具有引起细胞程序性死亡的特征的单克隆抗体

摘要

本发明的目的是提供一种具有引起髓系细胞程序性死亡性质的单克隆抗体。本发明涉及一种具有引起髓系细胞程序性死亡的性质的单克隆抗体及其片段，且涉及产生单克隆抗体的杂交瘤。由于本发明的单克隆抗体可作为抗体特异性的识别引起髓系细胞程序性死亡的抗原，且具有引起髓系细胞程序性死亡的性质，因此可利用这种性质将其作为有效药物用于髓细胞性白血病的治疗领域。

说明书

本发明涉及一种新的具有引起髓系细胞程序性死亡(Apoptosis)的特征，并可做为药物用于治疗髓细胞性白血病的单克隆抗体及其片段，以及与之相关的，产生此单克隆抗体的杂交瘤。

由于本发明提供的单克隆抗体可作为抗体特异性地识别引起髓系细胞程序性死亡的抗原，并具有引起髓系细胞程序性死亡的特性，因此，可利用这一特性将其做为药物用于髓细胞性白血病的治疗领域。

以前，粒细胞集落刺激因子，例如，基因重组粒细胞集落刺激因子(rG—CSF)被认为是主要作为体液因子，刺激粒细胞分化和增生。已有报导在小鼠体内实验中给予rG—CSF，可增强骨髓的造血功能，并可通过脾脏内造血干细胞及各种成血前细胞的增生，显著地引起脾内的髓外造血。这种脾内髓外造血的机制被认为是由于rG—CSF的刺激，改变了脾内的造血微环境，从而增强了造血潜能而引起的血生成过程。

由此，本发明人注意到通过向脾基质细胞给予rG—CSF的阐明脾内造血潜能和向小鼠脾给予rG—CSF建立造血基质细胞系(CF—1细胞)以分析基质细胞在rG—CSF作用下造血潜能增强程度，以及观察这种潜能在造血基质细胞造血中的作用效果，实验结果是认识到体外的集落刺激活动和体内造血干细胞的支持性潜能。〔Blood，80，1914(1992)〕。

但是，虽然已由一些脾基质细胞建立起细胞系(CF—1细胞)，并已由此对其细胞学特点进行考察，但迄今为止，尚未制备出识别其细胞表面抗原的特定抗体，对其特性所知甚少。

因此，本发明人以上述有关脾基质细胞的资料和研究成果为基础，致力于潜心研究一种可识别脾基质细胞的特定抗体，并以脾基质细胞系作为致敏抗原，通过免疫法制备单克隆抗体，从而获得了新的、未报导过的单克隆抗体。

对所获得的单克隆抗体的性质进行检测的结果，本发明人惊奇的发现该单克隆抗体具有引起髓系细胞程序性死亡的性质，从而完成本发明。

本发明的目的是提供一种新的具有引起髓系细胞程度性死亡的性质，并可作为药物用于髓细胞性白血病的单克隆抗体及其片段，以及产生此单克隆抗体的杂交瘤。

本发明的单克隆抗体可极其有效的作为抗体来识别引起髓系细胞程序性死亡〔apoptosis，也称细胞自灭，是一种核染色质DNA以核小体为单位被消化，造成细胞死亡的现象〕的抗原或具有引起髓系细胞程序性死亡的功能。一般而言，髓系细胞包括除淋巴细胞以外的细胞，如中性粒细胞、巨核细胞、成髓细胞、髓细胞、肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞和成红细胞。本发明所提及的髓系细胞的含义与上述相同。迄今为止，尚无具有引起髓系细胞程序性死亡性质的单克隆抗体，因此本发明提供的单克隆抗体定义为包括所有具有引起髓系细胞程序性死亡的性质的单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体的基本制备方法如下述。

即，如本发明的单克隆抗体的制备方法可以是使用从给予过rG—CSF的动物体内提取的脾基质细胞，用常规的免疫法对其进行免疫，利用常规细胞融合的方法对致免疫的细胞进行细胞融合，并利用常规克隆法使融合细胞克隆化。

本发明的单克隆抗体的制备方法更可取的范例是用CF—1细胞系为抗原〔Blood，Vol.80，1914(1992)〕，本发明人利用给予了rG—CSF的动物的脾基质细胞建立了人工培养细胞系，对以哺乳动物如小鼠的骨髓瘤细胞为抗原而致免疫的浆细胞(免疫细胞)进行融合，使得到的融合细胞(杂交瘤)克隆化，从中选取可产生识别上述细胞系的本发明抗体的克隆并进行培养，以重新获得目的抗体。然而这种方法仅是一个示例，例如在这种情况下，不仅上述CF—1细胞系，而且从按照CF—1细胞系的方式得到的从人类脾基质细胞中获取的细胞系均可作为适当的致敏抗原，以制备与上述CF—1细胞系相同方式结合人类髓系靶细胞的抗体。

制备这种单克隆抗体的方法中，用上述抗原进行免疫的哺乳动物并无特别的限制。更值得考虑的是选择适宜用于细胞融合的骨髓瘤细胞，一般可选用的适宜动物有小鼠、大鼠及仓鼠。

免疫按常规的方法施行，例如给哺乳动物腹腔注射脾基质细胞，如上述的CF—1细胞。更具体的说是将一份免疫细胞稀释或悬浮于适量PBS或等张生理盐水，每月分数次给予动物。作为免疫细胞，最好使用在最后一次给予上述细胞系后摘出的脾细胞。

当哺乳动物的骨髓瘤细胞作为异源细胞与上述免疫细胞融合，可形成多种已知的细胞系，其中包括P3(P3×63Ag8.653)〔J.Im-munol.，123，1548(1978)〕，P3—U1〔Current Topics in Micro—bi-ology and Immunology，81，1-7(1978)〕，NS-1〔Eur.J.Im-munol.，6，511—519(1976)〕，MPC—11〔Cell，8，405—415(1976)〕，SP2/0—Ag14〔Nature276，269—270(1978)〕，FO〔J.Immunol.Meth.，35，1—21(1980)〕，S194〔J.Exp Med.，148，313—323(1978)〕和R210〔Nature，277，131—133(1979)〕。

上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合可按照常规的基本方法施行，如Milstein el al法〔Mechods Enzymol.，73，3—46(1981)〕。

更具体的说，上述细胞融合过程可在有融合促进剂存在的普通营养培养基中进行。作为融合促进剂的有聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)，此外，视需要适当加入佐剂如二甲亚砜可增强融合效果。考虑免疫细胞和骨髓瘤细胞的比例，前者的数量为后者的1—10倍为宜。用于上述细胞融合的培养基，包括适于上述骨髓瘤细胞增生的RPMI—1640培养基和MEM培养基以及其它常用于培养此类细胞的培养基，另外可同时使用血清补液如新生小牛血清(FBS)。

细胞融合的操作是将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养基中充分混合，将预热至37℃的PEG溶液加入培养基，PEG的平均分子量为1,000—6,000，通常添加的浓度为约30—60％(W/V)，混合之。然后，依次重复加入适宜培养基的操作，将反应混合物离心并弃去上清液，即形成所需的杂交瘤。

使该杂交瘤通过接种于普通的选择培养基进行筛选，如HAT培养基(含有附加成分次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的培养基)。在HAT培养基中持续培养足够的时间，以使所需杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，一般为几天至几周。然后，按常规的极限稀释分析法对产生目的抗体的杂交瘤进行筛选和单克隆化。制备

如此制得的产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤，可在普通培养基中传代培养或在液氮中保存较长时间。

从杂交瘤中收集本发明的单克隆抗体时，可采用以常规法培养杂交瘤并从上清液获得抗体的方法，或采用给适宜的哺乳动物注入杂交瘤使之增生并从动物腹水中获取抗体的方法。前一种获取抗体的方法适于获得高纯度的抗体，有一种方法适于获取大量抗体。

另外，通过上述方法获得的抗体，可采用常规提纯法如盐析法、凝胶过滤、亲合色谱法进一步纯化。

本发明的单克隆抗体可以是具有后文实施例中所述的固有特性，即具有引起髓系细胞程序性死亡特性的任意一种抗体，只要具有这种特性不论其抗原种类如何均包括在本发明范围。利用此特性，本发明的单克隆抗体可作为药物用于治疗髓细胞性白血病。

不必说，利用本发明的单克隆抗体建立识别引起髓系细胞程序性死亡的特异性体系或利用其特殊性质将其作为药物用于髓细胞性白血病治疗的具体系统的构成，以及其改进和应用，只要将其用常规法付以实践对本领域的技术人员来说也显然属于本发明的范围。

以下说明附图。

图1表示免疫荧光法分析(CF—1细胞，无抗体存在的对照组)。

图2表示免疫荧光法分析的GSPST—1抗体与CF—1细胞结合特征。

图3表示免疫荧光法分析的BMAPT—1抗体与CF—1细胞结合特征。

图4表示免疫荧光法分析(骨髓细胞，无抗体存在的对照组)。

图5表示免疫荧光法分析的GSPST—1抗体与骨髓细胞结合特性。

图6表示免疫荧光法分析的BMAP—1抗体与骨髓细胞结合特性。

图7表示免疫荧光法分析(NFS—60，无抗体存在的对照组)。

图8表示免疫荧光法分析GSPST—1抗体与NFS—60细胞的结合特性。

图9表示免疫荧光法分析(NFS—60，加入大鼠IgG1的对照组)。

图10表示免疫荧光法分析的BMAP—1抗体与NFS—60细胞的结合特性。

图11表示单克隆抗体(BMAP—1)对NFS—60细胞增殖抑制实验。

图12表示单克隆抗体(GSPST—1)对骨髓细胞移植抑制实验。

图13表示单克隆抗体(BMAP—1)对骨髓细胞移植抑制实验。

图14所示说明图〔骨髓标本显微镜像照片(H.E染色)(×400)〕表示给予本发明的单克隆抗体BMAP—1经6日后死亡的骨髓细胞(2)及无抗体存在(1)的对照组。

图15所示说明图(电泳色谱法的迁移照片)表示加入本发明单克隆抗体BMAP—1后观察骨髓细胞DNA的梯状结构。

图16表示TNFa对L929细胞的细胞毒实验。

图17表示单克隆抗体(BMAP—1)的细胞毒实验。

图18表示免疫荧光分析(BWV1，加入大鼠IgG2a的对照组)。

图19表示免疫荧光法分析抗小鼠MHC—I抗原的抗体与BWV1细胞的结合特性。

图20表示免疫荧光法分析(BWV1，加入大鼠IgG1的对照组)。

图21表示免疫荧光法分析的BMAP—1抗体与BWV1细胞的结合特性。

符号说明

a：给予BMAP—1的小鼠胸腺的DNA(24小时)

b：给予BMAP—1的小鼠骨髓的DNA(24小时)

c：给予BMAP—1的小鼠骨髓的DNA(8小时)。

d：给予BMAP—1的小鼠骨髓的DNA(4小时)。

e：未处理的小鼠骨髓的DNA(骨髓细胞)。

f：分子量标记

接下来，根据参考例和实施例对本发明进一步具体说明，但本发明并不仅限于这些实施例。参考例脾基质细胞系的建立及其性质1)脾基质细胞系的建立

将rG—CSF以100μg/kg的剂量连续5日给予C57BL/6J小鼠，取初次培养的脾细胞建立脾基质细胞系。即，给予rG—CSF后，在无菌条件下取其脾脏，在25cm²的塑料瓶(Corning Co.制)中培养6周。使用Isocove改良的Dulbeco培养基(JMDM)(Boehringer-Mannhcim Co.制)，加入10％热灭活的新生小牛血清(FBS)(三光纯药社制、东京)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，在37℃恒温箱内保持CO₂浓度5％，每周两次更换新鲜的培养基。

在融合培养中，粘附性细胞群(基质细胞)通过加入含有0.05％胰蛋白酶加0.02％EDTA(SigmaChemical Co.制)的去Ca、Mg的PBS液从培养瓶中收获，并移至新瓶中。此传代过程每周约重复1—2次。在早期的传代培养(1—10代)中，细胞分裂比率为1/4到1/8，之后的比率约为1/16到1/32。传至约第10代以后，基质细胞成为均一同种的纤维母细胞样细胞。至第20代，以上述方法采集这些基质细胞，并用极限稀释法使细胞进一步克隆化；将细胞克隆化过程重复二次以建立基质细胞系(CF—1细胞系)。

之后，这些细胞被保存在补加有10％热灭活FBS、含5mlIMDM的25cm²瓶中(Corning Co.制)，每5天按1/32的细胞分裂比率传代一次。脾基质细胞系可由除小鼠外的其他哺乳动物建立，如通过与上述相同的方法，用SV—40腺病毒作媒介使细胞转化可建立人类脾基质细胞系。〔J.Cell.Physiol.，148，245(1991)〕。2)CF—1细胞的性质

以上述方法建立的CF—1细胞系采取标准细胞化学技术，以碱性磷酸酶、酸性磷酸酶，β-葡萄糖醛酸酶、α-萘基乙酸酯酶和油红O检验。也可采用酶免疫组织化学的方法使用下列单克隆及多克隆抗体研究CF—1细胞的性质：macI(Sero Tec.制)；第VIII因子相关抗原(Dakopatts制)；和I型胶原、III型胶原及纤粘连蛋白(Chemicon International Inc.制)。吞噬作用可通过乳胶珠摄取实验检测(粒子直径：1.09μm；Sigma)。CF—1细胞的脂肪细胞转化潜能测试，可在25cm²瓶中传代培养后，与10^-6mol/l的氢化可的松磷酸盐(Sigma制)接触培养四周观察。

结果，CF—1细胞对碱性磷酸酶、第VIII因子相关抗原、mac—I和吞噬实验呈阴性，而对I型胶原、III型胶原和纤粘连蛋白呈阳性。虽然CF—1细胞含有微量脂肪，但在存在10^-6mol/l的氢化可的松的条件下传代培养4周不能转化为脂肪细胞。从这些资料看出，CF—1细胞不具有前脂肪细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞的性质，由此可见不同于上述细胞，CF—1细胞是从基质细胞中提取得到的。3)CF—1细胞对造血干细胞的维持

为了检验造血干细胞是否由CF—1细胞维持，采用Till和Mc-Culloch的技术施行CFU—S实验(脾细胞集落形成实验)。每群10只小鼠用900cGy(MBR—1520R；Hitachi制Tohyo)照射后，并静脉内注射骨髓单个核细胞(BM细胞)(1.0×10⁵/头，5.0×10⁴/头或2.5×10⁴/头)和CF-1细胞(1.0×10⁵/头，在第12天对脾内形成的集落计数，即定为CFU—S集落(脾集落)。

结果，当将骨髓单个核细胞(BM细胞)和CF—1细胞移植入经放射线照射的小鼠，与无CF—1细胞的小鼠相比，每一BM细胞群的脾集落数目显著增加(在1.4—1.8倍之间)，且在移植后的第12天，同时移植有BM细胞和CF—1细胞的小鼠的存活率高于只注入BM细胞的小鼠，呈低死亡率。由此明显看出CF—1细胞对造血干细胞的维持。

下面将对本发明的实施例作具体叙述。实施例单克隆抗体的制备1)抗原和免疫法

以上述参考例中获得的CF—1细胞为抗原进行免疫。细胞培养使用Isocove改良Dulbercco培养基(IMOH)(Bochringer—Mannheim Co.制)补加10％新生小牛血清(FBS；Sanko Junyaku制)，在37℃CO₂浓度为5％的恒温箱内进行。

细胞用1mM EOTA/PBS处理，并用移液管移出培养瓶。将该细胞以细胞数约为1×10⁷/ml悬浮于1mM EDTA/PBS中，给予Wister lmamich大鼠(7周龄，雌性；动物饲养研究实验室)。初次免疫以细胞数约为1×10⁷/ml的细胞悬液1ml对大鼠腹腔注射，1个月后以细胞数约为1×10⁷/ml的细胞悬液1ml追加免疫。然后，间隔1个月以细胞数约为1×10⁷/ml细胞悬液1ml追加免疫数次，直至致免疫大鼠的抗体与CF—1细胞的反应性被确认，则以细胞数约为1×10⁸/ml的细胞悬液1ml作最终免疫。最终免疫后第三天，将大鼠杀死取脾脏。2)细胞融合

将取出的大鼠脾细胞切碎后，游离的脾细胞经离心后悬浮于IMDM培养基(Boehringer—Mannheim Co.制)，并彻底洗净。另一方面，通过在补加有10％新生小牛血清(FBS；三光纯药社制)的IMDM培养基(Boehringer—Mannheim Co.制)中培养小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0—Ag14〔Nature，276，269—270(1978)〕而获得的细胞在上述培养基中以同样的方法洗净，将1×10⁸个该细胞与2×10⁸个上述脾细胞放入离心管混合，使用聚乙二醇4000(半井化学社制)按常规操作(Clin.Eox.Immunol.，42，458—462(1980))施行细胞融合。

然后，将获得的融合细胞分配至含IMDM培养基并补加有20％FBS的96孔板，在CO₂浓度5％，37℃恒温箱内培养。第二天，缓慢改用HAT选择培养基继续培养。

培养开始后，每周两次将上清液转移至新的HAT培养基继续培养以维持细胞增生。

接着，用极限稀释法按常规操作使获得的融合细胞克隆化。即，利用上述融合细胞上清液中的抗体，检验其与抗原结合的性质，从而采用极限稀释法按常规操作将与抗原有强结合性的细胞系克隆出来。3)筛选

融合细胞的筛选是采用间接荧光抗体技术用流式细胞计数(Flow Cytonretry)的方法进行。

以CF—1细胞作为靶细胞对产生目的抗体的克隆进行筛选。即，将悬浮于反应缓冲液(PBS，加入2％FBS和0.02％NaN₃)的细胞离心并以小丸状回收，然后悬浮于100μl杂交瘤培养上清液(约1×10⁶/100μl)在4℃反应1小时。之后用上述缓冲液洗涤一次，加入FITC标记的羊抗大鼠IgG(Fc)抗体(Chemicon制)孵育1小时。洗涤一次，用流式细胞计数器(FACScan，Beclon Dickin—Son制)进行分析。4)抗体的提纯

按上述3)的方式筛选出的融合细胞，用常规方法培养，并用常规方法将其上清液中产生的抗体分离提纯。

即，将从对上述致敏抗原高效价的孔中回收的杂交瘤分散在组织培养塑料皿(Corning Co.制中，在5％CO₂，37℃条件下培养、增生，按常规方法纯化以获得单克隆抗体GSPST—1和BMAP—1。

GSPST—1，是通过将所得细胞腹腔注射给BALB/cAJc1—nu裸鼠(8周龄，雄性，日本Kurea制)。10—14天后回收所产生的腹水，用33％硫酸铵盐析，用PBS透析。BMAP—1抗体，在补加10％FBS的Isowve改良MEM培养基中大量培养，取上清液浓缩，用33％硫酸铵盐析，用PBS透析，用蛋白A配套柱(Amersham制)再次纯化，用PBS透析。此外，上述实施例中记述的是将CF—1细胞作为抗原进行免疫的实例，但也有可能利用其它对造血干细胞具有支持潜能的基质细胞的同样的方法建立单克隆抗体，本发明并不仅限于上述单克隆抗体而是包括具有同样性质的所有单克隆抗体及所有产生单克隆抗体的杂交瘤。

本发明的产生单克隆抗体BMAP—1的杂交瘤是一种新的，以Wistar Imamich大鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0—Ag14为亲代细胞的融合细胞，于1993年8月9日以BMAP—1(大鼠小鼠杂交瘤)为名按照国际认可的微生物委托布达佩斯条约，委托国际局，在日本工业科学技术院生命科学及人类技术研究所〔地址：日本国茨城县つくば市(邮编号305)〕办理登记手续，登记号为FERM BP—4382。5)抗体的性质(i)抗体的反应性(对CF—1细胞的反应性)

免疫荧光法(Immunofluorescence analysis)检测所获得的单克隆抗体GSPST—1和BMAP—1对CF—1细胞的反应性，结果见于图1—图3。这里，图1显示无抗体存在的对照组的分析结果，图2显示GSPST—1与CF—1细胞结合特性的分析结果，图3显示BMAP—1与CF—1细胞结合特性的分析结果。在图中，纵轴表示相对细胞数，横轴表示荧光强度。

从图1—图3中可明显看出单克隆抗体GSPST—1和BMAP—1具有与CF—1细胞结合及识别CF—1细胞表面抗原的性质。(对骨髓细胞的反应性)

接下来，使用流式细胞计数器(FACScan，Becton Dickinson制)检测GSPST—1和BMAP—1对普通骨髓细胞的反应性，结果见于图4—图6。这里，图4显示无抗体存在的对照组的分析结果，图5显示GSPST—1与骨髓细胞结合特性的分析结果，图6显示BMAP—1与骨髓细胞结合特性的分析结果。在图中，纵轴表示相对细胞数，横轴表示荧光强度。

从图4—图6中显示GSPST—1完全没有与骨髓细胞结合的性质，而BMAP—1具有与所有骨髓细胞结合的性质。(对髓细胞性白血病细胞系(NFS—60)的反应性)

使用流式细胞计数器(FACScan，Becton Dickinson制)检测GSPST—1和BMAP—1对NFS—60细胞〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，6687—6691(1985)〕的反应性，结果见于图7—图10。这里，图7显示无抗体存在的对照组的分析结果，图8显示GSPST—1与NFS—60细胞结合特性的分析结果，图9显示使用市售的大鼠IgG1(Zymed制)的对照组的分析结果，图10显示BMAP—1与NFS—60结合特性的分析结果。图中，纵轴表示相对细胞数，横轴表示荧光强度。

从图7—图10中显示GSPST—1不与NFS—60细胞反应，而BMAP—1具有与NFS—60细胞结合的性质。(BMAP—1抑制NFS—60细胞增殖的实验)

在存在100ng/ml G—CSF和10^-9M放线菌酮的条件下，按MTT实验检测BMAP—1与NFS—60细胞反应的结果见于图11。使用96孔培养板将浓度为0、10、100ng/ml及1、10、100μg/ml的BMAP—1溶液以10μl/孔加入4×10³/孔/100μl的NFS—60细胞，两日后用MTT法测量存活细胞数。可以看到，如图11所示，NFS—60细胞的增生被BMAP—1显著抑制。(ii)抗体的类型

所获得的单克隆抗体〔使用大鼠的单克隆抗体Ab—ID—Sphit(Zymed制)和生物素标记的小鼠抗大鼠IgG1抗体(Zymed制)〕，可见GSPST—1属IgG2a，BMAP—1属IgG1。(iii)对骨髓移植的抑制潜能

下面用这些抗体进行骨髓移植抑制实验以检测其性质。结果见于图12和图13，BMAP—1具有抑制骨髓移植的作用而GSPST—1没有这种作用。上述结果的获得是通过用致死量的放射线(900cGy)照射C57BL/6J小鼠，通过尾部静脉给予1.0×10⁵/头的骨髓细胞及单克隆抗体，并对脾集落进行计数。需说明的是图13中“未处理组”表示没有给予骨髓细胞的情况。

如图13中所示，进一步证实了BMAP—1在骨髓移植抑制试验中，完全抑制移植，这是由于该单克隆抗体与骨髓细胞反应造成其程序性死亡所致。因此，即，如果将产生BMAP—1的杂交瘤自腹腔给予裸鼠，当其腹水少量积存时，动物即刻死亡。另外，将BMAP—1的50μg头静脉内给药给予普通C57BL/6J小鼠，可见所有骨髓细胞消失，图14中显微照片说明静脉内给予BMAP—1第6日骨髓细胞消失的事实。从显微照片中可见不仅淋巴细胞，而且中性粒细胞，巨核细胞、成髓细胞、髓细胞、肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞及成红细胞(也称骨髓细胞)均消失。另外，将30μg/头BMAP—1给予小鼠，对其骨髓细胞的DNA进行研究，结果如图15所示梯形结构明显可见，这说明上述BMAP—1与骨髓细胞反应引起程序性死亡。

用胃蛋白酶(Sigma制)消化BMAP—1抗体IgG的Fc段，用GPC柱纯化F(ab′)₂，以33.5μg/头(相当于50μg/头完整IgG)静脉内给予C57BL/6J小鼠，结果可见骨髓内的骨髓细胞消失。基于上述事实，表明BMAP—1引起的骨髓细胞死亡，既无抗体依赖细胞的细胞毒作用，也无补体依赖细胞的细胞毒作用参予。

已报导的引起程序性死亡的抗原有细胞表面蛋白Fas抗原，该Fas抗原mRNA的表达已在胸腺、心脏、肝、肺和卵巢内发现，但尚未在骨髓中检测出其mRNA〔J.Immunol.，148，1274—1279(1992)〕，可见BMAP—1所识别的抗原不同于已知的Fas抗原。

此外，为澄清BMAP—1所识别的抗原是否是TNF的受体，使用L—929细胞与TNF反应引起细胞死亡以研究BMAP—1的功能。按小鼠TNFa(Gen—zyme制)的最终浓度为0、1、10、100pg/ml，1、10、100ng/ml及1μg/ml，BMAP—1的最终浓度为0、10、100pg/ml，1、10、100ng/ml，及1，10μg/ml，在附加给予TNFa和BMAP—1的第二天用MTT法对存活的L929细胞数目进行测量。结果如图16、图17所示，TNFa使L—929细胞显著减少，而BMAP—1对I—929细胞无作用。由此可见，BMAP—1所识别的抗原不是TNF的受体。

用流式细胞计数(FACScan，Becton Dickinson)检测BMAP—1所识别的抗原是否是MHCI类抗原，其结果见于图18—图21。图18显示使用大鼠IgG1(Zymed制)的对照组的分析结果，图19显示抗小鼠NHCI类抗原抗体(大鼠IgG2a，BMA制)与BWV1细胞(自BW5147细胞提取的小鼠淋巴瘤)的结合特性的分析结果，图20显示使用大鼠IgG1(Zymed制)的对照组的分析结果，图21显示BMAP—1与BWV1细胞结合特性的分析结果。图中，纵轴表示相对细胞数，横轴表示荧光强度。结果可见BMAP—1不能识别BWV1细胞而MHCI类抗体与BWV1细胞反应。

如上文所述，通过实验进一步说明BMAP—1具有引起髓系细胞程序性死亡的功能；据本发明人所知，迄今尚无如上述的具有引起髓系细胞程序性死亡的单克隆抗体的报导，因此具有此功能的单克隆抗体是本发明人所发现的新的抗体。且由于以BMAP—1为代表的本发明单克隆抗体可以引起高水平表达抗原的髓细胞性白血病细胞程序性死亡，因此利用单克隆抗体引起骨髓细胞程序性死亡的功能，本发明的具有引起髓系细胞程序性死亡的功能的单克隆抗体可作为有效药物用于髓细胞性白血病。

本发明的单克隆抗体已在上述实施例中作了明确的叙述，具有引起髓系细胞程序性死亡性质的本发明单克隆抗体可用上述特定实施例说明，但并不仅仅限于上述实施例而是包括不考虑抗原种类的，具有相同特点和功能，以同样方法制备的所有单克隆抗体。

由于本发明的单克隆抗体可作为抗体特异性识别引起髓系细胞程序性死亡的抗原，且具有引起髓系细胞程序性死亡的性质，因此可利用这种性质将其作为有效药物用于髓细胞性白血病的治疗领域。