枯草芽孢杆菌谷氨酰t-RNA还原酶基因（hemA）和谷氨酰t-RNA合成酶基因（hemL）表达载体的构建及优化

摘要

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，简称ALA)是生物合成四吡咯的前体，而四吡咯是构成生物体必不可少的物质。ALA对人畜无毒性，在环境中易降解、无残留，是一种无公害的绿色农用化学品。在医学领域，ALA可作为抗癌药物的中间体，作为检验铅中毒的主要试剂。1999年12月，美国FDA正式批准ALA为治疗皮肤癌前期的光动力药物，ALA在治疗其它表皮癌症中的应用也得到了越来越多科学家的兴趣。作为第二代光动力药，ALA的显著优点是副作用小、渗透性好、疗效确切、对疾病的适用范围广及价格低等。 本研究以NCBI数据库(M57676)的枯草芽抱杆菌基因组中的hemA和hemL基因序列为模板设计PCR引物，经PCR扩增得到hemA和hemL基因片段，并克隆到pGEM-T-Vector载体上，得到重组质粒pGEM-T-hemA和pGEM-T-hemL。酶切回收hemA和hemL基因片段并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体(pGJ113)的Pglv启动子下游EcoRI和Not1位点间，构建hemA和hemL基因的表达载体pGJ216和pGJ218。将两个表达载体分别电转化至B.subtilis 1A747感受态细胞中，用麦芽糖进行诱导表达，SDS-PAGE凝胶扫描分析显示，目标蛋白HemA和HemL分别占胞内总可溶性蛋白的11％和13％，实现了hemA和hemL基因的高效表达。重组菌B.subtilis(pGJ216)和B. subtilis(pGJ218)的发酵液上清中5-氨基乙酰丙酸含量分别达到26.31 mg/L和24.47mg/L，菌液呈红色，紫外分光光度检测验证显色的为卟啉类物质。试验表明，表达的重组蛋白具有生理活性并促进了枯草芽孢杆菌中5-氨基乙酰丙酸的合成，并且分解代谢途径也加快。 对构建的表达载体pGJ216和pGJ218进行优化，将突变的Pglv启动子-PglvM分别克隆到pGJ216和pGJ218中hemA和hemL基因的上游，替换Pglv启动子，得到表达载体pGJ216M和pGJ218M，将其电转化至B. subtilis 1A747感受态细胞中，用麦芽糖进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示，pGJ216M和pGJ218M的表达蛋白在50 KD附近有一条明显的条带，而对照菌没有明显的蛋白条带，结果表明得到较大量的谷氨酰t-RNA还原酶蛋白和谷氨酰t-RNA合成酶蛋白，并且在枯草芽孢杆菌中实现了高效表达。优化后的表达载体pGJ216M和pGJ218M比表达载体pGJ216和pGJ218的诱导表达效果更好，生成的5-氨基乙酰丙酸含量更多。诱导表达促进了5-氨基乙酰丙酸的生物合成代谢途径，并加快了5-氨基乙酰丙酸的合成速度。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1 5-氨基乙酰丙酸的理化性质

1.2 5-氨基乙酰丙酸的生理作用

1.2.1调节叶绿素的合成

1.2.2提高叶绿素和捕光系统Ⅱ的稳定性

1.2.3提高光合效率

1.2.4影响呼吸作用

1.2.5促进植物组织分化

1.2.6启动细胞过氧化反应

1.2.7生物体内运输

1.3 5-氨基乙酰丙酸的应用

1.3.1 5-氨基乙酰丙酸在农业生产中的应用

1.3.2 5-氨基乙酰丙酸在医学领域的应用

1.4 5-氨基乙酰丙酸的合成方法

1.4.1 5-氨基乙酰丙酸的化学合成方法

1.4.2 5-氨基乙酰丙酸的生物合成途径

1.4.3微生物转化合成5-氨基乙酰丙酸

1.5 5-氨基乙酰丙酸在合成研究中存在的问题

1.5.1化学合成5-氨基乙酰丙酸存在的问题

1.5.2利用光合细菌合成5-氨基乙酰丙酸存在的问题

1.5.3利用大肠杆菌表达系统合成5-氨基乙酰丙酸存在的问题

1.6本试验的目的和意义

第二章试验研究

1.1材料

1.1.1菌种及质粒

1.1.2主要试剂盒

1.1.3生化试剂和化学试剂

1.1.4实验所需各种酶

1.1.5主要仪器设备

1.1.6培养基及溶液的配制

1.2实验方法

1.2.1质粒DNA的提取

1.2.2枯草杆菌基因组DNA的提取

1.2.3 DNA片段的纯化回收

1.2.4反应体系

1.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

1.2.6枯草杆菌电转化感受态细胞的制备及转化

1.2.7蛋白质的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.2.8氨基乙酰丙酸的分析

1.2.9 卟啉类物质的定性检测

2.2结果与分析

2.2.1基因克隆

2.2.2表达载体构建

2.2.3诱导表达

2.2.4诱导表达对ALA合成的影响

2.2.5表达载体优化

2.2.6优化的表达载体对ALA合成的影响

2.3讨论

2.3.1 5-氨基乙酰丙酸合成的研究

2.3.2强启动子PGLV的应用

2.3.3表达载体的优化

2.4结论

本试验的创新点

进一步的研究工作

参考文献

致谢

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