快速获得大量小麦双单倍体纯合群体的方法

摘要

本发明公开了一种快速获得大量小麦双单倍体纯合群体的方法，该方法主要以小麦×玉米双单倍体育种技术为基础，通过小麦、玉米分期播种、单倍体诱导、移栽和春化处理、加倍和移栽、冬播处理等关键环节，使小麦幼胚分化出单倍体苗后，不再需要经过越夏处理，当年完成移栽、春化、单倍体植株加倍，当年即可收获小麦双单倍体种子，收获后时间上能够满足再次播种的要求，可以在一年内得到大量小麦纯合群体的稳定新品系，满足下一步新品系鉴定需求，最大限度的利用了自然环境，将小麦双单倍体育种时间由2～3年缩短至1年，加快了小麦育种速度，提高育种效率，缩短育种年限，节约了育种成本。

说明书

技术领域

本发明属于小麦育种技术领域，具体涉及一种快速获得大量小麦双单倍体纯合群体的方法。

背景技术

常规小麦育种技术需要通过亲本选择、有性杂交、后代分离、人工选择、基因纯合、新品系鉴定等环节获得纯合一致的稳定新品系，其中后代开始分离至基因纯合需要6～8年时间，一个新品系的选育流程需要10年左右的时间，耗时费力。

小麦双单倍体育种因其可加速小麦育种进程、缩短小麦新品种的培育时间正逐渐被育种专家和商业化育种企业所采用。小麦双单倍体育种是通过小麦×玉米杂交及杂交后玉米染色体的消失获得小麦单倍体，小麦单倍体及其染色体经过加倍后形成纯合的双单倍体。该技术需要经过亲本选择、有性杂交、小麦与玉米远缘杂交、幼胚培养、染色体加倍、扩繁、新品系鉴定等环节获得纯合一致的稳定新品系。其中幼胚培养、染色体加倍、扩繁等工作，目前普遍使用的方法是通过幼胚培养产生单倍体苗后，移栽至低温温室，经过越夏培养、秋播，等待翌年加倍成双单倍体，然后再经过一年扩繁，这样至少要经过两年的时间，才能得到足够种子量的稳定新品系，进入新品系鉴定环节，在一定程度上影响了育种进程，仍不能适应现今快速选育高产优质多抗的小麦新品种的要求。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的缺陷，提供一种快速获得大量双单倍体纯合群体的方法，当年收获纯合体种子，次年夏收获扩繁后的大量纯合群体，一年时间即可得到稳定新品系，最大限度地利用了自然环境，加快育种速度，提高育种效率，缩短育种年限。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

设计一种快速获得大量小麦双单倍体纯合群体的方法，包括以下步骤：

（1）种植：将小麦杂交种子分三期进行秋播，将甜玉米种子分六期播种于温室中，使小麦与甜玉米的花期相遇；

（2）单倍体诱导：小麦抽穗后2～3d进行人工去雄，套袋隔离，去雄后3d用玉米花粉对小麦逐花授粉，授粉后仍套袋隔离，为保证授粉成功率，间隔24h后再授粉一次；为提高得胚率，在授粉6h后对小麦穗喷施100mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸溶液，间隔24h后再喷施一次2,4-二氯苯氧乙酸溶液；然后将杂交穗的地上部分取下浸入含50g/L蔗糖、8mg/L H₂SO₃和100mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸的混合营养液中，于25℃离体培养杂交穗，并每隔3～4d更换一次混合营养液；

（3）单倍体幼胚的剥离和离体培养成单倍体苗：经9～16d培养后（黄淮地区在4月28日～5月20日），剥出小麦单倍体幼胚，接种于1/2MS培养基上，并置于25℃条件下暗培养10～20d，幼胚萌动后，转入25℃光培养至出单倍体苗；

（4）移栽和春化：待单倍体苗长到4～6cm高、2～3叶龄时分批进行移栽（黄淮地区在5月28日～7月10日），再在3～6℃条件下春化处理30～35d；

（5）加倍和移栽：春化结束将单倍体苗再分批移入13～15℃条件下缓苗5～7d后，进行秋水仙素加倍（黄淮地区在7月15日～9月10日），然后移栽到大花盆中，覆膜保湿，13～15℃补光条件下缓苗生长，促进分蘖；10～15d后揭去薄膜，将苗体移入网室，在30%遮光率下生长2周后移出，自然生长；

（6）收获双单倍体种子：(黄淮地区在9月10～15日陆续)进入抽穗期，将加倍后的单倍体苗移入温室，增温补光，在外界条件发生变化时，为其提供适宜的环境条件；抽穗时，对所有加倍植株的穗子及时套袋隔离，防止异交；(黄淮地区在10月20～25日)待种子陆续成熟后，按株编号分批收获，获得双单倍体种子；

（7）冬播：将收获的双单倍体种子晾干，按顺序编号进行田间种植，播后覆膜，待出苗2叶后去膜，田间加强管理，促进分蘖成穗，提高每个株行产量；

（8）夏收：(黄淮地区在次年5月底至6月中上旬)待小麦进入腊熟末期后，同普通小麦一样收获，按株行混收，即得扩繁后的小麦双单倍体纯合群体，进入常规育种新品系鉴定。

优选的，在黄淮地区，小麦杂交种子的播期分别为10月10～13日、10月25～28日、11月10～13日，甜玉米种子的播期分别为12月25～28日、次年1月5～8日、1月15～18日、1月25～28日、2月5～8日、2月15～18日。制定了准确的时间梯度，确保小麦、玉米花期相遇。

优选的，步骤（2）所述授粉采用饱和滚粉的方式，以提高授粉率，2,4-二氯苯氧乙酸溶液须喷施到小麦颖壳里的柱头上，以饱和不流下为准。

优选的，步骤（2）所述离体培养杂交穗的条件为光照3000Lx 14h/d，相对湿度70%。

优选的，步骤（3）所述光培养条件为光照3000Lx 16h/d，相对湿度70%。

优选的，步骤（3）所述剖出幼胚的方法为：将颖果经70wt%酒精消毒30s，再用10wt%双氧水消毒20min，然后用无菌水冲洗3次，每次5～10min，最后在超净工作台上解剖出幼胚。

优选的，步骤（4）所述移栽的方法为：先炼苗2～3d，然后冲洗掉根部的培养基，将其移栽到盛有基质、蛭石重量比为1:2的小育苗钵中缓苗10～15d。在春化前移栽，10～15d后进行春化，比一般的春化后再移栽更有利于根系的生长，利于培育壮苗，提高秋水仙素加倍成功率。

更优选的，在所述步骤（4）中，移栽前先滴少量无菌水，使培养基在炼苗过程中保持湿润，不易损伤单倍体苗的根系。

优选的，步骤（4）和（5）所述缓苗的条件为光照3000Lx 16h/d，温度13～15℃，覆膜保湿。

优选的，步骤（5）所述加倍的方法为：为防止根系受损，在加倍前一天浇透水；将春化后的麦苗从育苗钵中取出，用水将根部冲洗干净，剪根处理使根长保留到3～4cm，浸入含秋水仙素600 mg/L、二甲基亚砜20g/L和吐温-20 0.5g/L的染色体加倍溶液中，使分蘖节处于溶液液面下2～3cm，在23～25℃避光条件下处理3～4h进行染色体加倍，将处理后的麦苗小水细流冲洗过夜即可，加倍、冲洗时需补充氧气，氧气量以充气时气泡连续冒出，但不造成液体溅出为准。

本发明的积极有益效果：

1.本发明方法将小麦、玉米分别分期播种，保证了两者花期相遇，解决了冬麦区4月份小麦、玉米花期不遇的难题。

2.本发明方法在单倍体诱导时，重复授粉和喷施2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸），显著提高了得胚率。

3.本发明方法的移栽和春化处理使单倍体苗的根数量增加，促进分蘖，提高秋水仙素加倍时的抗损伤能力，同时也完成了小麦必需通过低温春化阶段发育特性的要求，能够从营养生长阶段转入生殖生长阶段。本发明方法的加倍和移栽处理中小水细流冲洗过夜，同时增加氧气量，可以有效减少药剂残留和危害，提高加倍后成活率。

4.本发明方法中的移栽措施有效保证了加倍后双单倍体麦苗正常生长，使及时抽穗和收获。

5.本发明方法的冬播处理使收获的少量小麦双单倍体种子进行扩繁，次年同大田常规小麦同时收获，获得大量纯合种子，显著缩短育种周期，提高育种效率。

综上，本发明方法保证了小麦双单倍体育种的快速实施，单倍体苗不再需要经过越夏处理，当年完成移栽、春化、单倍体植株加倍，当年即可收获双单倍体种子，收获后时间上能够满足再次播种的要求，可以在一年内得到大量小麦纯合群体的稳定新品系，满足下一步新品系鉴定需求，最大限度的利用了自然环境，加快了育种速度，提高育种效率，缩短育种年限，节约了育种成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1（2013～2014年试验）

一种快速获得大量小麦双单倍体纯合群体的方法，包括以下步骤：

（1）种植：在黄淮地区，将小麦杂交种子分三期进行秋播，播期分别为10月10日、10月25日、11月10日；将甜玉米种子于12月25日、次年1月5日、1月15日、1月25日、2月5日、2月15日分期播种于温室中，使小麦与甜玉米的花期相遇；

（2）单倍体诱导：分期种植的小麦于次年4月13～18日间进入抽穗期，分期种植的甜玉米此时也陆续进入散粉期，在小麦抽穗后2d后进行人工去雄，套袋隔离，去雄后3d用新鲜的玉米花粉给小麦逐花授粉（采用饱和滚粉的方式提高授粉率），授粉后仍套袋隔离；为保证授粉成功率，间隔24h再授粉一次，同时为提高得胚率，在授粉6h后对小麦穗喷施100mg/L 2,4-D溶液，间隔24h后再喷施一次2,4-D溶液；授粉后将杂交穗地上部分取下浸入含50g/L蔗糖+8mg/L H₂SO₃+ 100mg/L 2,4-D混合营养液中，25℃离体培养杂交穗（光照3000Lx 14h/d，相对湿度70%），每隔3d更换一次营养液；

（3）单倍体幼胚的剥离和离体培养成单倍体苗：小麦单倍体幼胚经9d发育后（4月28日～5月10日），在解剖镜下进行剥胚，颖果经70%酒精消毒30s，再用10%双氧水消毒20min，无菌水冲洗3次，每次5min，然后在超净工作台上解剖出幼胚，接种于1/2MS培养基上培养；将接种后的幼胚置于25℃条件下暗培养10d，幼胚萌动后，转入25℃光培养（光照3000Lx 16h/d，相对湿度70%）至出苗；

（4）移栽和春化：待单倍体苗长到5cm高、2～3叶龄时分批进行移栽（5月28日～6月30日），使单倍体苗逐渐适应外界条件，炼苗2d，然后冲洗掉根部的培养基，将其移栽到盛有基质+蛭石（比例为1:2）的小育苗钵中缓苗10d（光照3000Lx 16h/d，温度13～15℃，覆膜保湿），再在3～6℃条件下春化处理35d；

（5）加倍和移栽：春化结束后将单倍体苗分批移入13～15℃条件下缓苗5d，进行秋水仙素加倍（7月20日～8月22日）。为防止根系受损，在加倍前一天浇透水。将春化后的麦苗从育苗钵中取出，用水将根部冲洗干净，剪根处理保留根长到3～4cm，浸入由600 mg/L的秋水仙素+20g/L 的二甲基亚砜+0.5g/L 的吐温-20 组成的染色体加倍溶液中，使分蘖节处于溶液液面下2～3cm，在23～25℃避光条件下处理4h进行染色体加倍，将处理后的麦苗小水细流冲洗过夜，加倍、冲洗时需补充氧气。冲洗完成后移栽到直径30cm的大花盆中，覆膜保湿，13～15℃补光条件下缓苗生长，促进分蘖，15d后揭去薄膜，移入网室，在30%遮光率下生长2周后移出，自然生长，加强管理，严防虫害；

（6）收获双单倍体种子：9月15日陆续进入抽穗期，将加倍后的单倍体苗移入温室，增温补光。抽穗时，对所有加倍植株的穗子及时套袋隔离，防止异交。10月25日种子陆续成熟，按株编号分批收获，获得双单倍体种子。

（7）冬播：将收获的双单倍体种子及时晾干，按田间种植顺序编号，人工开沟种植成株行，10cm株距点播，播后覆膜，待出苗2叶后去膜，田间加强管理，促进分蘖成穗，提高每个株行产量。

（8）夏收：次年5月底至6月中上旬，待小麦进入腊熟末期后，同普通小麦一样收获，按株行混收扩繁后群体，进入常规育种新品系鉴定阶段。

实施例2（2012～2013年试验1）

一种快速获得大量小麦双单倍体纯合群体的方法，包括以下步骤：

（1）种植：在黄淮地区，将小麦杂交种子分三期进行秋播，播期分别为10月13日、10月28日、11月13日。将甜玉米种子于12月28日、次年1月8日、1月18日、1月28日、2月8日、2月18日分期播种于温室中，使两者花期相遇；

（2）单倍体诱导：分期种植的小麦于次年4月16～28日间进入抽穗期，分期种植的甜玉米此时陆续进入散粉期；在小麦抽穗后3d进行人工去雄，套袋隔离，去雄后3d用新鲜的玉米花粉给小麦逐花授粉，或采用饱和滚粉的方式提高授粉率，授粉后仍套袋隔离；为保证授粉成功率，间隔24h再授粉一次，同时为提高得胚率，在授粉6h后对小麦穗喷施100mg/L 2,4-D溶液，间隔24h后再喷施一次2,4-D溶液；授粉后将杂交穗地上部分取下浸入含50g/L蔗糖+8mg/L H₂SO₃+100mg/L 2,4-D混合营养液中，25℃离体培养杂交穗（光照3000Lx 14h/d，相对湿度70%），每隔4d更换一次营养液；

（3）单倍体幼胚的剥离和离体培养成单倍体苗：小麦单倍体幼胚经15d发育后（5月2～19日），在解剖镜下进行剥胚。颖果经70%酒精消毒30s，再用10%双氧水消毒20min，无菌水冲洗3次，每次5～10min，然后在超净工作台上解剖出幼胚，接种于1/2MS培养基上培养；将接种后的幼胚置于25℃条件下暗培养18d，幼胚萌动后，转入25℃光培养（光照3000Lx 16h/d，相对湿度70%）至出苗；

（4）移栽和春化：待单倍体苗长到高4cm、2～3叶龄时分批进行移栽（6月1日～7月10日），使单倍体苗逐渐适应外界条件，炼苗3d，然后冲洗掉根部的培养基，将其移栽到盛有基质+蛭石（比例为1:2）的小育苗钵中缓苗15d（光照3000Lx 16h/d，温度13～15℃，覆膜保湿），再在3～6℃条件下春化处理30d；

（5）加倍和移栽：春化结束后将单倍体苗分批移入13～15℃条件下缓苗7d，进行秋水仙素加倍（7月25日～9月5日）；为防止根系受损，在加倍前一天浇透水，将春化后的麦苗从育苗钵中取出，用水将根部冲洗干净，剪根处理保留根长到3～4cm，浸入由600 mg/L的秋水仙素+20g/L 的二甲基亚砜+0.5g/L 的吐温-20 组成的染色体加倍溶液中，使分蘖节处于溶液液面下2～3cm，在23～25℃避光条件下处理4h进行染色体加倍，将处理后的麦苗小水细流冲洗过夜，加倍、冲洗时需补充氧气；冲洗完成后移栽到直径30cm的大花盆中，覆膜保湿，13～15℃补光条件下缓苗生长，促进分蘖；10d后揭去薄膜，移入网室，在30%遮光率下生长2周后移出，自然生长，加强管理，严防虫害；

（6）收获双单倍体种子：9月10日陆续进入抽穗期，将加倍后的单倍体苗移入温室，增温补光；抽穗时，对所有加倍植株的穗子及时套袋隔离，防止异交；10月18日种子陆续成熟，按株编号分批收获，获得双单倍体种子；

（7）冬播：将收获的双单倍体种子及时晾干，按田间种植顺序编号，人工开沟种植成株行，10cm株距点播，播后覆膜，待出苗2叶后去膜，田间加强管理，促进分蘖成穗，提高每个株行产量；

（8）夏收：次年5月底至6月中上旬，待小麦进入腊熟末期后，同普通小麦一样收获，按株行混收扩繁后群体，进入常规育种新品系鉴定阶段。

实施例3（2012～2013年试验2）

一种快速获得大量小麦双单倍体纯合群体的方法，包括以下步骤：

（1）种植：在黄淮地区，将小麦杂交种子分三期进行秋播，播期分别为10月13日、10月28日、11月13日。将甜玉米种子于12月28日、次年1月8日、1月18日、1月28日、2月8日、2月18日分期播种于温室中，使两者花期相遇；

（2）单倍体诱导：分期种植的小麦于次年4月1～28日间进入抽穗期，分期种植的甜玉米此时陆续进入散粉期；在小麦抽穗后2d进行人工去雄，套袋隔离，去雄后3d用新鲜的玉米花粉给小麦逐花授粉，或采用饱和滚粉的方式提高授粉率，授粉后仍套袋隔离；为保证授粉成功率，间隔24h再授粉一次，同时为提高得胚率，在授粉6h后对小麦穗喷施100mg/L 2,4-D溶液，间隔24h后再喷施一次2,4-D溶液；授粉后将杂交穗地上部分取下浸入含50g/L蔗糖8mg/L H₂SO₃100mg/L 2,4-D混合营养液中，25℃离体培养杂交穗（光照3000Lx 14h/d，相对湿度70%），每隔4d更换一次营养液；

（3）单倍体幼胚的剥离和离体培养成单倍体苗：小麦单倍体幼胚经11d发育后（5月3～18日），在解剖镜下进行剥胚。颖果经70%酒精消毒30s，再用10%双氧水消毒20min，无菌水冲洗3次，每次5～10min，然后在超净工作台上解剖出幼胚，接种于1/2MS培养基上培养；将接种后的幼胚置于25℃条件下暗培养12d，幼胚萌动后，转入25℃光培养（光照3000Lx 16h/d，相对湿度70%）至出苗；

（4）移栽和春化：待单倍体苗长到高6cm、2～3叶龄时分批进行移栽（6月5日～7月5日）。打开瓶塞，瓶内滴几滴无菌水，使单倍体苗逐渐适应外界条件，炼苗2d，然后冲洗掉根部的培养基，将其移栽到盛有基质+蛭石（比例为1:2）的小育苗钵中缓苗12d（光照3000Lx 16h/d，温度13～15℃，覆膜保湿），再在3～6℃条件下春化处理33d；

（5）加倍和移栽：春化结束后将单倍体苗分批移入13～15℃条件下缓苗6d，进行秋水仙素加倍（7月28日～8月28日）；为防止根系受损，在加倍前一天浇透水，将春化后的麦苗从育苗钵中取出，用水将根部冲洗干净，剪根保留3～4cm根长，浸入由600 mg/L的秋水仙素+20g/L 的二甲基亚砜+0.5g/L 的吐温-20 组成的染色体加倍溶液中，使分蘖节处于溶液液面下2～3cm，在23～25℃避光条件下处理3小时进行染色体加倍，将处理后的麦苗流水冲洗一晚，加倍、冲洗时需补充氧气。冲洗完成后移栽到大花盆中，覆膜保湿，13～15℃补光条件下缓苗生长，促进分蘖；12d后揭去薄膜，移入网室，在30%遮光率下生长2周后移出，自然生长，加强虫害管理；

（6）收获双单倍体种子：9月15日陆续进入抽穗期，将加倍后的单倍体苗移入温室，增温补光。抽穗时，对所有加倍植株的穗子及时套袋隔离，防止异交；10月23日种子陆续成熟，按株编号分批收获，获得双单倍体种子；

（7）冬播：将收获的双单倍体种子及时晾干，按田间种植顺序编号，人工开沟种植成株行，10cm株距点播，播后覆膜，待出苗2叶后去膜，田间加强管理，促进分蘖成穗，提高每个株行产量；

（8）夏收：次年5月底至6月中上旬，待小麦进入腊熟末期后，同普通小麦一样收获，按株行混收扩繁后群体，进入常规育种新品系鉴定阶段。