固相杂交酶显色反应对基因扩增产物特异性定量测定方法

摘要

本发明为固相杂交酶显色反应对基因扩增产物特异性定量测定方法，该方法使用生物素标记的寡核苷酸引物对靶基因序列进行扩增，然后将扩增产物与经共价键固定在微孔反应板上的寡核苷酸进行分子杂交，通过抗—生物素—过氧化物酶系统反应显色，对靶基因进行定量。

说明书

本发明是一种固相杂交酶显色反应对基因扩增产物特异性定量测定方法，涉及一种对核酸分子进行特异性定量测定的简单方法，属医学科技领域。

对样品中微量核酸分子进行特异性定量测定在生物医学实践中有着非常重要的意义。如，最近证实在艾滋病病毒(HIV)感染中，患者血液中的病毒含量是最重要临床指标，比CD4⁺细胞数能更准确地预测病情发展。而对丙型肝炎毒病感染来说，血液中HCV的含量是影响干扰素治疗效果的两个主要因素之一。这类病毒有两个共同特点，一是在被感染者血中含量低，一般的分子杂交定量方法难于检测到；二是病毒含量在不同个体中差异很大，跨度从10考贝/毫升血液到10^6-7考贝/毫升血液不等，这给对这类病毒进行定量测定造成了很大困难。至今人们已发展了几种微量核酸定量测定方法，从技术路线上分为依赖于基因扩增技术的间接定量法和分子杂交直接定量法。目前基于基因扩增的定量方法，又分内标法和杂交——酶联显色法(或荧光标记)。内标法需要定量参比品，使用不方便并且靠主观判读，至今没有被实际应用。而杂交——酶联法，由于作为杂交探针的寡核苷酸是通过蛋白质介导吸附在微孔反应板上，并对显色系统的选用造成不良影响，使得最终显色光密度值与基因扩增产物的定量对应关系不理想。另一方面，分枝DNA杂交技术，虽然可较好地直接反映被测样品中靶基因序列的浓度，但其检测敏感性较差，最低检测限量为500考贝/毫升。

本发明的目的在于发明一种简便、特异、快速的定量测定方法，应用耐热DNA聚合酶和寡核苷酸引物，进行聚合酶链反应，可将待测样品中含量微少或所占比例少的核酸分子进行特异性扩增，大大易化了对各种来源核酸分子的分析。

本发明通过高效地将寡核苷酸探针共价固化在微孔反应板上，以快速杂交，与生物素标记的寡核苷酸引物的扩增产物杂交等几项技术组合，建立了一种可特异地对微少含量核酸进行定量检测的简单方法。并且通过确定微孔反应板固化探针的序列，可用来进行基因突变及基因型的分析。

共价固化就是将特定的化学物质，与固相物体表面上的活性基团通过共价键相结合。固相分子杂交就是特异性的基因片段，与固相化的核苷酸探针进行的杂交。

本发明的技术特点及所涉及原理：

1、按靶基因片段所含序列或所需突变序列合成适当长度寡核苷酸探针，通过化学反应，定向共价结合于塑料微孔反应板(Covalink Nunc)；

2、用生物素标记的寡核苷酸引物进行DNA聚合酶链反应；

3、扩增产物与固相化寡核苷酸探针杂交；

4、用辣根过氧化物酶标记的抗——生物素行结合显色反应，以光密度值反映相应的靶基因考贝数。

本发明的优点在于：

1、敏感性高：定量反应基因扩增产物，经推算，可测出5—50考贝/反应；

2、特异性高：扩增产物固相杂交，排除了非特异性扩增产物的干扰，检测反应非特异本底低；

3、酶反应产物密度值与靶基因分子模板考贝数有良好的对应关系。

以对血清中丙型肝炎病毒含量定量检测为例：

一、合成HCV5′非编码区特异性寡核苷酸30mer5′末端磷酸化，500—5ng/孔，在50—12.5mM碳二亚胺的作用下，应用10mM 1-Melm，pH7.0的缓冲液，50℃孵育5小时，然后用洗液(2×SSC-0.1％SDS)洗板7次共7分钟，去离子水洗3次，真空抽干密封，4℃存放。

二、取血清50ul，常规抽提RNA，42℃逆转录，应用特异性的5′末端生物素标记的引物，进行聚合酶链反应(94℃30sec，55℃30sec，72℃lmin，35cyc1es，72℃8min延伸)。

三、取扩增产物10ul，95℃变性10分钟，后置冰浴冷却2分钟，加至包被好的微孔反应板中，加杂交液(50％Formamide，5×SSC，1×FPG，25mMKH₂PO₄，0.2％SDS，5％dextran sulfate，200ug/ml  Salmon sperm carrier DNA)至100ul，混匀，37℃杂交60分钟。然后应用上述洗液洗板4次共4分钟。

四、3％小牛血清白蛋白封闭37℃10—20分钟，加辣根过氧化物酶标记的SPavidin，2ug/ml 100ul，37℃孵育30分钟，应用洗液(100mM Tris pH7.4，200mM NaCl，0.3％Tween 20)洗板，4次共4分钟。OPD系统显色，室温避光约15分钟，100ul 2N H₂SO₄终止反应，测OD_492nm光密度值。