用黄青霉支顶孢菌生产头孢菌素C的方法

摘要

描述了一种发酵制备头孢菌素C的方法，其中在发酵期间用一交叉流过滤系统过滤发酵溶液。可补充由发酵器抽出的滤液量。

说明书

含有抗菌素的培养液的后处理通常在达到最大含量后进行。多数情况下，第一步是通过过滤或离心分离除去细胞和固体。此后可通过萃取或吸附进行活性物质富集。纯化后的产物一般随后结晶，并可进而加工成半合成的抗菌素。

在这种逐步法中，可不利地看到许多抗菌素分子如头孢菌素C（CPC）的不稳定性。在发酵期间已有CPC的分解。这不仅可以纯化学地由水浸蚀β-内酰胺环进行，而且可以酶学方式进行，例如通过酯酶（Konecny等人，1973，抗菌素杂志，26，3，135-141）。另外，发酵时还出现一系列付产物，如脱醋酸头孢菌素C（DOCPC）和脱乙酰头孢菌素C（DCPC），在CPC净化时必须将其除去。从而造成了明显的产率损失。

带有聚合膜或陶瓷膜的交叉流过滤系统已经用于处理培养液（Harris等，J.Chem.Techn.Biotechnol.，1988，42，19-30）。至今未看到这种方法可减少头孢菌素C分解的报导。

本发明的任务是找到一种可减少头孢菌素C分解和付产物形成的方法，并可提高单位基质上的产量。

现已令人惊奇地发现，在黄青霉支顶孢菌发酵期间使用交叉流过滤组件，可以提高CPC产率，减少DCPC形成，并可延长生产时间。另外，通过过滤和减少DCPC形成，可大大简化头孢菌素C的处理。

因此，本发明涉及一种CPC的制备方法，其特征是，在发酵过程中用一交叉流过滤系统过滤发酵溶液，并可补充发酵器中取出的滤液量。

黄青霉支顶孢菌（Acremonium    chrysogenum）（支顶孢头孢菌（Cephalosporium    acremonium）及突变体和分辨体（Selektanten），只要它们产生CPC-衍生物，即适用于本发明的方法。

营养溶液含有碳源如蔗糖、玉米淀粉、葡萄糖或蜜糖和氮源如大豆粉、花生粉、麦芽提取物或醋酸铵。

营养介质还含有无机盐如磷酸氢钠、氯化钠、氯化钙、硫酸钙、碳酸钙、硫酸镁或磷酸氯钾。还可向营养介质添加脂肪如油酸甲酯或豆油。此外还可添加微量元素如铁、锰、铜、锌、钴或其金属盐。

黄青霉支顶孢菌（支顶孢头孢菌），优选ATCC    14615，其培养在20至30℃温度下，优选25℃，PH值为5-8，优选7的条件下进行。先在摇瓶中后在发酵器中于搅拌和通入空气或纯氧条件下需氧培养。在发酵器中对该微生物培养120至240小时，优选130至170小时。

作为交叉流过滤系统，可以使用分离极限为超滤至消毒过滤范围的、由聚合物、塑料或陶瓷制成的板型、管型、毛细管、卷绕或空心纤维膜组件。优先使用孔经为0.2μm或4nm的过滤组件。膜材料可用聚砜、聚酰胺、乙酸纤维素、氧化铝、或氧化锆。过滤可连续或间断地进行。过滤从发酵器孕育后2-3天开始，可持续到发酵结束为止。发酵溶液通过过滤面的穿流速度为0.5至20m/s，优选1-10m/s。

可用相应数量的液体补充发酵期间由发酵器抽出的滤液，或者也可在例如通过吸收分离出有用物质后，将滤液送回发酵器。为此，可用泵打入富含相应盐类或其它营养介质成分的水。

没有通过膜渗透过去的流体再循环回发酵器。

发酵器和交叉流过滤系统由相应的管或软管相连通，并在发酵前消毒。对于100l的发酵器，约需0.2m²过滤面积。也可用更大和更小的过滤面。

例1：黄青霉支顶孢菌ATCC    14615的发酵

发酵在下述营养液中进行：

预培养介质    g/l

浸泡谷粒    11.75

乙酸铵    4.5

蔗糖    20.0

CaSO₄·2H₂O>

MgSO₄·7H₂O>

PH7.0（用15%（W）NaOH调节）

发酵介质    g/l

脱脂花生粉    100.0

醋酸铵    6.0

葡萄糖→水合物    5.0

油酸甲酯    5.0

D，L-蛋氨酸    3.0

CaSO₄·2H₂O>

MgSO₄·7H₂O>

CaCO₃5.0

抑泡剂    0.5

分批返回溶液：

葡萄糖→水合物    500.0

D，L-蛋氨酸    24.75

用偏斜地置于试管中的凝固了的洋菜培养基给100ml预培养介质接种（有4个隔板的500ml摇瓶中）。使烧瓶在25至28℃下以每分钟150转（upm）的转速孵化48小时。用该培养基为另一预培养物接种（1000ml介质，5000ml烧瓶，25至28℃，120 upm，58至60小时）。用第二预培养物为一个搅拌发酵器中的601发酵介质接种。发酵在25℃下进行。控制通气，使发酵营养液中的PO²过量20%。

发酵74小时后，开始用过滤面积为0.2m²和孔径为0.2μm的交叉流陶瓷组件（公司Membraflow，a-Al₂O₃）过滤。遵循下列工艺参数：

穿流速度：    2m/s

循环原输送速度：    1500l/h

过滤容量：    2l/h

过滤时间：    68小时

下表列出了不用（A）和用交叉流过滤（B）情况下发酵142小时后的试验结果：

例2

像例1那样进行发酵。表2列出了用交叉流过滤（B）进行发酵167小时后和无过滤的平行发酵进行142小时后中断的结果比较：