一种筛选蒲公英耐盐突变体的方法

摘要

本发明公开了一种筛选蒲公英耐盐突变体的方法，通过挑选饱满种子培养获取无菌苗，切片进行愈伤组织诱导，获得胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织依次接种至EMS的液体分化培养基和NaCl的固体分化培养基中筛选获得耐盐试管苗，炼苗移栽使其成活，再移栽到温室大棚中，并结合滨海盐碱原土盆栽耐盐碱鉴定方法获得耐盐蒲公英植株。本发明方法操作简单，效果好，效率高，加速了蒲公英耐盐育种的进程，应用前景非常广泛。

说明书

技术领域

本发明涉及耐盐植物育种技术领域，具体涉及一种筛选蒲公英耐 盐突变体的方法。

背景技术

土壤盐渍化是影响农业生产的主要胁迫因子。我国的盐渍土近1 亿公顷，且盐渍化和次生盐渍化不断扩大，为了确保人类可持续发展， 必须探索有效治理和利用的方法。传统治理办法耗费了大量的资金和 水资源，且收效甚微。多年实践证明，种植耐盐植物是盐碱地改良的 生物学措施之一，是盐碱地改良利用技术中最经济、有效和可持续的 方法，越来越受到人们的重视。但耐盐植物资源、品种短缺，严重制 约了生物学技术改良利用盐碱地的有效性，因此，耐盐植物育种技术 研究得到较快发展。目前，耐盐植物育种的方法有选择育种、杂交育 种、基因工程育种、细胞工程育种、诱变育种等。应用较为广泛的是 细胞工程育种，通过充分利用离体培养过程中广泛的体细胞变异筛选 获得突变体。诱变育种学是近40年来兴起的一门现代育种技术，与 离体培养相结合能丰富突变类型，提高突变频率和育种效率。在离体 条件下，利用诱变技术获得耐盐突变体的方法已经在大麦、小麦、水 稻、小黑麦、甘薯、枸杞、甜橙、河北杨、猕猴桃和杜鹃等十几种植 物上得到了应用。其中发明专利《一种筛选甘薯耐盐突变体的方法》 公开了一种利用⁶⁰Coγ～射线辐射胚性悬浮细胞后经离体培养获得了 甘薯耐盐突变体。

蒲公英为菊科蒲公英属多年草本植物，集食用、药用、绿化美化 环境为一体的多功能型植物，由于它是常异花授粉植物，种性不纯， 而且它的花丝与花柱的周围连接，形成一个管状体，杂交去雄时易损 伤雌性部分，杂交育种不易成功。中国科学院植物研究所开展了药蒲 公英耐盐突变体的筛选工作，发明专利《一种筛选耐盐药蒲公英的方 法及其专用引物》公开了耐盐药蒲公英体细胞变异筛选方法和耐盐检 测专用引物；张新果等在论文《药蒲公英耐1.5％NaCl变异体的筛选 及特性分析》报道了以药蒲公英叶片为外植体诱导的愈伤组织为材 料，采用NaCl溶液作为耐盐鉴定介质(压力选择剂)，耐盐经3个月 继代筛选获得耐1.5％NaCl的愈伤组织，耐盐愈伤组织经4个月的分 化培养和生根培养，通过逐步递升浓度的方法来完成变异体的耐盐鉴 定，获得了耐1.5％NaCl的药蒲公英再生植株。

综上所述，蒲公英耐盐突变体的筛选主要采用体细胞无性变异获 得，变异体的耐盐鉴定主要采用NaCl水溶液；目前利用诱变育种技 术和离体培养相结合筛选耐盐突变体的研究虽然已应用于多种植物 的耐盐育种，但在蒲公英耐盐突变体筛选研究重中尚未见报道。为了 选育出更适合滨海盐碱区种植的蒲公英品种，本发明以营养体较大、 产量高、耐盐性差的一种蒲公英为材料，在建立了该蒲公英叶片离体 培养高频再生技术体系的基础上，利用EMS诱变处理愈伤组织，结 合NaCl胁迫离体筛选方法获得蒲公英耐盐突变体，然后通过盐碱原 土鉴定法对突变体进耐盐鉴定，获得蒲公英耐盐突变体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选蒲公英耐盐突变体的方法，通过 EMS诱变处理叶片愈伤组织、NaCl间断反复胁迫离体筛选和盐碱原 土鉴定相结合，筛选获得蒲公英耐盐突变体的方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种筛选蒲公英耐盐突变体的方法，包括以下步骤：

1)无菌苗培养

挑选饱满种子用75％的乙醇处理30～50s，再用无菌水冲洗3～4 次，用0.1％升汞浸泡10～15min，然后用无菌水冲洗3～4次，接种到 含有7g/L琼脂粉、10g/L蔗糖、pH值5.7～6.0的MS培养基中，在室 温为21～23℃，暗培养30d后获得无菌苗；

2)愈伤组织诱导

取无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm大小的方块，接种到诱导培养 基中，35～40d获得胚性愈伤组织；

3)EMS诱变处理和NaCl胁迫筛选

将胚性愈伤组织接种在含有0.4％浓度EMS的液体分化培养基 中，进行震荡培养2h，用无菌水冲洗干净，转至含有300mmol/L NaCl 的固体分化培养基中，培养28d后，转至不含NaCl的相同培养基中 21d，交替进行，重复2次，选择高3～4cm的小苗，转移到含有 300mmol/LNaCl的MS培养基中，再次进行耐盐筛选，21d后将生长 正常的小苗接种到生根培养基中，7～10天完成生根，获得耐盐试管 苗；

4)耐盐植株获得

将耐盐试管苗先进行闭瓶炼苗7-15d，而后开瓶炼苗5-10d，移 栽至基质为1:1的蛭石和河沙混合物中，使其成活，20-30d后，再移 栽到温室大棚的土壤中。

5)耐盐植株的鉴定

利用土壤全盐含量0.6％左右的盐碱原土盆栽法对获得的耐盐植 株进行耐盐性鉴定，以未经诱变和NaCl筛选的再生植株作对照，筛 选出成活好，长势优，各项生长指标明显优于对照的耐盐植株。

本发明所述的诱导培养基为含0.5mg/L 6～苄氨基嘌呤(6～BA)、 0.2mg/L二氯本氧乙酸(2,4～D)、7g/L琼脂粉和30g/L蔗糖、pH值 5.7～6.0的MS培养基。

本发明所述的液体分化培养基为含1mg/L激动素(KT)、 0.3mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖、pH值5.7～6.0的MS培养基； 固体分化培养基为含1mg/L激动素(KT)、0.3mg/L萘乙酸(NAA)、 7g/L琼脂粉、30g/L蔗糖、pH值5.7～6.0的MS培养基。

本发明所述的生根培养基为含有0.5mg/L萘乙酸(NAA)、7g/L 琼脂粉、30g/L蔗糖、pH值5.7～6.0的MS培养基。

步骤(2)培养条件和步骤(3)分化培养条件为：温度为21～23℃， 每天光照时间为12～16小时，光照设备为白炽灯管，光照强度为 2000lux。

步骤(3)中所述的震荡培养的条件为23℃恒温下，转速70r/min, 光照强度2000lux。

步骤(4)所述的炼苗条件为：自然光照、温度21-23℃、空气湿 度为80～85％。

本发明通过EMS诱变处理叶片愈伤组织、NaCl间断反复胁迫筛 选和滨海盐碱原土鉴定相结合，获得的蒲公英耐盐突变体，能够在土 壤全盐含量0.6％左右的土壤中正常生长，且叶长、叶宽比对照增加 8～10％和5％～8％。

依照以上技术方案，本发明只需要260～280d就能筛选出能够适 应土壤全盐含量0.6～0.8％土壤的蒲公英耐盐突变体，具有操作简单， 效果好，效率高，加速了蒲公英耐盐育种的进程，应用前景非常广泛。

与蒲公英耐盐突变体筛选现有技术相比，本发明具有以下特点：

1)利用EMS诱变处理与NaCl间断反复胁迫离体筛选相结合， 筛选耐盐突变体，变异率高，经历时间短，获得的突变体稳定。

2)利用盐碱原土鉴定法对变异植株进行耐盐性鉴定，比水培、 沙培等方法更切合实际，鉴定结果也更加准确，为耐盐突变体鉴定最 直接最有效的鉴定方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本 发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉 本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变 化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实 质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保 护范围内。

实施例1蒲公英耐盐突变体的筛选

本实施例培养基配置：

诱导培养基：含0.5mg/L 6～苄氨基嘌呤(6～BA)、0.2mg/L二氯 本氧乙酸(2,4～D)、7g/L琼脂粉和30g/L蔗糖、pH值5.7～6.0的MS 培养基。

液体分化培养基：含1mg/L激动素(KT)、0.3mg/L萘乙酸 (NAA)、30g/L蔗糖、pH值5.7～6.0的MS培养基；

固体分化培养基：含1mg/L激动素(KT)、0.3mg/L萘乙酸 (NAA)、7g/L琼脂粉、30g/L蔗糖、pH值5.7～6.0的MS培养基。

生根培养基：含有0.5mg/L萘乙酸(NAA)、7g/L琼脂粉、30g/L 蔗糖、pH值5.7～6.0的MS培养基。

具体试验方法：

1、无菌苗培养

挑选饱满种子用75％的乙醇处理30s，再用无菌水冲洗3次，用 0.1％升汞浸泡12min，然后用无菌水冲洗3次，接种到含有7g/L琼 脂粉、10g/L蔗糖、pH值5.8的MS培养基中，室温21～23℃，暗培 养30d后获得无菌苗。

2、愈伤组织的诱导

取无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm大小的方块，接种到诱导培养 基中，温度为21～23℃，每天光照时间为12～16小时，光照设备为白 炽灯管，光照强度为2000lux，40d后获得胚性愈伤组织。

3、EMS诱变处理最佳剂量和时间的确定

将愈伤组织接种在含有0、0.2％、0.4％、0.6％EMS的液体分化 培养基中，23℃恒温下，转速70r/min，光照强度2000lux，进行震 荡培养1h、2h和3h，转至不含EMS的固体培养基中继续分化培养， 温度为21～23℃，每天光照时间为12～16小时，光照设备为白炽灯管， 光照强度为2000lux，28d后统计胚性愈伤组织的存活率和分化率， 结果表明(表1)，胚性愈伤组织的存活率和分化率都随着处理时间 的增加和EMS浓度增加而降低。EMS浓度0.2％时，对胚性愈伤组 织的伤害不大，存活率都在75％以上，分化率也在70％以上，EMS 浓度达到0.6％时，对胚性愈伤组织的杀伤力极强，即使处理1h，愈 伤组织的存活率、分化率也仅有34.7％和19.2％，EMS浓度0.4％时， 处理1h，愈伤组织存活率和分化率均在60％以上，处理2h，存活率 为47.8％，分化率为57.5％，处理3h时，存活率、分化率为36.2％和 32％，可见0.4％的EMS浓度可以达到愈伤组织致死率接近50％，从 处理时间来看，2h的存活率接近50％，而分化率却不低，为了达到 较好的诱变效果，选取0.4％处理2h为最佳处理剂量和处理时间。

4、NaCl胁迫筛选临界浓度的确定

将胚性愈伤组织接种到含有0、50、100、150、200、250、300、 350mmol/L不同浓度NaCl的固体分化培养基中，温度为21～23℃， 每天光照时间为12～16小时，光照设备为白炽灯管，光照强度为 2000lux，培养28天，观察胚性愈伤组织的存活率和分化率。结果表 明(表2)，胚性愈伤组织的存活率和分化率均随NaCl浓度的增加而 降低，NaCl浓度小于或等于200mmol/L时，对愈伤组织的影响不大， 存活率和分化率均达到50％以上，当NaCl浓度达到250mmol/L，对 愈伤组织的存活和分化产生较大的抑制作用，存活率、分化率仅为 25.3％和30％，当NaCl浓度达到300mmol/L时，愈伤组织的存活率 为6.3％，成活愈伤组织的分化率达到20％，NaCl浓度达到350mmol/L 时，愈伤组织存活率仅为1.3％，已全部失去分化能力。以选择压力 达到足以抑制大多数细胞分裂与生长，又可以保留部分愈伤组织的分 化能力为原则，研究中选取致死率达到90％以上的剂量 (300mmol/LNaCl)为筛选突变体的临界浓度。

表1不同EMS浓度诱变处理对胚性愈伤组织存活率和分化率的影响

表2不同NaCl浓度对胚性愈伤组织存活率和分化率的影响

5、EMS诱变处理和NaCl胁迫筛选

将愈伤组织接种在含有0.4％浓度EMS的液体分化培养基中， 23℃恒温下，转速70r/min,光照强度2000lux，进行震荡培养2h，用 无菌水冲洗干净，转至含有300mmol/L NaCl的固体分化培养基中， 温度为21～23℃，每天光照时间为12～16小时，光照设备为白炽灯管， 光照强度为2000lux，培养28d后，转至不含NaCl的相同培养基中 21d，交替进行，重复2次。选择高3～4cm的小苗，转移到含有 300mmol/LNaCl的MS培养基中，再次进行耐盐筛选，21d后将生长 正常的小苗接种到生根培养基中，7～10天完成生根，获得耐盐试管 苗。

6、耐盐植株获得

将耐盐试管苗在温度21-23℃，自然光下进行闭瓶炼苗12d左右， 再开瓶炼苗8d左右，移栽至基质为1:1的蛭石和河沙混合物中，自 然光照、温度21～23℃、空气湿度为80～85％的条件下培养25d后， 再移栽到温室大棚土壤中。

实施例2耐盐植株的鉴定

利用土壤全盐含量0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％盐碱原土盆 栽法对获得的耐盐植株进行耐盐性鉴定，以未经诱变和NaCl筛选的 再生植株作对照，移栽前记录植株的叶长、叶宽，移栽后30天再次 记录植株的成活率、叶长、叶宽，观察植株长势。

结果表明，土壤全盐含量0.2％的处理中，耐盐植株和对照在成 活率和长势方面基本没有区别；在土壤全含量0.4％处理中，对照植 株的成活率80％左右，耐盐植株基本全部成活，长势上两者无明显区 别；在土壤全含量0.6％处理中，对照植株的成活率下降到45％，叶 片发黄，生长较缓慢，，而耐盐植株成活率达80％以上，长势明显优 于对照，叶长、叶宽分别比对照增加8～10％和5％～8％；在土壤全盐 含量0.8％处理中，对照植株的成活率仅为15％，叶片皱缩萎蔫，生 长极其缓慢，甚至停止生长，而40％耐盐植株仍能够正常生长；在土 壤全盐含量1.0％的处理中，对照植株基本不能成活，16％耐盐植株 仍能生长，但与土壤全盐含量0.8％的处理相比，不论是成活率、叶 长、叶宽等生长指标都有所降低。

因此，筛选到的耐盐植株能够在土壤全盐含量高达0.6-0.8％的土 壤中生长，尤其在全盐含量0.6％左右的土壤中能较好的生长，各项 生长指标明显优于对照，因此通过以上方法能够筛选到蒲公英耐盐突 变体。