一种用牛、马血清制备放免及生化质控物的方法

摘要

本发明为一种采用牛、马血清制备放射免疫和生化测定质控物的方法。本方法以牛血清或马血清为原料，用亲和层析法或离子交换层析法，特异性除去血清中所含的某种待测物或/和干扰测定的激素、生物活性物质、酶、电解质后，作为配制该待测物的生化或放免测定质控物的基质，在其中加入一定量的已知待测物，从而配制成为用放免或生化方法检测该待测物的质量控制品。; 本发明的优点是：原料来源丰富，成本低廉，使用安全。制备方法先进，产品质量稳定可靠。

说明书

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本发明属于生物制品（诊断试剂）的制备方法。所得产品可以作为放射免疫（RIA）和生物化学检测的质控物，是用于监控放免和生化测定准确性所必备的试剂。

目前世界上普遍采用的质控物制备方法，是选择乙肝病毒表面抗原阴性（HBsAg（-））的正常人或病人血清，经简单处理后，进行调配制得。

例如：

中华人民共和国卫生部药品和生物制品检定所（1981）曾用正常人混合血清加10%糖用活性碳搅拌6-8小时，4℃吸附24小时，4000rpm低温离心，取上清液经2kg/cm²氮气加压过滤除菌，得到低T₃、T₄纯品，分装，冻干，制成T₃、T₄放免质控物。

上海市计划生育研究所（1983）制备生殖激素放免质控物，是收集含某种激素较高或较低的人血清，互相调配制成。

近年出现在“剔除”某物质的血清中，加入被测标准物的方法。如英国爱丁堡实验室（1982）采用在人血清中加入少量标记LH和FSH，与过量偶联有豚抗LH和豚抗FSHIgG的琼脂凝胶处理，混合后，过夜。滤取血清，加入过量偶联有羊抗豚IgG琼脂凝胶处理，以去除血清中含有的少量豚抗LH和FSHIgG。此法仍不能完全除去LH和FSH，其血清中含标记的LH和FSH仍有原量的10%。

生物化学检验质控物，近年有报导用动物血清取代人血清作原料者，但是均未采用亲和层析法和离子交换层析法处理血清。

上述方法由于大多采用人血清作原料，大量采集不易，血清均质性差，乙型肝炎表面抗原阳性率高，大批量生产和长期保存困难，成本较高。而且，上述处理方法也不可能特异去除某种待测物或干扰物，因而得不到真正不含某种待测组分的“零”血清，故质控物的质量不高、稳定性差;且处理方法的工艺繁复，所用材料多只能一次性使用。

本发明的目的是：在提高质量，降低成本，保证使用安全的前题下，寻求一种质控物基质材料生产的新材料、新方法。

本发明的要点是：以马血清或牛血清为原料，过滤除菌后，经各种特定的亲和层析或离子交换层析处理，制成不含某种待测物或干扰物的“零”血清，再加入一定量的某种激素、生物活性物质、酶或电解质纯品，配制成包括零、低、中、高浓度该物质的放射免疫或生化质控物。

本发明的优点是：原料来源丰富，成本低，使用安全。制备方法先进，产品质量稳定可靠。

实施例：

一、制取去激素和去生物活性物质血清的工艺流程如下（以去生长激素（hGH）血清的制备为例，参见工艺流程图1、2）。

1、抗hGHIgG的提纯：将抗hGH血清10ml用等体积Tris/Hcl（0.2M.PH8.6含2M/L Nacl）缓冲液稀释，加于SPA-琼脂糖凝胶（SPA-Sepharose 4B）层析柱（1×10cm）分离纯化。用0.1M的相同缓冲液淋洗至无蛋白流出后，用0.05MHAc/Hcl（PH3.0）缓冲液洗脱，收集洗脱液的蛋白峰，立即加入等体积的0.1MH₃PO₄（PH9.0）中和至PH8.6，此即为有活性的特异性IgG（回收率可达80%）。

2、抗hGHIgG-琼脂糖凝胶亲和层析柱的制备：

①用已有技术Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（参见附录1）活化琼脂糖凝胶，在各自适宜的反应条件下与含抗IgG的反应液（5～10mgIgG/ml）按10～30mgIgG/lgm湿胶的比例偶联，制成亲和层析柱。收集偶联前、后液在280nm处作紫外分光测定，按下式计算偶联率和偶联容量：

IgG（gm）＝OD280nm÷1.3×V（ml）

或直接在紫外光检测标准曲线上查得IgG的值（gm）。

偶联容量＝〔偶联前IgG（gm）-偶联后IgG（gm）〕/湿胶（gm）

偶联率＝ (〔偶联前IgG（gm）-偶联后（IgG（gm）〕)/(偶联前IgG（gm）) ×100%

②用此胶装柱（1×10cm），经0.1MTris/HAc（PH7.7）缓冲液淋洗平衡后，用加有微量示踪物的hGH马或牛血清溶液（1ug/ml）10ml（一般不大于柱床体积）过柱层析。同步监测其蛋白峰值、淋洗平衡液和洗脱液的放射性总计数，按下式计算亲和容量：

亲和容量＝ (洗脱峰总CPM)/(（蛋白峰+淋洗液+洗脱峰+洗脱液）总CPM)

×hGH总量＝可去除hGH量/一次层析

一支偶联率为20%（1×10cm）柱，一次可处理血清200ml。

3、去hGH血清的制备：

在正常牛、马血清中加入0.05% NaN₃防腐，经蔡氏滤器过滤除菌后，一次加200ml血清上柱层析，收集层析前后的血清，用RIA法检测，确信层析后Bo/T%升高，hGH为零，NSB/T%基本不变后，方可置4℃贮存备用。层析柱用PH3.0的0.05MHAc/Hcl缓冲液洗脱吸留的hGH，然后以PH7.7的Tris/HAc缓冲液淋洗平衡，置8℃保存（可反复使用）。

二、制取去酶血清工艺过程如下（参见Ⅰ艺流程图3）：

1、特异底物-琼脂糖凝胶亲和层析柱的制备：

①参照上述2①的条件和方法，将特异性酶的底物作为配体，偶联于活化好的琼脂糖凝胶上，同法测定其偶联容量和偶联率。

②用此凝胶装柱，参照2②的方法测定、计算亲和容量和一次可处理的血清量。

2、将牛、马血清参照上述3的方法处理后，过柱层析，取层析前后的血清标本用放免方法或生化方法检测其某种酶的含量，确信其为零后，方可置4℃贮存备用。

三、制取去电解质血清的艺过程如下（参见附录2）：

1、去阴离子血清的制备：

用AE-.DEAE-.QAE-一类的阳离子交换剂装柱（已有技术Ⅳ），将牛、马血清过柱层析，特异性吸留血清中的各种阴离子后，收集层析后的血清，即为去阴离子血清。层析柱用含阳离子的洗脱液洗脱后，经平衡再生，可反复利用。

2、去阳离子血清的制备：

用CM-.phospho或SP-等一类阴离子交换剂装柱（已有技术Ⅴ），参照上述1法层析，收集层析后的血清，即为去阳离子血清。此层析柱用含阴离子的洗脱液洗脱后，经平衡再生，可反复使用。

四、各种放免及生化测定质控物的配制（以配制hGH放免质控物为例）;

用上述去hGH的牛或马血清为基质，稀释WHO第一国际参考标准的hGH冻干品，配成含hGH0.0，2.0，10.0和30.0ng/ml的质控物，分装成0.25ml/支，冻干，即可供出售或使用。

本发明采用马、牛血清为原料，成本下降70～99%，血清均质性好，使用安全。

本发明同时采用亲和层析或离子交换层析法处理血清，既特异地去除了其中所含的各种干扰物，又保留了血清中其它与测定无关的活性成份。因而用RIA法检测层析后的血清，各项质量参数明显提高（表1），且优于用人血清制备的质控物（表2），使用该基质配制的hGH-RIA质控性质稳定，回收率接近理想的回收率（表3）。

表1.层析前后马血清的hGH-RIA测定值（N＝10）

层析前    层析后

NSB/T%    Bo/T%    hGH    ng/ml    NSB/T%    Bo/T%    hGH    ng/ml

3.35±0.43    35.68±1.23    0.0    3.82±0.65    37.26±1.22    0.0

经配对资料T检验，层析前后NSB/T%无显著差异，而Bo/T%升高，有统计学意义（P＜0.05）。

表2.层析前后单-正常人血清与混合马血清比较

层析前    层析后

NSB/T%    Bo/T%    hGH    TSH    Ins.NSB/T%    Bo/T%    hGH    TSH    Ins.

（ng/ml）（μU/ml）（μU/ml）    （ng/ml）（μU/ml）（μU/ml）

马血清    3.39    35.6    -    -    -    5.37    54.73    0.000＜1.6    6.27

人血清  8.84  51.02  0.095    -    -    6.62    53.83  0.028    3.0  26.56

±0.79    ±1.88    ±0.82    ±1.37

表3.hGH质控物大均值、靶值和预期值比较

QC1    ng/ml    QC2    ng/ml    QC3    ng/ml

X±SD CV%X±SD CV%X±SD CV%

预期值    2.00    10.00    30.00

（配制浓度）测定次数

参考靶值  n＝8  1.85±0.14    7.57  10.13±0.82    8.09  31.27±1.17

培训班值  n=11  1.98±0.51  25.76  10.22±0.85  8.32  27.17±3.77  13.88

大均值  n=254  2.13±0.25  11.93  10.35±0.79    7.67    30.81±4.04  13.11

均值  n=273  2.12±0.26  12.36    10.34±0.97    7.71    30.68±3.95  12.86

回收率    106±13%    103.4±9.7%    102.3±13%

＊参考靶值为我室自己检测hGH质控物8次所得均值。

培训班值为两次培训班11组次的学员所测得的均值。

大均值为上述质控物分发到国内17省市22个单位临试用半年，共计254次测定的均值。

附录：

1、已有技术Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ参见LKB（丹麦）公司的产品介绍手册一亲和层析应用及其相关技术（Practical    guide    for    use    in    affinitychromatography）。

已有技术Ⅰ：戊二醛法;

已有技术Ⅱ：双环氧试剂及表氯醇法;

已有技术Ⅲ：二乙烯砜法;

2、已有技术Ⅳ、Ⅴ参见Pharmacia    Fine    Chemicals_离子交换层析的原理和方法（Ion    Exchange    Chromatograph-Principles    and    Methods）

参考资料：

①、付利成等.T₃、T₄放射免疫药盒质量控制血清的建立和应用。中华核医学杂志1982年2卷3期184页。

②、刘世范等，在放射免疫分析中质量控制血清的制备和应用。中华核医学杂志1983年3卷2期116页。

③、W.M.Hunter.Internal    Quality    Control    and    External    Quality    Assessment.In“Radioimmunoassay    Design    and    Quality    Control.”Editor    Jan    I.T.Rorell.Pregamon    Press.1982.

④、北京部队后勤部卫生部检验专业协作组。“质量控制血清的制备与保存”。中华医学检验杂志1979年2卷4期235页。