酪蛋白磷肽和包含酪蛋白磷肽的酪蛋白以及它们的制备方法

摘要

本发明涉及了具有新的氨基酸序列的酪蛋白磷肽(CPP)和一种包含酪蛋白磷肽的酪蛋白,其中在常规CPP中的N－末端的25位精氨酸被半胱氨酸代替,使CPP通过二硫键形成二聚物。在相应的DNA序列中,由胸腺嘧啶代替胞嘧啶,从而导致氨基酸精氨酸(Arg)替换成半胱氨酸(Cys)。在动物体内包含CPP和包含CPP的酪蛋白具有提高的加溶矿物质和吸收矿物质的能力。可以以提高动物对矿物质的吸收有效的量将CPP或包含CPP的β酪蛋白H加入到食物、饮料、药剂、化妆品和饲料中。一种包含β酪蛋白或本发明的CPP和药学上可接受的载体的口服组合物可以减少或解除牙质过敏症。

说明书

发明所属领域

总的来说，本发明涉及一种具有新的氨基酸序列的酪蛋白磷肽、一种包含酪蛋白磷肽的β-酪蛋白H以及它们的制备方法。更具体地说，本发明涉及一种具有新的氨基酸序列的酪蛋白磷肽，在动物的营养方面其能加溶矿物质以促进其吸收。

现有技术描述

肥胖症是威胁人类健康最危险的危害之一，其在很大程度上是因为高热量食品和缺乏维生素和矿物质的饮料造成的。众所周知，这种不平衡饮食是造成成年人疾病如骨质疏松的原因。为了制备平衡的饮食，许多研究者试图向食品中加入缺乏的矿物质。然而，大多数的尝试都没有成功，因为增加一种矿物质会导致吸收抑制或者减少动物体内其它矿物质。因此，需要在没有加入矿物质的情况下增加动物矿物质吸收速率。

一般的，在动物体内矿物质处于可吸收的可溶性状态。然而，在动物体内当矿物质成分穿过小肠的时候，其pH由中性变为碱性状态。按照小肠内的pH值的变化，一大部分矿物质变成了不能溶解的沉淀。就钙的吸收而言，当钙移动到小肠的时候，一部分可溶性的钙减少了，相反pH值增加了。

酪蛋白是一种包含在牛奶或人类乳汁中的蛋白质，并且已经报道了α、β、γ三种类型。特别是，β酪蛋白具有A¹、A²、A³、B、C、D和E变型，已经报道了这些变型的一级结构(W.N.Eigcl.等，牛奶蛋白质的命名法(第5版)，牛奶制品科学，Vol.67，No.8，PP.1607-8(1984))。

并且酪蛋白磷肽(下文称为“CPP”)包含在牛奶中富含的酪蛋白中。到目前为止，已经认识到CPP是一种促进动物矿物质吸收率的重要物质。

由于CPP和包含CPP的酪蛋白具有潜在的在水溶液中加溶矿物质(如钙和铁)的能力，因此，已经进行了很多尝试，通过利用CPP制备平衡食品或饮料，目的是处理或减轻动物中的矿物质营养失调。

无论β-酪蛋白的A¹、A²、A³、B、C、D和E变型，产生的CPP结构和氨基酸序列都是相同的，其序列如下所示：Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-1                5                  10Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg

15     16                       20                  25其中Ser(P)代表磷酸化丝氨酸。

以上表明，常规的CPP具有25个氨基酸；三个连续的磷酸化丝氨酸和随后的两个谷氨酸残基形成很强的负电区，进而提供了钙的活性位点(Naito，“在酪蛋白消化过程中磷肽的肠钙吸收的促进机制”，日本营养和食品杂志，Vol.39，No.6，pp.433-439，(1986))。Naito已经指出，CPP能促进动物小肠对铁和钙的吸收。

已知将含有CPP的酪蛋白和钙一起施用给动物，和钙单独施用相比，动物小肠中可溶性钙明显增加。在钙吸收过程中活性运输主要发生在小肠道的上部，以浓度平衡为基础的被动运输主要发生在小肠道的下部。已表明维生素D和乳糖能进一步促进动物对钙的吸收。尽管小肠的上部(即动物的十二指肠)钙的吸收率很高，但组分的潴留时间很短以致于钙吸收的总体积相对很低。相反，由于食物的潴留时间较长，位于小肠下部的回肠是吸收大部分钙的重要部位。事实上，62％或88％的钙在大鼠的回肠中吸收；而在切除回肠的人体中钙的吸收明显下降。因此，可以认为CPP在钙吸收过程中具有重要的作用(Sato等“酪蛋白磷肽对乳制品中钙吸收的作用”，化学和生物学，Vol.23，No.7，P.418(1985))。

Sato等还报道了为了确定酪蛋白中磷酸残基的作用进行的一系列实验。在这些实验中用分别含有磷酸化的酪蛋白、去磷酸化的酪蛋白、谷胶和凝胶的食物喂养四组大鼠。结果用磷酸化的酪蛋白喂养的一组在动物小肠中表现出大量的可溶性钙和最高的钙吸收率。而且CPP可以从牛奶中通过胰蛋白酶消化产生(Sato等，“酪蛋白分子的磷酸盐部分的对促进小肠对钙的吸收的必要性”，农业生物化学，vol.47，No.10，pp.2415-7(1983))。

为了从牛奶中提取酪蛋白，Gordon描述的方法包括：从牛奶中除去脂肪；向生成物中加入盐酸使pH达到4.6；离心沉淀的酪蛋白；将生成物脱水并冷冻干燥(W.G.Gordon等，乳制品化学基础，第2版，AVI出版公司，(1974))。Spellacy提出从牛奶中沉淀酪蛋白的方法，通过加入从乳链球菌中产生的乳酸J.R.Spellacy酪蛋白，干燥和浓缩的乳清，Lithotype process公司(1953))。Fox提出了一种加入粗制凝乳酶以沉淀牛奶中酪蛋白的方法(K.K.Fox牛奶的副产品，第2版，AVI出版公司(1970))。

已经报道了从上述得到的酪蛋白中产生常规的CPP的各种方法。Peterson提出的方法包括：将酪蛋白进行胰蛋白酶水解；将水解液的pH控制在4.7；除去未反应的酪蛋白；向水解物的上清液加入BaCl₂和乙醇并回收CPP(R.F.Peterson等，美国化学学会杂志，vol.80，p.95(1958))。

Nito提出的产生CPP的方法包括：通过消化酶消化酪蛋白；经SephadexG-25的凝胶过滤分离CPP的粗提物；并通过将粗制混合物经过离子交换树脂而纯化CPP(Naito等，农业生物化学，vol.38，P.1543(1974))。

另外，美国专利4,361,587公开的产生磷肽的方法包括：将酪蛋白进行酶水解；回收得到的水解液；将所说的水解液进行第1次膜超滤；回收保留物；解聚包含在其中的磷肽；将包含解聚的磷肽的保留物进行第2次膜超过滤。

日本专利出版物昭59-159793公开的产生的CPP的方法包括：将酪蛋白进行胰蛋白酶水解以产生CPP；向得到的水解液中加入二价铁离子以沉淀CPP并回收CPP。

并且韩国的公开专利出版物93-10190说明了由粪链球菌变种liquefaciens得到的蛋白酶的用途。

酪蛋白或CPP已经广泛地用于各种目的。通过利用它的加溶矿物质的效果，日本公开的专利出版物Hei.5-336894公开了增加了CPP的健康食品。日本公开的专利出版物平5-176712也提出了包含CPP和碱性的磷酸酯酶的食品。而且，日本公开的专利出版物平4-299942阐述了一种改进的含有CPP的家禽饲料。

PCT出版物WO94/00146和美国专利5,015,628也提出了一种含有CPP的口服组合物，其能防止或减轻牙齿结石或牙质过敏。另外，日本公开的专利出版物平1-269499提出了一种产生含有CPP的皮肤和头发保护品。

这里所有参考文献的内容本文一并参考。

发明概述

本发明发明人致力于提高与CPP有关的肠内矿物质吸收，并且最后发现了一种新的和常规CPP的结构和氨基酸序列不同的CPP。

本发明的具有新的氨基酸序列(本文称为SEQ.ID NO：1)的CPP具有28个氨基酸，其中由半胱氨酸替代了常规氨基酸中的从N-末端开始的第25位精氨酸。在相应的DNA序列中由胸腺嘧啶代替了胞嘧啶，结果导致了精氨酸(Arg)向半胱氨酸(Cys)变化的氨基酸取代。

另外，本发明提供了一种新的含有速溶的(ins tant)CPP的酪蛋白，本发明发明人把它命名为β-酪蛋白H。

因此，本发明的目的是提供一种具有SEQ.ID NO.1的氨基酸序列的新的CPP。

本发明的另一个目的是提供一种包含具有SEQ.ID NO.1的氨基酸序列的本发明的CPP的新β-酪蛋白H。

本发明的另一个目的是提供一种产生本发明的CPP和β-酪蛋白的方法。

而且本发明的另一个目的是提供含有本发明的CPP和β-酪蛋白H并且具有各种用途的组合物。附图简要描述

从以下和伴随的附图相联系的参考实施例的描述中，本发明的其它目的、特点和优点会变得明了。

图1为本发明的β-酪蛋白H的电泳图。

图2(a)是显示所述酪蛋白通过离子交换柱后β-酪蛋白峰的色谱图。

图2(b)是显示图2(a)的β-酪蛋白通过第一阳离子交换柱后特定的β-酪蛋白H峰的色谱图。

图2(c)为显示图2(b)的β-酪蛋白H经过第二阳离子交换柱后特定的β-酪蛋白峰的色谱图。

图3为显示本发明的CPP特定的峰的HPLC色谱图。

图4是显示本发明的CPP的部分DNA序列的图。

参考实施方案的详尽描述

一般地，蛋白质和矿物质易于相互结合，同时这种结合物质的类型和强度很大程度上取决于它们的高级结构，即二级结构和三级结构(Naito，“在酪蛋白消化过程中磷肽的肠钙吸收的促进机制”，日本营养和食品杂志，Vol.39，No.6，pp.433，436，(1986))。由于氨基酸序列和主要的结构的不同，本发明的CPP和含有CPP的β-酪蛋白H表现出在小肠中提高了加溶含钙矿物质的能力；因此，它自然地增强了动物对矿物质吸收的能力。

按照本发明，本发明提供了一种具有SEQ.ID NO.1新的氨基酸序列的新CPP。在本发明中，常规的CPP的25位精氨酸由半胱氨酸代替。另外，新CPP在第25位半胱氨酸后具有3个氨基酸，它们是异亮氨酸(Ile)、天冬酰胺(Asn)和赖氨酸(Lys)。因此，本发明的CPP具有28个氨基酸。由于半胱氨酸的存在，新的CPP间易于通过二硫键形成二聚物。

已经提出，三个连续的磷酸化丝氨酸(第17至19位)和两个谷氨酸残基(第20和21位)形成很强的负电区，其提供了钙的活性位点(Naito见上文)。可以认为，新CPP的二聚物保护了上述的磷酸化丝氨酸和两个谷氨酸残基活性区域。因此，发明的CPP具有提高的加溶矿物质的能力。

本发明的CPP具有28个氨基酸残基，其易于被蛋白酶水解，特别是在N-末端的三位亮氨酸和四位谷氨酸及六位亮氨酸和七位天冬酰胺之间。因此，在动物小肠中可以产生两种片断，即一种具有除去了Arg-Glu-Leu的25个残基，另外一种具有从N-末端除去了Arg-Glu-leu-Clu-Glu-Leu的22个残基。然而，通过水解产生的任何-种片断，只要其具有活性位点(第17到21个残基)，它就有在小肠中加溶矿物质的CPP功能。因此，可以估计，在SEQ.ID NO.1中的肽序列中任何包含活性位点(第17到21位残基)和25位半胱氨酸的片断都在本发明的范围内。

本发明提供包含本发明的CPP的β-酪蛋白H，其对于矿物质具有活性位点，因此β-酪蛋白H在动物的小肠中也能加溶矿物质。

可以认为本发明的CPP或β-酪蛋白H可以通过如碱金属、碱土金属和过渡金属盐等形式来应用。典型的例子是钠、钙、磷酸钙、氟化磷酸钙、铁、锌、钾和镁盐等。

在本发明的另一方面，本发明提供了产生具有SEQ.ID NO.1序列的包含CPP的β-酪蛋白H的方法，其包括以下步骤：选择包含β-酪蛋白H的牛奶；把一种酸或粗制凝乳酶加入牛奶中以形成沉淀；和回收沉淀的β-酪蛋白H。

在这种方法中，选择包含β-酪蛋白H的牛奶通过图1中显示特性带的电泳进行。可以优选地加入到牛奶中的酸的代表性的例子包括盐酸和乳酸。可以通过色谱法回收沉淀的β-酪蛋白H。优选的是连续地进行离子交换色谱和阳离子交换色谱。

在本发明的另一方面，本发明还提供了产生具有SEQ.ID NO.1序列的酪蛋白磷肽的方法，其包括以下步骤：选择β-酪蛋白H；加入一种或多种蛋白酶水解β-酪蛋白H；把一种和多种无机离子加入到获得的水解物中以沉淀出肽；回收沉淀的酪蛋白磷肽。

可以通过图1所示的作为电泳结果的特殊带来鉴定β-酪蛋白H。

在以上的方法中，可以利用各种蛋白酶，其典型的例子包括胰蛋白酶、胰酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、番木瓜酶、链霉蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。优选的是把蛋白酶(加入的量为酪蛋白重量的0.001％至2％)与酪蛋白混合。

所述无机离子选自由Fe、Ca、Ba、Cu、Zn、Mn和Co离子组成的组。在这些离子中，铁离子优选的，为此，使用FeCl₃为其来源。当无机离子的浓度变高时，沉淀物的量增加；然而，这可能破坏CPP的纯度。因此，无机离子优选的浓度范围在5至50mM之间。当把乙醇连同无机离子一起加入时，可以有效地进行CPP的沉淀。

如果不加入无机离子，可以把水解物进行色谱，如HPLC或凝胶过滤色谱。

另外，可以通过参考SEQ.ID NO.1的氨基酸序列利用化学合成产生本发明的CPP。而且，可以通过常规的转化方法制造出包含SEQ.ID NO.1遗传信息的微生物来产生CPP。此外，通过把SEQ.ID NO.1的遗传信息导入到非牛动物(如绵羊和山羊)中可以产生转基因动物。

因为本发明的CPP或β-酪蛋白H是从包含β-酪蛋白H的牛奶中产生的，因此必需大量地制造含有β-酪蛋白H的牛奶。为此，本发明提供了一种产生包含β-酪蛋白H的方法，其包括以下步骤：选择能产生含有β-酪蛋白H之牛奶的牛；使所说的牛和大量分泌牛奶的另一品种的牛杂交以获得F1代；在所说的F1代中选择能产生含有β-酪蛋白H之牛奶的母牛；和从所说的母牛提取含有β-酪蛋白H的牛奶。

为了选择能产生含有β-酪蛋白H之牛奶的牛，分析从牛中提取的包含DNA材料(如血液、组织和精液)的DNA序列，然后和本文参考的SEQ.ID NO.1的序列相比较。作为一种替代方法，可以对牛奶进行电泳以发现图1所示的带。把选择的能产生含有β-酪蛋白H之牛奶的牛同另外一种大量产牛奶的牛(如Holstein种)交配。已经发现获得的后代(F1)具有β-酪蛋白H的遗传信息，其能产生包含所需的β-酪蛋白H的牛奶。这样，选择的改进的牛产生了含有β-酪蛋白H的牛奶，并且产量很高，这正适合大量产生本发明的β-酪蛋白H。

因此，本发明提供了一种健康食品和饮料组合物，其包含CPP或β-酪蛋白H和食物载体。此组合物可以进一步包含能促进矿物质吸收的维生素D和乳糖。此组合物可以优选地包含矿物质如铁、钙等以补充动物的矿物质。组合物的例子包括：牛奶、婴儿或病人食用的奶粉、酸乳酪(液体、乳脂状的或冻干型)、干酪、断奶食物、糕饼、面包、冰激琳、豆腐、糖果、冰糖、蜜脂馅饼、巧克力、焦糖糖果、天然或人工果汁、熟鱼膏、解渴饮料(等渗运动饮料)、粉末状茶、蛋黄酱或调味汁等。

特别地，本发明的CPP或β-酪蛋白H优选地加入不包含婴儿或成年人过敏的乳糖的食品中。

本发明的另一个方面还提供了一种药物组合物，其包含防止、减轻或解除由动物矿物质营养失调引起的疾病的有效量的具有SEQ.ID NO.1氨基酸序列的β-酪蛋白H或CPP以及药学上可接受的载体。通过口服以上的药物组合物可以治疗或减轻由矿物质营养失调引起的疾病(如骨质疏松症或贫血)。可以每天施用0.1g至100g药物组合物中CPP或β-酪蛋白H。优选地，组合物可以包含矿物质，如铁和等。

本发明还提供了一种含有CPP或β-酪蛋白H和食物载体的口服组合物。该口服的组合物包括：水溶液、水-酒精溶液、酒精溶液、酪蛋白的分散体或CPP的漱口药、牙粉(dentifrice)、牙膏、牙粉(toothpowder)、凝胶、锭剂、片剂、口香糖或其它合适的口服组合物的形式。制剂的pH优选的范围在2至10。优选的口服组合物也可以含有有效量的磷酸酯酶抑制剂或磷肽稳定剂，如角叉菜胶阴离子聚合物。

可以以增加动物对矿物质的吸收有效的量将本发明的CPP或包含CPP的酪蛋白加入到组合物(如皮肤或头发保健品，或者食品组合物)和食品载体中。

由于在动物中加溶矿物质的足够的能力，包含速溶CPP或β酪蛋白-H的本发明组合物和以前包含常规CPP或酪蛋白的组合物相比，表现出改进的效果。

由于CPP或β酪蛋白-H具有较高的加溶矿物质的能力，很自然地其能用于以上提到的每一个目的，使产品具有同样更好的效果。

给出以下实施例只是为了说明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1：制备本发明的β酪蛋白-H

把牛奶在5,000RPM离心20分钟，之后除去表层的脂肪层。把生成物中加入淀粉凝胶(Connought医学研究实验室)中；利用由850ml去离子水、100ml醋酸和50ml甲酸构成的缓冲液(pH：1.5)在150伏特下进行12小时电泳。用10％的苯胺黑溶液染色凝胶30分钟，然后通过加入50％的甲醇destained 5小时。产生的电泳图如图1所示，通过特定带来鉴定其中的β酪蛋白-H。

把以上发现含有β酪蛋白-H的牛奶离心，接着除去表层的脂肪层。通过加入盐酸沉淀出β酪蛋白-H；并且进行冷冻干燥。利用20mM咪唑-HCl缓冲液(pH7.0)把10g酪蛋白通过离子交换柱(型号：Mono Q5/5由Pharmaria公司制造)，这样就得到了纯化的β酪蛋白。

利用50mM的醋酸钠缓冲液(pH5.0)使生成的β酪蛋白通过第一阳离子交换柱(型号：Mono Q5/5由Pharmaria公司制造)以获得β酪蛋白H。结果如图2(b)所示。把所述β酪蛋白通过第二阳离子交换柱以产生纯化形式的β酪蛋白-H。色谱图如图2所示。

实施例2：利用胰蛋白酶水解来制备本发明的CPP

把0.01％胰蛋白酶(Sigma公司制造)加入到实施例1获得的β酪蛋白-H中。把混合物溶解在磷酸缓冲液中并在37℃水解12小时。反应结束后，把水解物加热至90℃并保持30分钟以钝化其中的酶。把混合物的pH控制在4.6，然后除去未反应的沉淀物。利用乙腈缓冲液对水解物进行HPLC(RP-柱由Merk公司制造)以产生纯的CPP(纯度99％)。图3所示的色谱图描述了β酪蛋白-H的特定峰。

把纯化过的CPP低压冻干，然后进行蛋白质序列分析(序列分析仪为生物应用系统公司制造)以便给出SEQ.ID NO：1的氨基酸序列。

实施例3：通过加入铁离子制备本发明的CPP

把按照实施例1相同的方法得到的10gβ酪蛋白-H和0.1g的胰蛋白酶溶解在100ml的磷酸盐中，混合物在37℃水解12小时。把FeCl₃加入到生成的溶液中，使溶液的Fe³⁺浓度达到20mM，并且加入50％(v/v)的乙醇以沉淀出肽。把沉淀出来的肽低压冻干，并且进行凝胶过滤色谱，这样就获得了1.2g的CPP(纯度90％)。

实施例4：β酪蛋白-H的DNA分析

从Korean Native牛中提取20ml血液，然后按照Sambrook(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社(1989))提出的常规方法纯化DNA。

为了扩增在β酪蛋白中包含取代氨基酸的DNA片段，参考Bosing(Bosing等，牛β酪蛋白基因的整个核苷酸序列，Aust，生物科学杂志，Vol.41，p.727(1988))提出的方法制备一段引物。制备的引物的DNA序列如下：

引物5’-CAACAGCCTTATTCAGAAGAGTGG

    3’-CAGTGGGATGACAGAAAGTAGTCGTATAGG

把0.5μg的纯化的DNA、0.5μL的dTNP、5μl的10×缓冲液、1μ的Tag聚合酶(1个单位)和33μl的蒸馏水混合。通过把混合物加热到94℃并保持5分钟使DNA变性。此后，重复30个PCR(聚合酶链反应)循环(94℃60秒，57℃60秒，72℃60秒)。PCR反应结束后，延长5分钟以形成扩增的DNA片断的双螺旋。

利用2％的琼脂糖(Gibo公司)通过电泳法纯化扩增的DNA，然后利用自动DNA序列分析仪(应用生物系统公司)分析DNA序列。所分析的具有取代的氨基酸残基的CPP部分的DNA序列如下：

                  内含子4                  外显子5TTTTTTAATGCTAGACCCTGATTTTATTTTTATTTTTCCAAAG  GAA TCT  ATT

                                         Glu Ser  Ile

                      内含子5ACA TGC ATC AAT AAG CTAAAACCCCTCATATTTAAATGTACATTTTTTTAAThr Cys Ile Asn LysATTTCATGTTTGATTTTTATAAACACCATTTATTTATGTATTTTTTTTTTAACCAG外显子6AAA  ATT  GAG  AAG  TTT  CAG  AGT  GAG  CAA  CAG  CAG  CAALys  Ile  Glu  Lys  Phe  Gln  Ser  Glu  Glu  Gln  Gln  Gln

DNA序列图如图4所示。

如上所述，在外显子5中的第13个碱基由胸腺嘧啶代替了胞嘧啶，结果导致本发明中CPP中的氨基酸由半胱氨酸代替精氨酸。

实施例5：利用动物分泌大量产生β酪蛋白-H

为了通过动物分泌方式大量产生β酪蛋白-H，把具有实施例4所示的方法鉴定的β酪蛋白-H遗传信息的一个Korear公牛(A¹H型)和5个Holstein母牛(2个A¹A¹型2个A¹A²型和1个A²A²型)交配后，生出2个公牛和3个母牛。对2头母牛进行DNA分析，发现作为杂合体的具有β酪蛋白-H的一头母牛(按A¹H)和一头公牛(A²H)。

饲养这样获得的具有β酪蛋白-H(A¹H)遗传信息的母牛(F1)，从出生到28个月怀孕。发现这头母牛产的牛奶含有β酪蛋白-H，每天产牛奶接近4.5kg。也就是母牛(F1)的产牛奶量表明是先前的具有β酪蛋白-H的Korean牛的3倍。

实施例6：体内加溶钙的效果的检验

平均重大约120g的40只大鼠供给控制食料，食料的成分为：24wt％的粗蛋白，5wt％的粗脂肪，60wt％的淀粉，5wt％的粗纤维，5wt％的矿物质和1wt％的维生素，饲喂一周后，24小时不供给食料，把大鼠分成4组。每组包括10只大鼠。

第一组大鼠供给含有10wt％的β酪蛋白-H的控制食料，饲喂1.5个小时；

第二组大鼠供给含有10wt％的常规β酪蛋白控制食料，饲喂1.5个小时；

第三组大鼠供给含有本发明的1wt％CPP的控制食料，饲喂1.5个小时；

第四组大鼠供给含有1wt％常规CPP的控制食料，饲喂1.5个小时；

允许所用的大鼠自由地吃控制食料。上述饲喂结束1小时后，把所有的大鼠麻醉，切除它们的小肠。把小肠用盐溶液洗涤，然后分成2部分，即上部和下部。

此后，把小肠中的成分进行分离、均质化并离心。利用自动吸收光谱(Perkin Elmer公司)测量三次上清液中的钙。结果列于下面的表1和表2。  表1：酪蛋白饲喂情况下小肠中的钙浓度

  第一组  第二组增加(％)上部 16.25±1.8  15.49±1.7    4.9下部 42.23±2.5  35.11±2.3    20.2总计 58.48±2.2  50.60±2.0    15.5*平均ppm±标准差表2：CPP饲喂情况下小肠中的钙浓度  第一组  第二组增加(％)上部17.18±1.9 16.05±1.3    7.0下部50.02±3.1 39.33±2.8    29.8总计68.20±2.5 55.38±2.1    23.1

*平均ppm±标准差

如上述表1和表2所示。在供给β酪蛋白-H的第一组大鼠的平均可溶性钙浓度为58.48ppm，比供给先前的酪蛋白的第二组大鼠的量增加约15％。

而且供给本发明的CPP的第三组大鼠的平均可溶性钙浓度为68.20ppm，比供给先前的CPP的第四组大鼠的量增加约23％。

因此，很明显，本发明的CPP和β酪蛋白-H具有超过常规酪蛋白和CPP的意想不到的惊人的钙加溶作用。

由于参照优选的实施例描述了本发明，因此对本领域技术人员很明显，在不背离如权利要求书中所限定的本发明的精神和范围的情况下可以对本发明进行许多变化和修饰。

                         序列表(1)一般信息

(i)申请人：HAN.Sang Kee和SHIN Yoo Cheol

(ii)发明名称：酪蛋白磷肽和包含酪蛋白磷肽的酪蛋白

              以及它们的制备方法

(iii)序列数：1

(iv)通讯地址：

  (A)地址：KON-KUK大学畜牧研究院

  (B)街道：kwangjin-ku

  (C)城市：汉城

  (E)国家：韩国

  (F)邮政编码：133-701   (v)计算机可读形式：

  (A)介质类型：软盘

  (B)计算机：IBM兼容机486

  (C)操作系统：MS-DOS

  (E)软件：MS-DOS EDITOR(2)SEQ.ID NO：1信息

(i)序列特征

  (A)长度：28

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑结构：线性

(ix)性质

  (A)关键词：磷酸化丝氨酸

  (B)位置：15

  (D)其它信息：翻译后磷酸化丝氨酸

(ix)性质

  (A)关键词：磷酸丝氨酸

  (B)位置：17

  (D)其它信息：翻译后磷酸化丝氨酸

(ix)性质

  (A)关键词：磷酸丝氨酸

  (B)位置：18

  (D)其它信息：翻译后磷酸化丝氨酸

(ix)性质

  (A)关键词：磷酸丝氨酸

  (B)位置：19

  (D)其它信息：翻译后磷酸化丝氨酸

(xi)序列描述：SEQ.ID.NO：1Arg-Glu-Leu-Glu-Clu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser1               5                   10                  15Leu-Ser-Ser-Ser-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Cys-Ile-Asn-Lys16           20                     25          28