过氧化物酶或过氧化氢的测定方法及测定用试剂

摘要

提供了高灵敏度的过氧化物酶或过氧化氢的测定方法。该过氧化物酶或过氧化氢测定方法是，在过氧化物酶或过氧化氢任何一方对另一方过量的情况下，在过氧化氢存在下，用羟胺化合物捕捉由于过氧化物酶的作用从对位取代的酚类化合物生成的苯氧自由茎，生成稳定的自由基，用电子自旋共振测定所生成的稳定的自由基。

说明书

本发明涉及过氧化物酶或过氧化氢的测定方法，另外本发明还涉及在上述测定方法中使用的过氧化物酶或过氧化氢测定用试剂。

使用鲁米诺(氨基苯二酰肼)等的化学发光法作为迁氧化物酶(以下说明书中称为POD)的测定方法是公知的。为了提高该化学发光法测定的灵敏度，曾提出使用对位取代的苯酚衍生物。例如，曾报道在鲁米诺-H₂O₂-POD化学发光中使用对碘代苯酚可使发光增强(Kricka，etal，Anal.BioChem.，145，96，1985)。  在鲁米诺水溶液中鲁米诺阴离子存在下，由于对位取代酚的氧化作用被转化成二氣半酮(ジァザセミキノン)自由基，再经过几个中间体，生成最终产物3-氯基苯二酸并发光。碘代苯酚(碘代苯酚自由基)作用于鲁米诺，对二氮半酮自由基的生成有促进作用。使用上述原理的免疫测定试剂商品名是amerlite，由日本ュダック·ダィァグノステックス株式会社销售。

另外，在抗坏血酸-H₂O₂-POD中添加对甲甲氧苯酚，使抗坏血酸自由基敏感性提高是公知的(Chance B.)Arch.Biochem.Biophys.，41，389，1952)。对甲苯酚(Ohnishi，T.et.，BioChem，Biophys.Acta，1972，357，1969)，和甲状腺素及类似物(Klebanoff，S.J.，J.Biol.Chem.，234，pp2437-2442，1972)也有可能用于同样的反应。

对位取代酚衍生物使鲁米诺发光增强及抗坏血酸自由基敏感，并由此可用作测定过氧化物酶时的增感剂的原因被认为是由过氧化物酶生成的苯氧自由基作用于鲁米诺和抗坏血酸所进行的电子转移(氧化)反应。但是，即使采用上述使发光增强及自由基敏感的检测方法，过氧化物酶的检测敏感度仍不够充分，特别是，即使基于自由基敏感增加的过氧化物酶的检测敏感度大到10^-3单位/ml，作为酶免疫测定试剂的敏感度还是明显不够的。

本发明的目的是提供一种敏感度高的过氧化物酶或过氧化氢的测定方法，本发明的另一目的是提供一种用于提高过氧化物酶或过氧化氢测定敏感度的试剂。

在用对位取代酚衍生物作为增感剂的场合，所能达到的增感效率，可能依赖于在过氧化物酶的作用下生成的苯氧自由基的寿命。因此，本发明人从作为反应中间体的鲁米诺-自由基和作为反应中间产物抗坏血酸自由基的稳定性和增感作用的关系的实验结果中考虑到，利用不稳定的自由基的上述方法不可能大幅度地提高测定的敏感度，于是深入研究出了产生稳定的苯氧自由基的增感剂，以及将苯氧自由基转变成信号强度更强的稳定的其它类自由基的试剂。

其结果，由于作为增感剂的对位取代酚衍生物生成的苯氧自由基和羟胺衍生物的结合，得到了稳定的信号强度更强的一类自由基，并且当使用了上述羟胺衍生物，将对位乙酰氨基苯酚衍生物作为增感剂使用时，可以使过氧化物酶测定的敏感度大大提高，而且，在同类反应中，使用过量的过氧化物酶，也可以进行过氧化氢的测定。

在上述见解的基础上完成了本发明。

也就是说，本发明的过氧化物酶或过氧化氢的测定方法包括以下步骤：(a)在过氧化物酶或过氧化氢任何一方过量情况下，于过氧化氢存在下，通过过氧化物酶的作用用羟胺化合物捕捉从对位取代的酚类化合物生成的苯氧自由基，从而于生成一类稳定的自由基工序，以及(b)提供一种包括测定上述稳定自由基的电于自旋共振工序。

作为本发明的较好方案，提供了对位取代酚类化合物是如下式1所示的4-乙酰氨茎苯酚衍生物的上述方法。式1(式中R¹，是氢原子或1-6碳原子的烷基，R²是1-6个碳原子的烷基，羟基，1-6个碳原子的烷氧羰基)，以及对位取代的酚化合物是4-乙酰氨基苯酚衍生物的方法；以及对位取代的酚化合物是从4-甲氧基苯酚，4-乙氧基苯酚，4-碘代苯酚，3-(4-羟基苯酚)丙酸(HPPA)，4-羟基苯乙酸，4-羟基马尿酸，对甲苯酚以及铬胺(3-对羟苯基乙胺)其中选择出的一种的上述的方法。

在本发明的另一实施方案中，提供了在过氧化氢和对位取代酚，最好是上述4-乙酰氨基苯酚衍生物存在下，将由于过氧化物酶的作用生成的苯氧自由基捕捉，从而能生成一类稳定的自由基的羟胺化合物构成的过氧化物酶或测定过氧化氢用的试剂。并且提供了在过氧化氢和对位取代酚，最好是上述4-乙酰氨基苯酚衍生物存在下，将由于过氧化物酶的作用生成的苯氧自由基捕捉，能够生成稳定的自由基的苯氧自由基捕捉剂的羟胺化合物。

本发明的羟胺化合物是一种作为测定过氧化物酶或过氧化氢试剂的化合物，它具有在过氧化氢和对位取代酚化合物存在下，将由于过氧化物酶的作用形成的苯氧自由基捕捉，从而生成稳定的自由基的性质。虽然无需拘泥于任何特定的理论，因为这种羟胺化合物能捕获苯氧自由基，生成稳定的NO自由基，由于在电子自旋共振(ESR)装置中这类稳定的自由基能被选择性地检知，因而使有可能以极高灵敏度测定过氧化物酶或过氧化氢，而且，在本发明的说明书中，包括以定性和/或定量分析为目的的所有测定方法。

作为过氧化酶或过氧化氢测定用试剂，所使用的羟胺化合物，只要是能够捕捉苯氧自由基层，生成稳定的自由基种，任何种类的都可以。羟基胺化合物是否具有本发明方法中所具有的特性，按照本发明实施例中所记载的方法，本专业人员可容易地判定。此外，自由基种的稳定性可用自由基寿命和信号强度的经时变化判定。

作为好的过氧化物酶或过氧化氢测定用试剂，可以使用将作为自由基自旋标记剂使用的氮氧化物(硝酸试剂)还原得到的具有上述特性的羟胺化合物。作为原料使用的氮氧化物，可以使用，例如有TEMPO(2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧化物)及衍生物；PRIOXYL及衍生物；PROXYL(2，2，5，5-四甲基吡咯烷氧化物)及衍生物；羟基-PTIO[2-(4-羧基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物)及衍生物；DOXYL(4，4-二甲基-3-噁，唑啉氧化物)及衍生物等。上述化合物均可买到。  (例如参照西格玛″自旋标记和自旋捕获″1943，95年版)容易地制备。或使用例如作为综述的由株式会社同仁化学研究所发表的″原卟啉钠新闻No。1″(渡部德子著)″生物高分子自旋标记法的应用″(1976年)中记载了氮氧化物系列的自旋标记剂及作为原料的氮氧化合物。

适用于本发明的羟胺化合物可以举出从下述化合物：(式中R³是羟基，取代或未取代的氨基(最好是未取代的氨基)，羧基，或1-6个碳原子的烷氧羰基；R⁴是氢原子，1-6个羰原子的烷基(最好是甲基)或肼基；R⁵是羟基，取代或未取代的氨基(最好是1-6个碳原子的烷基羰基取代的氨基或未取代的氨基)，羟基，取代或未取代的氨基甲酰基(最好是未取代的氨基甲酰基)；R⁶是氢原子或1-6个碳原子的烷基(最好是甲基)；R⁷是氢原子或1-6个碳原子的烷基(最好是甲基))中选出的羟胺化合物。

上述好的羟胺化合物，可以将作为自由基自旋标记剂使用的氮氧化合物作为原料通过还原反应来制备，能够具有捕捉苯氧自由基生成稳定的自由基的特性。这类化合物可以按照文献记载的方法，或者根据文献记载的方法适当改变原料或试剂以及经修饰能够很容易地制备出来。而且，例如4-亚肼基甲基-1-羟基-2，2，5，5-四甲基-3-咪唑啉-3-氧化物(HHTIO)可以从市场上买到(ァルドリッチ社No 33，114-7)，必要时可进行精制，稀释等。

作为原料化合物的氣氧化物的还原，例如可以使用抗坏血酸等的稳定的还原剂。另外，虽然有按照还原的方法羟胺基可进一步被还原，生成氨基化合物(RR′NH)的情况，但因为这种氨基化合物用电子自旋共振是检测不出来的，所以即使在本发明的过氧化物酶或过氧化氢测定用试剂中混杂有少量这种氨基化合物，实际上并不会成为问题。一般而言，可以用′H-NMR测定羟胺化合物的纯度。

在本发明方法中，也可以将两种以上的上述羟胺化合物联合使用。作为苯氧自由基捕捉剂及过氧化物酶或过氧化氢测定试剂特别适宜的羟胺化合物的实例如下，但测定用试剂并不被限定于这些化合物。

在本发明方法中使用的对位取代的酚类化合物，至少是对位有任意取代基的酚类化合物，而且，与过氧化物酶催化的过氧化氢的分解反应一起，很容易被转化成相应的苯氧自由基时，对于对位取代酚类的种类无需有特别的限定。这种对位取代的酚类化合物在本发明中是作为过氧化物酶催化的过氧化氢分解反应的增感剂起作用的。对位取代的酚类化合物是否有上述特性，本领域技术人员可以根据实施例中说明的方法予以判定。

上述对位取代的酚类化合物，在间位和或邻位有取代基也是可以的。对于对位取代酚类化合物苯环上存在的对位取代基，以及对位以外的1或2个取代基的种类无特殊限制。有两个以上取代基的情况，各取代基相同或不同都是可以的。作为这种取代基的实例有1-6个碳的烷基。1-6个碳的链烯基，1-6个碳的炔基，1-6个碳的烷氧基，卤素，1-6个碳的卤代烷基，羧基，1-6个碳的羧基烷基，1-6个碳的烷氧羰基，羟基，1-6个碳的羟烷基，取代或未取代的氨基甲酰基，烷基取代或未取代的氨基酸，酰氨基，烷氧羰基氨基等。

作为烷基，链烯基，炔基或烷氧基，直链或支链都是可以的。含不饱和键时，不饱和键在任何位置均可。作为卤素原子，可以是氟，氯，溴，碘中的任何卤原子。具体的对位取代酚类化合物，例如可以举出4-甲氧基苯酚，4-乙氧基苯酚，4-碘苯酚，3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)，4-羟基苯乙酸，4-羟基马尿酸，对甲苯酚及3-对羟苯基乙胺等。

另外，作为本发明方法中较好的对位取代的酚类化合物，可以举出上述用式1表示的4-乙酰氨基苯酚衍生物(式中R¹是氢原子，或1-6个碳原子的烷基，R²是1-6个碳原子的烷基，羧基，1-6个碳原子的烷氧羰基)。基中，特别好的化合物是R¹是氢原子的上述化合物。并且可以举出R¹是氢原子并且R²是CH³，C₂H₅，C₃H₇，COOH，OCH₃，OC₂H₅的化合物。

本发明方法测定的对象可以举出过氧化物酶及和它有同样催化作用的物质例如血红朊等。详细的测定方法在下述实施例中详细说明，但本发明不受实施例说明的限制，本领域的技术人员对于实施例方法和装置作适当的修改和变化，当然可以作出适宜的选择。

实施例

下面用实施例对本发明作进一步的具体说明，本发明的范围不受下述实施例的限制。实施例1：过氧化物酶或过氧化氢测定用试剂的制备

(1)将1g(4.99mmol)羧基-PTIO(2-(4-羧基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-烃氧基-3-氧化物，株式会社同仁化学研究所制造)溶于5ml甲醇中，室温下加入2倍摩尔量的抗坏血酸，搅拌，生成白色沉淀，过滤生成的白色沉淀，用少量甲醇及水洗涤并干燥，得到本发明的过氧化物酶或过氧化氢测定用试剂羧基-PTIOH[2-(2-羧基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-N-羟基-3-氧化物。

(2)将200mg(7.21mmol)羧基-TEMPO(4-羧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物)(ァル ドリッチ制造)溶于2ml甲醇中，加入2倍摩尔量的抗坏血酸，搅拌，生成白色沉淀，过滤出白色沉淀，用少量甲醇和水洗涤并干燥，得到本发明的过氧化物酶或过氧化氢测定用试剂(4-羧基-2，2，6，6-四甲基-1-N-羟基哌啶。实施例2：过氧化物酶的测定

作为测定用缓冲液，使用含有0.015％H₂O₂的0.1MOPS(PH6.5)的缓冲液，用对乙酰氨基苯酚(25mM水溶液)作为基液，作为过氧化物酶测定试剂的羟胺化合物，使用4-亚肼基甲基-1-羟基-2，2，5，5-四甲基-3-咪唑啉-3-氧化物(HHTIO，ァルドリッチ社的50μg/ml的DMSO溶液或者实施例1中(2)的羟胺化合物(羧基-PTIOH)的50μg/ml的DMSO溶液。作为酶液，使用通过0.01MDIPSO缓冲液(PH6.5)调节的10^-4单位/ml的过氧化物酶溶液。

将测定用缓冲液100μl)，超纯水(110μl)，基质液(30μl)，羟胺化合物(10μl)及酶液50μl)混合，室温下反应15分钟后，生成的NO自由基用日本电子社制造的JES-FR80电子自旋共振仪测定。

图1表示测定结果。图中(a)表示羧基-PTIOH的结果，(b)表示HHTIO的结果，上部分是空白的测定结果。从上述结果可以明显看出，在添加对位取代苯酚时，ESP信号强度明显强于空白(不添加过氧化物酶)。ESR的测定条件如下：中心磁场：3346±50高斯；调制磁场：100KHz，1.0高斯，微波输出20mw，放大率100倍，50倍，应答时间：0.1秒。实施例3：用对羟基乙酰苯胺衍生物测定过氧化物酶。

作为对位取代酚类衍生物，使用对羟基乙酰苯胺衍生物，对甲氧茎苯酚，对甲苯酚，甲状腺素，及3-(4-羟苯茎)丙酸(HPPA)，并使用HHTIO作为羟胺化合物，对过氧化物酶进行测定。用含0.015％H₂O₂0.1M的MOPS缓冲液(PH6.5)的作测定缓冲液，用25mM水溶液作测定基质液。作为酶液，使用以0.01MMOPS(PH7.0)缓冲液调整10^-4单位/ml的POD溶液，HHTIO液是用DMSO调整为50μg/ml的溶液。

将POD溶液50μl加到测定缓冲液100μl，基质液30μl，H₂O120μl，HHTIO液10μl中，室温反应30分钟后，用日本电子社制造的JES-FR80电子自旋共振义测定生成的自由基量。ESR的测定条件如下：中心磁场3346±50高斯，调制磁场100KHz，1.0高斯，微波输出20mW，放大率：100倍，50倍，应答时间：0.3秒。结果示于表1(表中增感效率＝峰高/空白)。对羟基乙酰苯胺衍生物显示比其它酚类化合物高的增感效率。

表1

对位取代酚峰高增感效率空白R¹＝H R²＝CH₃R¹＝H R²＝C₂H₅R¹＝H R²＝C₃H₇R¹＝H R²＝COOHR¹＝H R²＝OCH₃R¹＝H R²＝OC₂H₅对甲氧基酚对甲苯酚HPPA3.06106255806071061040510.018.0  203.3  208.3  193.3  20.0  236.8  203.3  135.0  3.0  6.0实施例4；用发色试剂ABTS，OPD和本发明的测定方法的敏感度进行比较。

用广泛用于过氧化物酶测定的代表性发色剂ABTS[2，2′-连氮基-双(3-乙茎-苯并噻唑啉-6-磺酸]及OPD(邻亚苯基二胺)和本发明的测定方法进行比较。在用ABTS测定时，使用添加了日本化药社制造的テナュンザム439kit的基质缓冲液和发色剂，使用将ABTS浓度调整到2.5mg/ml的基质液300μl；在用OPD测定时，使用添加了ァボッド社制造的HBS抗原测定试剂才-スザィムII的OPD片剂一片的OPD溶液加入5ml溶解液使用将OPD浓度调节为3mg/ml的基质液300μl。在每种基质液中加入过氧化物酶溶液(10^-5μ/ml)50μl，室温反应30分钟，在用ABTS测定时，加1000μl水，在用OPD测定时加1N1000μl硫酸，以使反应液淬熄停止反应，分离出1000μl最终反应液，用日立制作所制造的分光光度计U-2000测定OD值，ABTS测定波长为415nm，OPD测定波长为490nm。

用羟胺化合物的本发明方法的测定条件是，除超纯水为160μl，放大率为200倍以外，其它按实施例3方法进行，结果列于表2。另外依本发明方法测定的结果如图2所示。图2中，(a)是羧基-PTIOH的测定结果，(b)是HHTIO的测定结果。在使用ABTS及OPO时，S/N的比值分别是3.0及3.3，在本发明方法中用HHTIO时，S/N是47.6，用PTIO时S/N是15.3，可见本发明测定方法和已往的方法比较有显著高的灵敏度。

表2

试样ABTS(414nm)OPD(490nm)本发明(nm)空白过氧化物酶(10^-5单位/ml)0.0040.0120.0030.0102.5119实施例5

在H₂O₂稀释液(浓度％)100μl中加入DIPSO缓冲液100μl(0.1M，PH7.0)，对乙酰氨基苯酚30μl(20mmol/l)，HHTIO 10μl(1mmol/l)和过氧化物酶溶液50μl(10^-1单位/ml)，室温反应10分钟，用ESR测定生成的自由基量。过氧化物酶比H₂O₂是大大过量的。测定时使H₂O₂稀释液的浓度变化5次(0.625*10^-6％，1.25*10^-6％，2.5*10^-6％，5.0*10^-6％，10*10^-6％)，测定结果如图3和图4所示，图3是各种浓度下ESR信号的波形，图4是浓度与ESR信号之间关系的图示。从图4可明显看出ESR信号强度和过氧化氢浓度显示出正比关系，可以检出浓度为1.25*10^-6％的过氧化氢。ESR的测定条件如下，中心磁场：337.500mT，调制磁场：0.100KHz，0.1mT，微波输出：10mW，放大率200倍，应答时间0.1秒实施例6；对于生物化学检查的应用。

根据本发明实施例5，在过氧化物酶比H₂O₂过量存在时，可以进行H₂O₂的定时测定。在生物检查项目中，由于可以对酶反应生成的H₂O₂进行定量测定，存在将其作为目的成份的定量测定项目。作为这种检查项目可以举出葡萄糖，乳糖，丙酮酸，唾液酸，尿酸，肌酸酐，多胺，总胆甾醇，游离胆甾醇，中性肪脂，磷脂，游离脂肪酸，无机磷等。所以当遇到测定这些检查项目时，可以用本发明的测定方法定量地测定酶反应生成的H₂O₂。

作为本发明应用于生物化学检查的一个例子，以下是将本发明的测定方法用于葡萄糖定量测定的示例。

将MOPS缓冲液(0.1M，PH6.5)100μl，对乙酰氨茎苯酚(20mmol/l)50μl，含已知量葡萄糖的标准物质(100，200，400mg/dl)或控制血清(Moni-Trol I&II，Baxter Diagnostic Inc)1μl，HHTIO(3mmol/l)10μl，过氧化物酶溶液(10^-1单位/ml)50μl，葡萄糖氧化酶(5单位/ml)50μl混合，于37℃搅拌10分钟，加反应终止剂NaN₃(500mmol/l)50μl之后进行ESR测定。

图5(a)是用标准物质得到的ESR信号的波形，图5(b)是用控制血清Moni-TrolI&II得到的ESR信号波形。基于标准物质求出的Moni-TrolI&II的值分别是80mg/dl和235mg/dl，和各控制血清中表示的葡萄糖值十分一致。

以高的灵敏度测定过氧化物酶或过氧化氢，使过去不可能进行的稀薄的(浓度低的)过氧化物酶或过氧化氢的分析成为可能。

附图的说明：图1是；

被苯氧自由基氧化的羟胺化合物的ESR谱图。图中(a)是羧基-PTIOH作羟胺化合物的示例；(b)是用HTIO作羟胺化合物的示例，上部分是空白的测定结果。图2是：

关于过氧化物酶溶液(10^-5单位/ml)的本发明测定方法的S/N值的图示。图中(a)是用羧基-PTIOH作羟胺化合物的示例，(b)是用HHTIO作羟胺化合物的示例，上部分是空白的测定结果。图3是

是实施例5中，过氧化氢浓度的测定得到的ESR波形图。图4是：

是实施例5中过氧化氢浓度和ESR信号强度之间的关系的图示。图5是：

是实施例6中得到的ESR波形图。(a)是用标准物质得到的图形，(b)是用控制血清得到的图形。