猪血中提纯杀菌性/通透性增加蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种从猪血中提取纯化杀菌性/通透性增加蛋白(简秒BPI)的方法。该法为首先将猪血中纯化的PMNL采用冷冻法制取BPI粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化BPI。该法采用的设备简单，条件易控制，耗时短，污染度低，成本低，而且该法获得的BPI经测试其纯化倍数及纯度已能满足临床需求，为其临床应用奠定了基础。

说明书

本发明涉及一种蛋白质的提取纯化方法，尤其是一种从猪血中提取纯化杀菌性/通透性增加蛋白(简称BPI)的方法。

已知BPI是一种存在于人及兔等哺乳动物中性粒细胞(简称PMNL)中的阳性蛋白质，是一种强有力的杀菌物质，具有特异杀灭革兰氏阴性菌及中和内毒素的活性，因此，人们欲从人及兔的PMNL中提取BPI，以期应用于临床，然而传统的BPI提纯方法为：1.将人或兔的纯化PMNL采用研磨法破坏细胞膜，并用0.16N硫酸抽提得粗提液；2.将粗提液经过三次柱层析即葡聚糖G-75或G-50、葡聚糖C-50和葡聚糖G-100得到纯化的BPI。这种提取纯化法存在有不足之处：1.原料资源匮乏，不易得；2.采用研磨法破坏细胞膜，污染度高；3.经过三次柱层析，工作量大，设备条件要求高且不易控制，耗时长达1-2周。由于上述原因，使其成本高，不易得，阻碍了它的价值发挥。

本发明的目的在于提供一种简单、快捷、经济的BPI的提取纯化法。

经研究发现，猪血的PMNL中存在有BPI，它是一带正电荷的蛋白质，它与G-菌外膜的内毒素带负电荷部分有很高的亲和力，这种亲和力大大超过与其他物质的亲和力，而且这种结合中的BPI可被高浓度Mg²⁺所取代下来。

鉴于上述观点，本发明是这样实现的：一种猪血中提纯杀菌性/通透性增加蛋白的方法为首先将猪血中纯化的PMNL采用冷冻法制取BPI粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化BPI。

其中所述BPI粗提液的制取是指将纯化的BPI进行冷冻，反复冻融三次或三次以上，并用0.16N硫酸抽提得PH为4.0的BPI粗提液。

其中所速结合菌体的制法是指将大肠杆菌15菌置于PH4.0的BPI粗提液中，使其J5菌终浓度为5×10⁸cfu/ml，在37℃条件下孵育10-15min，离心收集结合菌体。

其中所述分离蛋白质的条件为将所得结合菌体置于PH4.0的缓冲液中，使结合菌体终浓度为5×10⁹cfu/m1，37℃振荡孵育15min，在4℃，23000×g条件下离心20min，取上清，该上清为分离出的蛋白质。

其中所述的透析、离心条件为将2000倍于上述上清体积的透析液中透析24小时，在4℃，23000×g条件下离心20min得纯化的BPI。

其中所述结合菌体制法中所指的PH4.0缓冲液为200mMMgCl₂/10mMHAc/NaAc。

其中所述透析液是指10mMHAC/NaPH4.0缓冲液。

该方法采用的设备简单，条件易控制，耗时短，时间不会超过48小时；采用冷冻法破坏细胞膜，将污染度降为最低，且较研磨法又节省了人力；猪血价廉易得，使其从原材料及设备均降低了成本，综上所述，这是一种简单、快捷、经济的提纯BPI的方法，从整体上降低了BPI的成本，而且该法获得的BPI经测试其纯化倍数及纯度已能满足临床需求，为其临床应用奠定了基础。

下面结合实施例对本发明作进一步详述：

一种猪血中提纯杀菌性/通透性增加蛋白的方法为：首先将猪血中纯化的PMNL采用冷冻法制取BPI粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化BPI。

其中所述BPI粗提液的制取是指将从猪血中纯化的PMNL进行冷冻，冷冻温度为0℃反复冻融三次，并用0.16N硫酸抽提得PH为4.0的BPI粗提液。

其中所述结合菌体的制法是指将大肠杆菌J5菌置于PH4.0的BPI粗提液中，使J₅菌终浓度为5×10⁸cfu/ml，在37℃条件下孵育10-15min，用离心机在1000rpm×10min条件下离心收集结合菌体。

其中所述分离蛋白质的条件为将所得结合菌体置于PH4.0的200mMMg(Gl₂/10mMHAc/NaHAc缓冲液中，使结合菌体终浓度为5×10⁹cfu/ml，37℃振荡孵育15min，在4℃，23000×g条件下离心20min，取上清，该上清为分离出的蛋白质。

其中所述的透析、离心条件为将2000倍于上述上清的体积10mMHAc/NaACPH4.0缓冲液中透析24小时，在4℃，23000×g条件下离心20min得纯化的BPI。

对所得的BPI与从猪血中PMNL按传统的柱层析法提纯的BPI测试进行对比，得表1：

               表1.两种方法对比表

 蛋白获取量(％) 杀菌活性* 中和内毒素能力 纯化倍数 本发明      0.1    0.75      30.9   103 传统法      0.1    0.08      51.0   170

*：杀菌活性为杀死90％3×10⁷大肠杆菌所需蛋白的毫克数。