酰胺化酶基因及其表达活性产物对多肽的酰胺化修饰应用

摘要

本发明涉及一种大鼠来源的酰胺化酶基因及其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的活性表达产物。通过原位杂交及PCR方法，从大鼠脑cDNA库中，筛选到3个大鼠甘氨肽酰化单氧酶(rPAM)基因片段，经点突变、PCR重组技术，拼接出rPAM全酶基因，并构建其真核表达质粒，在CHO细胞中获得活性表达，表达产物可直接用于多肽或蛋白的酰胺化修饰。

说明书

本发明涉及一种酰胺化酶基因的克隆、基因工程活性表达及对蛋白和多肽的C端酰胺化加工。

生物活性肽，包括起远程通讯作用的激素和近程通讯作用的神经递质及营养因子，在生物体内有着很重要的生理作用。这些活性肽在其生物合成中，有一半以上需要在C末端形成酰胺化结构，这对它们的生物活性和稳定性都是极为重要的(Eipper B.A.，et al.，Ann.Rev.Neurosci.，15：57)。在生物体内，酰胺化反应是由酶催化的蛋白翻译后加工过程，参与此反应的α酰胺化酶最早由Bradbury等1982年在猪垂体中发现并纯化，由Glembotski等命名为甘氨肽酰化单氧酶(Peptidylglycine α-amidating monooxygenase，PAM，EC1.14.17.3)。PAM在不同组织中的存在形式多种多样，分子量从38kD到108kD不等，并表现出不同的最适pH值，但它们在结构上仍具有很高的同源性，催化反应都需要适量铜离子、抗坏血酸和分子氧作为辅助因子(Glembotski C.C.，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.，80：5144)。到目前为止，人、牛、大鼠、小鼠和蛙的PAM cDNA均有被克隆(Glauder J.，et al.，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.，169：551；Eipper B.A.，et al.，1987，Mol.Endocrinol.，1：777；Stoffers D.A.，et al.，1991，J.Biol.Chem.，266：1701；Mizuno K.，et al.，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.，148：546；Ohsuye K.，et al.，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.，150：1275)。对它们基因结构及编码氨基酸的序列分析显示，PAM在RNA及蛋白水平上均有多种形式的加工。大鼠中至少有两种主要的mRNA编码的酰胺化酶：PAM-1和PAM-2(图2)，其中最大的蛋白-PAM-1含有信号肽、前导肽、催化结构域、跨膜区以及C端胞质区。PAM是在多肽生物合成中被发现的第一个双功能酶，有两个催化结构域：氧化酶(PHM)和裂解酶(PAL)，生理条件下顺序催化酰胺化的两步反应：甘氨肽在氧化酶的作用下，形成α-羟化甘氨肽中间体；然后在裂解酶的作用下，中间体转化为酰胺化产物和乙醛酸。在大鼠PAM-1 cDNA中，PHM和PAL编码区之间有Exon A(315bp，105a.a.)，其中有一对双碱性氨基酸，在将PAM分为两个独立催化结构域中起作用；PAM-2无Exon A，PHM和PAL连在一起发挥全酶的作用。由于C末端酰胺化残基对许多活性肽的生物活性是极为重要的，而这些多肽大多数又是有效的医药品，如降钙素、胃泌素、生长激素释放因子、神经肽Y、杀菌肽等。它们直接从生物体内分离提取，毕竟来源有限，而用基因工程表达方法生产的多肽，其C端都是以羧基结尾的非酰胺化产物，这些产物与天然结构相比，生物活性显著下降，甚至表现为无生物活性。因此基因工程表达产物的C末端酰胺化则成为一个非常关键性的问题，从而使酰胺化酶的开发研究显得十分必要。PAM可以从含量及活性高的组织中分离纯化，例如血清、人甲状腺、蛙皮、大鼠髓样甲状腺瘤组织及细胞株、猪心房、猪垂体等，这方面国际上已有不少专利报道。但从天然组织中提取酰胺化酶，受到材料来源的限制，而且纯化产物往往带有组织中的蛋白酶的污染，在对多肽的修饰过程中，造成对底物、酰胺化产物以及酶本身的降解。用基因工程方法生产α酰胺化酶，是另一条可行途径。PAM全酶有14个Cys，形成7对二硫键，在大肠杆菌中还未见有活性表达的报道，复性也极为困难。虽然PAM已在多种哺乳动物细胞中得到活性表达(Eipper B.A.，et al.，1991，J.Biol.Chem.，266：7827；Kato I.，et al.，1990，Biochem.Biophy.Res.Commun.，172：197；MainsR.E.，et al.，1991，Mol.Endocrinol.，5：187)，但仅限于基础研究，应用基因工程表达生产PAM并用于多肽的酰胺化修饰方面的工作尚未见报道。

为此，本发明的目的是将克隆的大鼠PAM全酶编码基因，经重组改造，转入基因工程常用的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，经表达得到活性重组酰胺化酶，可直接用于C端为Gly的多肽以及蛋白的酰胺化修饰。

本发明通过噬菌体原位杂交和PCR方法，从大鼠的脑cDNA库中筛选到PAM的三个基因片段(图2中的a，b和c)，经DNA全序列分析，片段a为502bp，编码rPAM N端信号肽、前导肽以及部分成熟蛋白部分；片段b为422bp，编码rPAM的氧化酶结构域PHM的部分序列；片段c为2388bp，包括编码部分氧化酶结构域PHM、全部裂解酶PAL结构域、跨膜区序列、C端胞质区的序列及一部分3′端非翻译序列。

上述三个基因片段部分重叠，跨越rPAM的全酶编码序列，但它们无合适的限制性酶切位点进行重组。本发明通过设计适宜引物，运用新一代PCR重组和点突变，将它们拼接获得编码大鼠PAM全酶的cDNA序列(图3)。片段c中PHM的编码序列用PCR扩增出，并与片段a和b通过PCR重组，获得完整PHM编码序列；通过点突变，在片段c的PHM和PAL编码序列之间，引入BamHI酶切位点，并以之从片段c中分离PAL编码序列；PHM和PAL通过BamHI酶切位点获得大鼠PAM全酶编码序列。由于片段c中无Exon A编码序列，所以拼接获得的基因属于rPAM-2形式，但与已发表的rPAM-2序列(Stoffers，D.A.，et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：735-739)的区别是：PHM和PAL结构域之间编码序列增加了3个核苷酸CCT(图1中方框所示)，创建了一BamHI酶切位点，它利于两个催化结构域分开克隆、表达及各自的功能研究。所编码的PAM在两个催化结构域之间因而增加了一个氨基酸Pro，但并不影响两个催化结构域的功能，表达产物为全酶形式。重组拼接中，还在成熟蛋白N端编码序列(Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-)前设计了限制性酶切位点EcoRI和NdeI(图3中引物2)，NdeI中含起始密码ATG，利于基因在大肠杆菌中表达。

本发明还提供了能在哺乳动物细胞中稳表达PAM全酶的真核表达质粒pSVPAM(图4)。将PAM全酶编码基因，插入pSVK3真核表达载体(Pharmacia公司产品，目录号27-4511-01)中，获得SV40启动子控制下的表达质粒pSVPAM。表达质粒中还含有氨苄青霉素抗性基因，SV40小T抗原剪切位点及ColE1、flori复制起始部位。pSVPAM中插入的PAM基因具有以下特点：含有信号肽、前导肽编码序列，利于分泌表达；含有氧化酶PHM、裂解酶PAL两个催化结构域编码序列，可表达双功能酶，利于多肽的加工修饰和酶学基础研究；含有C端胞质区的编码序列，可用于胞质区功能研究；通过限制性酶切位点，去掉了跨膜区编码序列，利于基因的表达与产物快速分泌。

本发明还提供了转染有上述PAM真核表达质粒并稳定分泌表达活性双功能酰胺化酶的CHO细胞株DGAE(由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，1997年3月5日，保藏编号为CGMCC0294)。大鼠PAM真核表达质粒pSVPAM和带有新霉素抗性基因的真核表达质粒pcDNA1/neo(Invitrogen公司产品，目录号为V492-20)，在脂质体介导下共转染CHO细胞。通过G418筛选和测定培养基上清中酰胺化酶活性，可获得稳定表达高活性大鼠PAM的DGAE细胞株。

通过DGAE获得活性表达产物一具有双功能的重组酰胺化酶。经聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和PAM的特异性抗体的蛋白质印迹(western blot)分析，DGAE的表达产物在细胞内的分子量为84kD和75kD(图5中C所示)，分泌到培养基中的为89kD(图5中S所示)(野生型CHO细胞C0及培养基S0中未检测到抗体结合阳性条带)；DGAE分泌至培养基中的酶活远高于胞内(图6)。重组酰胺化酶可对C末端为Gly的多肽进行酰胺化修饰。如以125I-α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly三肽为底物，其Km为12.5μM，Vmax达180μmol/mg/h(图7)，最适反应pH值约为6.0(图8)，最适铜离子浓度约为1μM(图9)。

本发明还提供了利用重组酰胺化酶对人工合成的甘氨肽和基因工程表达产物进行酰胺化修饰及检测的方法。DGAE表达的酰胺化酶可对多种人工合成的C末端为Gly的肽(如α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly，28肽(Ser-Thr-Pro-Leu-Met-Ser-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ser-Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala-Ala-Val-Gly)及基因工程表达的PABC-hGRF(Gly)(人生长激素释放因子与蛋白A的BC结构域融合表达产物，GRF的C端比天然的多一个Gly)进行酰胺化修饰。对酰胺化产物的检测，本发明建立了毛细管电泳和C端氨基酸分析方法。C末端酰胺化结构相当稳定，很难起化学反应，对其分析鉴定有一定困难。但它与羧基在一定的缓冲液中，能表现出不同的带电性和疏水性。如在pH4.5缓冲液条件下，28肽底物的C端羧基带负电荷，而产物C端酰胺基团不带电荷，这样底物相对多一个负电荷，毛细管区带电泳(CZE)中泳动得比产物慢，两者可以分开(图11中，底物出峰时间为16.54min，而酰胺化产物出峰时间为13.37min)；α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly的酰胺化加工产物为α-N-acetyl-Tyr-Val-NH₂，在碱性条件下，它表现强烈的疏水性，用乙酸乙酯抽提时，98％都进入有机相，而98％未反应底物α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly则在水相中，乙酸乙酯抽提产物可用胶束电动毛细管电泳(MECC)进行分离。图10中A为α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly与失活的酶反应后电泳结果，未观察到产物的生成；B为α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly与重组的活性酰胺化酶反应后，8.69min出现一新峰；而当B样品稀释1倍后与标准的α-N-acetyl-Tyr-Val-NH₂同时进样电泳时(C)，B中生成的新峰与标准产物峰重叠，证明确实为酰胺化产物。对于基因工程表达生产的C末端为Gly的蛋白，分子量较大，对其酰胺化加工产物不便用毛细管电泳方法进行分析鉴定。本发明利用最近建立起来的蛋白C端氨基酸分析技术，只有C末端为游离羧基时，才能在序列分析中起反应，从而测出C端残基；若C端已转为酰胺基团，则被封闭，序列测不出。通过N端序列分析，可首先对底物和反应后产物进行确定和定量，然后将它们的C端序列分析结果进行比较，从而推断酰胺化加工效果。例如，图12所示为基因工程表达的PABC-hGRF(Gly)(A)及其经重组酰胺化酶加工产物(B)的N端测序结果，它们的第一个残基均为Ser，第二个残基均为Leu，N端一致；而将它们等量进行C端测序分析(图13)，PABC-hGRF(Gly)的第一个残基为Gly，第二个残基为Leu(A)，其酰胺化酶加工产物的C端则测不出。

综上，本发明优点如下：所克隆的PAM基因与已发表的序列的区别虽是仅在PHM和PAL结构域之间的编码序列增加了3个核苷酸CCT，但创建了一BamHI酶切位点，它有利于两个催化结构域分开克隆与表达；重组拼接中，还在成熟蛋白N端编码序列(Ser-Phe-Ser-Asn-Glu-)前设计了限制性酶切位点EcoRI和NdeI，NdeI中含起始密码ATG，利于基因在大肠杆菌中表达；编码的PAM在两个催化结构域之间增加了一个氨基酸Pro，但并不影响两个催化结构域的功能，表达产物为全酶形式，利于此双功能酶的酶学基础理论研究；真核表达载体中插入的PAM基因含有信号肽、前导肽编码序列，并去掉了跨膜区编码序列，利于基因的表达、产物快速分泌、产物的稳定性和纯化；C端胞质区是PAM的重要调控序列，表达质粒中保留此部分，可用于胞质区功能研究；利用基因工程常用哺乳动物细胞系CHO进行酰胺化酶的表达，表达量及表达活性都较高，且CHO可以进行悬浮培养，利于酰胺化酶的产业化生产；建立了毛细管电泳分析酰胺化产物的方法，此方法简单、快速，而且避免了同位素操作，如运用多次进样技术，还可大大节省分析时间，适用于大量样品的分析。毛细管电泳分析中，样品损失极少(仅几个纳升)，可作为酰胺化酶酶促反应的监测技术，适用于对酶促条件的摸索：包括反应pH，酶与底物的比例，反应时间等，经毛细管电泳分析后余下的酰胺化加工反应产物，还足够用HPLC及其它分离手段加以分离纯化；C端氨基酸序列分析，可对分子量较大的酰胺化蛋白产物进行鉴定，方法简单易行。

附图说明：

图1是本发明的PAM的DNA核苷酸及相应编码的氨基酸序列。

图2是所筛选的PAM cDNA片段相对全基因的位置及其序列。

图3是PAM的DNA拼接战略

图4是PAM在CHO中的真核表达质粒pSVPAM。

图5是DGAE胞内及分泌至培养基中的蛋白western blot结果。

图6是DGAE胞内及分泌至培养基中的PAM的酰胺化活性分析结果。

图7是DGAE表达的PAM的Km和Vmax

图8是DGAE表达的PAM的酶活力和反应pH值的关系。

图9是DGAE表达的PAM的酶活力和铜离子浓度的关系。

图10是重组酰胺化酶修饰α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly后的毛细管电泳分析结果。A，α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly与失活的酶反应后；B，α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly与重组活性酰胺化酶反应后；C，B样品稀释1倍后与标准的α-N-acetyl-Tyr-Val-NH2同时进样电泳。

图11是重组酰胺化酶修饰人工合成的28肽(Ser-Thr-Pro-Leu-Met-Ser-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ser-Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala-Ala-Val-Gly)后的毛细管电泳结果。A，28肽单独电泳；B，酰胺化酶反应混合物中不加底物的对照；C，28肽经酰胺化酶加工修饰后。

图12是PABC-hGRF(Gly)及其经酰胺化酶加工后产物的N端氨基酸序列分析结果。A，PABC-hGRF(Gly)N端测序结果；B，PABC-hGRF(Gly)经酰胺化酶加工后产物的N端测序结果；

图13是PABC-hGRF(Gly)及其经酰胺化酶加工后产物的C端氨基酸序列分析结果。A，PABC-hGRF(Gly)C端测序结果；B，PABC-hGRF(Gly)经酰胺化酶加工后产物的C端测序结果。

本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1.大鼠PAM cDNA基因片段的筛选和克隆

从大鼠脑cDNA库(Stratagene公司产品，目录号#936515)中，通过噬菌斑原位杂交和PCR方法，筛选和克隆PAM cDNA基因片段。

cDNA库经稀释，使每块150mmNYZ平板上约有30,000个噬菌斑，硝酸纤维素膜印记双份，膜上噬菌体DNA经1.5mol/L NaCl-0.5mol/L NaOH变性，真空下80℃固定2h，然后与[γ-³²P]-dCTP标记的探针杂交16h。PAM探针DNA(图1下划线所示序列)，按随机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)推荐方法进行同位素标记。杂交方法参见《分子克隆实验手册》。收集的阳性噬菌体再稀释铺板，使每块100mm平板上约有450个噬菌斑，进行第二轮杂交筛选，获得单克隆的阳性杂交点。经两轮杂交筛选，获得两个阳性杂交克隆。通过ExAssist helper phage/SOLR系统，将含基因片段的pBluescript(SK-)phagemid从λZAPII载体中切出，并对基因片段进行若干酶谱分析，确定其长度和在全基因中的位置。亚克隆及全序列测定证实，其中一个克隆所含基因片段(图2片段c)5′端从827位开始，3′端终止于3217位，已达3′非编码区，属rPAM-2，即在：PHM和PAL结构域编码序列之间缺失3l5bp(Exon A)。另一克隆所含片段长422bp(图2片段b)，其5′端起始于496位，3′端到917位。为获得496位以前的编码序列，设计合成一对引物：

引物1：5′CTGCGAATTCATGGCCGGACG 3′

引物2：5′GCTTCCAGTTTCTCCTCCAAC 3′其中5′端引物1带有限制性内切酶EcoRI识别位点和编码PAM N端信号肽的若干密码子，PCR扩增基因片段。加2μlλcDNA库于20μl重蒸水中，置70℃水浴保温5min，然后放入冰中冷却。加入10μl 10×PCR缓冲液，8μl2.5mmol/L dNTP，3μl 50mmol/L MgCl₂，两种引物各100pmol，Taq DNA聚合酶2.5单位，使终体积为100μl，在DNA Thermal Cycle 480扩增仪上进行PCR循环。94℃变性、55℃复性、72℃延伸各1分钟，35个循环后，在72℃下延伸15min，最后保温在4℃。用PCR方法从原库中扩增获得～502bp片段(图2片段a)，序列分析证明其编码大鼠PAM N端序列。至此，获得了rPAM全酶编码序列。3个DNA片段相对cDNA全基因的位置如图2。

实施例2.大鼠PAM编码基因的重组拼接如图2所示，自片段a、b、c可拼接获得rPAM的全酶编码序列。因没有合适的酶切位点进行重组，进而设计合成引物，并采用新一代PCR重组技术，将片段进行拼接。引物1同实施例1中的引物1。引物2为5′GAAACTACCGAATTCATATGTCATTTTCC 3′，含EcoRI和NdeI两个酶切位点，其中ATG起始密码由NdeI提供，它们便于表达质粒的构建。ATG后即为成熟的rPAM的第一个氨基酸Ser的密码子TCA。引物3为5′CATGGAAAGGATCCTGCTCTAATAC3′，其中相应增加的3个碱基CCT编码Pro，使在rPHM和rPAL编码区的衔接处构建了一BamH1切点。PCR重组拼接战略如图3。用M13反向引物和正向引物，从含片段b的pBluescript SK+质粒中扩增获得～640bp片段F1；F1与片段a有部分重叠序列，经变性、退火，作一步延伸反应。再用引物1和M13正向引物，扩增出约1000bp的片段a和b的拼接产物F2。同样，以M13反向引物和引物3，从克隆片段c中，经PCR扩增出～480bp的片段F3。F2经EcoRI单酶切后的3′端与F3有90bp的重叠。将两者一起变性，退火后，作一步延伸反应。再加入引物2、引物3，PCR扩增获得～1040bp的片段F4。F4经全序列分析，证明为完整的rPHM成熟肽编码基因。以引物3对rPAM片段c作定向点突变，在其中引入BamHI酶切位点后，再经克隆重组获得rPAL全基因F5。将rPHM和rPAL通过酶切位点BamHI拼接成rPAM全酶基因。

实施例3.大鼠PAM基因在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的克隆和表达

a.大鼠PAM真核表达质粒的构建

来源于大鼠cDNA库并含信号肽、前导肽部分的大鼠PAM 5’端基因片段a，与不含信号肽编码区的PAM全酶编码基因(图3)，通过NdeI酶切位点重组，获得含信号肽编码区全酶编码序列，并去掉跨膜区。将此大鼠PAM基因插入pSVK3真核表达载体中，获得SV40启动子控制下的表达质粒pSVPAM(图4)。

b.稳定表达大鼠PAM的CHO细胞株的建立

大鼠PAM真核表达质粒pSVPAM和带有新霉素抗性基因的真核表达质粒pcDNA1/neo，在脂质体介导下共转染CHO细胞(CHO细胞培养于含10％胎牛血清的F12培养基中，转染按GIBCO BRL公司的LipofectAMINE试剂产品推荐方法)。40h后，培养基中加入G418至终浓度为0.4mg/ml进行筛选。两星期后，转移单克隆细胞群落至96孔板中，细胞扩增后，分别测定各孔培养基中酰胺化酶活性(测活方法在3c中详述)。将活力最高孔中的细胞，再在96孔板中进行亚克隆，重复以上操作，经三轮筛选，获得稳定表达高活性大鼠PAM的CHO细胞株，命名为DGAE。

c.DGAE表达产物的性质分析与鉴定DGAE细胞株长至满瓶，换无血清培养基12h后，收集培养基，离心去除细胞碎片，制备胞外酶样品。贴壁细胞用D′hanks洗一次，刮下细胞，悬浮于20mM Na(TES)，pH7.5/10mM甘露醇/1％Triton X-100溶液中，在液氮中冻融三次，14,000rpm离心15min，吸取上清，Bradford法定蛋白浓度，制备胞内酶样品。

100μl培养基上清与40μg细胞胞内蛋白经SDS-PAGE和western blot检测显示(图5)，胞内与胞外均有明显的能与PHM抗血清反应的表达产物。胞外培养基上清中的蛋白(S)显示一条约89kD的免疫结合条带，而胞内蛋白(C)显示两条特异免疫结合条带，分别对应84kD和75kD的分子量大小，均比培养基中的要小。这种表达产物的分子量差异，可能因胞内蛋白酶的作用，PAM C端KK和(或)RK双碱性氨基酸处的不同裂解形式而产生。胞内、胞外产物均为全酶，含有氧化酶和裂解酶两个催化结构域。

以1251标记的α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly三肽为底物，检测表达产物的酰胺化酶活力。碘标采用IODO-GEN法。40μl酶活测定反应体系中，含有25μM底物，1～2μg胞内蛋白样品或10μl培养基上清，120mM Na(MES)pH6.0，1μM CuSO4，1mM抗坏血酸，0.5mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-Ethylmaleimide，NEMI)和0.25mg/ml过氧化氢酶。样品均以双份在37℃保温4h。反应结束，加入10μl 1N NaOH，用0.05％三甲胺饱和的乙酸乙酯抽提。在碱性条件下用乙酸乙酯抽提，酰胺化产物α-N-acetyl-Tyr-Val-NH₂疏水性极强，进入有机相，而未反应底物则溶于水相中。吸取上层有机相，测γ计数。活性测定显示(图6)，转有PAM基因的细胞株DGAE胞内、胞外均有明显的酶活性，远高于对照组未转基因的CHO细胞。毛细管电泳测活结果显示(图10，11)，在不加碱的条件下，表达产物仍能将甘氨肽转化为酰胺化产物，表明DGAE的表达产物为双功能酶。

实施例4.重组酰胺化酶对甘氨肽或蛋白进行酰胺化修饰加工

a.浓缩的含酰胺化酶的无血清培养基10μl分别与8μgα-N-acetyl-Tyr-Val-Gly和160μg人工合成的28肽(Ser-Thr-Pro-Leu-Met-Ser-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ser-Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala-Ala-Val-Gly)保温3～5h后，15,000rpm离心10min，用毛细管电泳分析产物。α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly反应产物用乙酸乙酯抽提后，再用胶束电动毛细管电泳(MECC)方法分析，28肽反应产物用毛细管区带电泳(CZE)方法分析。

CZE电泳条件：电泳缓冲液为25mM磷酸钠缓冲液，pH4.5，真空进样1.0sec(3.5nl)，电压20kV，电流10μA，恒温30℃。MECC电泳条件：电泳缓冲液为15mM磷酸钠缓冲液，pH7.0/70mM SDS，电压20kV，电流25μA。检测波长为214nm。结果，均观察到它们的酰胺化产物生成。

b.另外，还用表达的活性酰胺化酶对基因工程表达的PABC-hGRF(Gly)(人生长激素释放因子与蛋白A的BC结构域融合表达产物，GRF的C端比天然的多一个Gly)，进行酰胺化修饰。0.375mg PABC-hGRF(Gly)与15μl浓缩的含酰胺化酶的无血清培养基在100μl反应体系中(含120mMNa(MES)pH6.0，1μM CuSO₄，1mM抗坏血酸，NEMI 0.5mM和0.25mg/ml过氧化氢酶)37℃保温5h后，凝胶HPLC(缓冲液为0.05M磷酸钠/0.2N NaCl，流速0.7ml/min)分离产物，进行N端和C端氨基酸序列分析。等量的PABC-hGRF(Gly)也经凝胶HPLC后，进行N端和C端序列分析，作为对照。PABC-hGRF(Gly)与其经酰胺化酶加工产物具有相同的N端氨基酸序列(Ser-Leu-)(图12A，12B)，PABC-hGRF(Gly)C端测出为-Leu-Gly(图13A)，与理论相符，而其经酰胺化酶加工产物C端则测不出(图13B)。