RAD公司)，2小时吸干。

在光学显微镜下观察结果：凋亡细胞有乙酰胆碱酯酶黄褐色反应(图8)，而正常没有阳性反应。凋亡细胞，细胞固缩，表面有小泡状突起，有细胞内已经出现凋亡小体。抑制实验是在反应液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂，酶活性可被抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。进一步证明是脑型乙酰胆碱酯酶，见实施例2。

如果直接在贴壁细胞中加入固定液，然后进行底物反应，也能显示棕色凋亡细胞，其中有凋亡小体(图9)。

实施例4抗肿瘤药物作用于人前列腺癌细胞(PC-3)引起凋亡的鉴定

培养人PC-3细胞，贴壁生长。培养液RPMI Medium 1640(Gibco BRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养。对照组不加诱导药物，实验组加入抗肿瘤药物2μM柔红霉素(daunorubicin，Italy)，18-20小时后收集细胞。

用经典的方法鉴别细胞凋亡和本发明对体外培养的细胞进行乙酰胆碱酯酶活性检测同实施例1。两种检测细胞凋亡的结果是一致的。而且，本发明能显示具体的细胞凋亡(见图10，棕色细胞是凋亡细胞)，不象电泳和FACS显示的是总体细胞内有凋亡细胞。抑制实验是在反应液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂，酶活性可被抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。进一步证明是脑型乙酰胆碱酯酶，同实施例2。本实验表明该抗肿瘤药物已诱导PC-3细胞凋亡，是有效的抗肿瘤药物。

实施例5抗肿瘤药物作用于人巨核细胞(M07e)引起凋亡的鉴定

培养人M07e细胞，悬浮生长。培养液α-Medium，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养。由于该细胞株是细胞因子GM-CSF依赖型的，因此对照组加GM-CSF，2.5ng/ml，实验组不加入GM-CSF，18-20小时后收集细胞。

用经典的方法鉴别细胞凋亡和本发明对体外诱导培养的细胞进行乙酰胆碱酯酶活性检测。两种检测细胞凋亡的结果是一致的。而且，本发明能显示具体的细胞凋亡(见图11)，棕色显示是凋亡细胞，凋亡小体尤其明显)。抑制实验是在反应液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂，酶活性可被抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。进一步证明是脑型乙酰胆碱酯酶同实施例2，本实验表明该抗肿瘤药物已诱导M07e细胞凋亡，是有效的抗肿瘤药物。

实施例6抗肿瘤药物作用于人HELA细胞引起凋亡的鉴定

培养人HELA细胞，贴壁生长。培养液RPMI Medium 1640(Gibco BRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养。对照组不加诱导药物，诱导实验组加入2μM柔红霉素(daunorubicin，Italy)，18-20小时后收集细胞。

用经典的方法鉴别细胞凋亡和本发明对体外培养的细胞进行乙酰胆碱酯酶活性检测。两种检测细胞凋亡的结果是一致的。而且，本发明能显示具体的细胞凋亡(见图12，图13，图14显示棕色的是凋亡细胞)，图12显示后期凋亡细胞，图13显示凋亡早期阶段，图14显示凋亡中期阶段。抑制实验是在反应液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂，酶活性可被抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。进一步证明是脑型乙酰胆碱酯酶，见实施例2，本实验表明该抗肿瘤药物已诱导HELA细胞凋亡，是有效的抗肿瘤药物。

实施例7凋亡的非肿瘤细胞小鼠成纤维细胞(NIH/3T3)能表达乙酰胆碱酯酶的实验

贴壁生长的NIH/3T3细胞，培养液RPMI Medium 1640(Gibco BRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养。不加因子，3-4天不换培养液，让其自然衰老，第四天收集细胞。

用经典的方法鉴别细胞凋亡和本发明对体外培养的细胞进行乙酰胆碱酯酶活性检测。两种检测细胞凋亡的结果是一致的。而且，本发明能显示具体的细胞凋亡(见图15，棕色显示凋亡细胞)。抑制实验是在反应液中加入10μMBW284c51(Sigma公司)乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂，酶活性可被抑制，证明该蛋白的确是乙酰胆碱酯酶。

实施例8凋亡的非肿瘤细胞大鼠主动脉平滑肌细胞能表达乙酰胆碱酯酶的实验

贴壁生长大鼠主动脉平滑肌细胞，培养液M199(Gibco BRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养。对照组不加因子，实验组加入5μg/ml TGF-β，18-20小时后收集细胞。立即固定-酶底物反应(方法同实施例1)，6小时后1000转/分钟离心5分钟，用磷酸缓冲液(见实施例1)洗涤3次，再用1％四氧化锇(Osmium tetroxide)4℃后固定30分钟。蒸馏水洗涤3次，乙醇梯度脱水，丙酮处理三次，Epon-812树脂包埋，超薄切片(LKB公司切片机)，不经过电子染色，直接在Philips CM 10型透射电子显微镜下观察。由于乙酰胆碱酯酶反应的生成物含有金属，电子密度高，可清晰显示生成物的位置，主要集中在核内(图16)，提示酶的位置主要在细胞核内。由此推测该细胞处于凋亡的中期，因为，核明显固缩，有核小体出现，是典型的凋亡细胞形态学表型。

实施例9  实体肿瘤通过测定化疗前后的血清乙酰胆碱酯酶活性判断化疗效果

一前列腺癌病人，未手术，采用化疗，为选择合适化疗药物，分别收取化疗前和化疗药物治疗后20-48小时的血清0.04ml，测定血清乙酰胆碱酯酶活性来判断化疗疗效。测定血清乙酰胆碱酯酶的方法，参照Uete T，et al：Clin.Biochem.J 327-333，1970.简述如下：

试剂：

1.Tris缓冲液，0.2 mol/l，pH 7.4 and 8.0，

2.乙酰硫代胆碱(Acetylthiocholine)，0.026 mol/l，溶于H₂O

3.HPO₃，25％W/V

4.O-phthalaldehyde(OPT)，0.1％，溶于甲醇

5.硫代胆碱(Thiocholine)

6.还原谷胱甘肽(Reduced glutathione GSH)

7.血液样品：取患者化疗前血清0.04ml作对照，再取治疗后20-48小时血清作为实验组。

操作过程：

将血清样品0.03ml加入0.5ml的0.026 0.026 mol/l乙酰硫代胆碱和0.2mol/l Tris缓冲液，pH 7.4混合液中，放置在37℃孵化3分钟。加入HPO₃，25％W/V 0.6ml终止反应。充分混匀，离心10分钟沉淀蛋白质。取上清0.1ml加入到2ml pH 8.0的Tris缓冲液与0.1ml 0.1％d的O-phthalaldehyde(OPT)混合液中，15分钟后分光光度仪检测，室温下激发波长350nm，检测荧光波长420nm。作为对照，反应混合液与0.6ml 25％HPO₃混合孵育。血清作用后释放的硫代胆碱，以标准硫代胆碱评估，标准量的硫代胆碱同样用OPT处理。一个酶活性单位是37℃下1分钟内释放l微摩尔(micromole)硫代胆碱。血清中乙酰胆碱酯酶活性以1毫升血清1分钟内释放多少微摩尔(micromole)硫代胆碱表示。还原谷胱甘肽被用作判断血清乙酰胆碱酯酶作用后释放的巯基。硫代胆碱-OPT的荧光强度大约是GSH-OPT荧光强度的12％。

结果判断：化疗前每毫升血清每分钟使乙酰硫代胆碱水解成硫代胆碱的量是2.81μmol.化疗后11.24μmol，(高出3-6倍是化疗有效)。

实施例10实体肿瘤通过测定化疗前后的血清乙酰胆碱酯酶被抑制后剩余的活性判断化疗效果

一肺癌患者，未手术，采用化疗，为选择合适化疗药物，分别收取化疗前和化疗药物治疗后20-48小时的血清0.04ml，测定血清乙酰胆碱酯酶被抑制后剩余的活性来判断化疗疗效。测定血清乙酰胆碱酯酶活性的方法，

参见Zakut H et al：Cancer 61：727-737，1988.

本方法使用试剂

1.[3H]-A cetylcholine

2.Tetraisopropyl pyrophosphoram ide(iso-OMPA).

3.1，5-bis-(4-ally ld im ethylam m onium pheny1)-pentan-3-one dibrom ide(BW 284C 51).

治疗前血清加入乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂BW284C51 1×10^-5M后，活性基本被抑制，仅有活性9pmol/μgP/hr(即每微克血清蛋白每小时水解乙酰胆碱的pmol数)，治疗后抑制活性上升到29pmol/μgP/hr，化疗后酶活性比化疗前酶活性高出3.2倍。根据本发明的结果知道，这是由于体内细胞特别是肿瘤细胞发生了凋亡之故，说明化疗效果好。