斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶 8 基因及其编码的蛋白

摘要

本发明公开了斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因及其编码的蛋白，本发明提供的基因不仅为研究斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8在卵巢发育中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面提供理论基础；其技术要点，该基因序列如SEQ ID NO:1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；属于生物基因技术领域。

说明书

技术领域

本发明公开了斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因及其编码的蛋白，属于生物基因 技术领域。

背景技术

细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可以概括 为两个大的阶段：细胞分裂间期(即G1时期、S时期和G2时期)和细胞分裂期(即M时期)， 在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。

CDK8是细胞核丝氨酸-苏氨酸激酶，功能是与cyclin C结合，作为DNA结合转录因子 和RNA聚合酶II的中介蛋白复合体的重要亚基，参与细胞的转录调节。CDK8与转录起始相 关的TFIIH(cyclin H/CDK7/Mat1复合物)、Med12、Med13、RNAPII等相互作用共同调控 转录的起始。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族，CDKs的激酶 活性取决于结合的细胞周期蛋白(cyclin)和全酶的完整性，cyclin通过与CDKs特异性结合 位点的结合调控底物专一性的CDKs的激酶活性，CDKs主要参与调控细胞周期、转录和神 经元功能，哺乳动物中报道的CDKs约有20种，包括CDK1-CDK19。其中CDK8作为转录 起始过程中重要的调控因子在人的研究中最为广泛和深入，大多集中在肿瘤治疗和细胞信号 通路方面。1995年人们在寻找依赖cyclinC的激酶时确认了CDK8，并通过实验证明CDk8 在生物体内和体外都能够和cyclin C结合，CDK8作为细胞生长调控的中间信号，之后的实 验验证了CDK8在转录调控中的重要作用。近年来CDK8和cyclin C的异常表达经常在各类 人类肿瘤中发现，尤其在结肠和直肠癌中的研究较多。CDK8作为中介蛋白复合体的关键组 分在转录等过程中的作用机理是当前研究的热点。继人CDk8(Homo sapiens，NM_001260.1) 被克隆出来以后，其它物种的CDK8也得到了不同程度的研究，如小鼠(Mus musculus， NM_153599.3)、斑马鱼(Danio rerio，NM_194408.1)、果蝇(Drosophila melanogaster，U33015.1) 等，但在对虾中的研究还较少。

斑节对虾(Penaeus monodon)是世界三大对虾养殖品种之一，人工育种过程中广泛采用 的剪除单侧眼柄的技术会导致亲虾的高死亡率和产卵质量低等问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩 增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因的全表达序列； 此外通过斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因设计荧光定量PCR引物，对细胞周期蛋白 依赖性激酶8在斑节对虾卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中的分布情况进行研究 分析。本发明构建了细胞周期蛋白依赖性激酶8原核表达重组质粒，通过原核表达和亲和层 析技术在体外成功获得重组蛋白。

本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所 示。

该基因的制备方法依次包括下述步骤：

1、总RNA的提取

取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃等组织，并 分别将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对 虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一链的合成

取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3) 1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链， 反应条件：42℃60min，70℃15min。

3、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的PCR扩增、克隆

根据已获得EST序列设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术和半巢式PCR 技术扩增斑节对虾CDK8基因的3′和5′未知序列。在3′RACE中，一扩使用正向引物 K8FSP1(5>CTCCAGAGAGTATTCCTTTCACACG<3)和接头通用引物AP(5> GGCCACGCGACTAGTAC<3)；二扩使用正向引物K8FSP2 (5>GCAGGTCACAAAGGGAATGGTCAAG<3)和接头通用引物AP(5> GGCCACGCGACTAGTAC<3)。在5′RACE中，以K8RSP1 (5>TGCTGACATAGACAATCCAGTGCCT<3)和oligo-dG为引物进行一扩，用K8RSP2(5> GGATGTTTCAACTCTCGCAGCAATG<3)和oligo-dG(5>GGGGGGGGGGGGGGG<3) 进行二次PCR。

4、对斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因的测定

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克 隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行 测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激 酶8基因同源序列。

5、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的分布和表达

提取健康的斑节对虾不同组织(包括卵巢、肝胰腺、脑、心、肠、血和淋巴)以及不同发 育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)操作手册进行反转 录为cDNA模板。将不同组织样品cDNA稀释1倍作为模板，采用SYBR GreenⅠ染料法， 在Roche荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。依照TaKaRaPrimeScriptTM RTPCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行PCR反应。反应体系为10μL，包含5μL 的2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，3μL稀释的模板，各0.2μL正、反引物(10 μmol/L)及1.6μL的双蒸水。每个时间点设置3个重复。反应参数为95℃预变性10s；然 后95℃变性15s，60℃退火延伸20s，共45个循环。使用引物reCDK8-F (5>TGACTTTCGGACTGTTTCGC<3)和reCDK8-R(5>TTCCTTTCCCCTTACGCTTT<3)扩 增目标基因，RTEF-F(5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3)和RTEF-R(5> CGTGGTGCATCTCCACAGACT<3)扩增EF-1α基因作为内参，实验数据采用相对ΔCT法 (2-ΔΔCT法)分析斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因在各样品中的相对表达量。

6、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的体外重组表达

根据已经获得的胞周期蛋白依赖性激酶8开放阅读框(ORF)设计原核表达引物(F： 5>CATATGGATTATGAGTGGAAAGAG<3和R：5>CTCGAGATATCTCTGGCCATGGCTG<3) 扩增目的片段，并与pET21a进行连接。重组质粒用通用引物进行测序。连接和序列正确的单 克隆扩大培养并提取重组质粒。将测序正确的重组质粒PmCDK8/pET21a转入大肠杆菌BL21 (DE3)，将表达菌种以1∶100(V∶V)接入三个200mL新鲜LA液体培养基，在37℃、30℃ 和22℃条件下诱导7h和30℃条件下分别诱导1h、3h、5h、7h、9h、和11h。

7、目的蛋白的纯化和鉴定

取诱导的菌液离心法收集菌体，超声破碎(超4s，歇6s，共15分钟)后10000rpm离心分 离上清和沉淀，沉淀用8M脲素溶解后，用镍柱进行亲和层析，纯化的蛋白经SDS-PAGE检测 结合和洗涤效果。充分脱色后，切取目的条带低温保存，进行质谱分析和鉴定。用垂直电转 仪(Bio-Rad)将SDS-PAGE胶中的蛋白转至硝酸纤维素(NC，MILLIPORE，USA)膜上， 通过预染蛋白Maker转移效果检测目的蛋白的转移情况，然后进行Western blot检验。主要步 骤为：转膜后用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜；次日PBST洗膜三次，每次10min；带有HRP标记 的兔源6×His标签抗体(1∶2000，V∶V，封闭液稀释)中室温孵育60min；PBST洗膜3次， 每次10min后，用HRP/DAB显色试剂盒(天根生物)避光显色。

上述的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示

该基因所编码的蛋白以SEQ ID NO:1的30bp处的起始密码子ATG编码至1458bp处 的终止密码子TGA，编码476个氨基酸序列。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

1、本发明提供的基因不仅为研究斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8在卵巢发育中的作 用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面 提供理论基础。

2、体外重组斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的获得则为从蛋白层面对该基因的功能 机理研究建立了条件，并且为今后相关抗体的制备，相关药物开发等奠定了基础。

3、本发明体外合成的重组蛋白，可以作为催熟剂注射对虾，促进卵巢发育，细胞周期进 程。

附图说明

图1是PmCDK8mRNA在斑节对虾不同组织中的表达；

图2是PmCDK8mRNA卵巢发育各时期表达；

图3是CDK8在不同温度诱导CDK8/pET21a在BL21的表达；

图4是30℃CDK8不同时间诱导CDK8/pET21a在BL21中的表达；

图5是纯化PmCDK8重组蛋白的Western blot分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明 的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要 求保护范围之内。

以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

实施例1

本发明提供的斑节对虾斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。

其制备方法如下

1.总RNA的提取

试验所用的雌雄斑节对虾(鲜重200g左右)均取自于海南三亚，室内水族箱内暂养三天， 水温控制在24～25℃之间。取所需组织约50mg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol(美国invitrogen公 司)进行匀浆，并按以下步骤提取总RNA。

总RNA提取步骤：

(1)加200μL预冷氯仿，涡旋振荡1min混匀，静置5min，12000g，4℃，15min。

(2)取三分之一上清溶液，加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上放置10min， 12000g，4℃，10min。

(3)倒掉上清，加1mL 75％乙醇重悬沉淀，7500g，4℃离心5min。

(4)重复步骤3一次，并用枪头吸出上清，干燥5～10min

(5)加40μLddH2O溶解沉淀

(6)RNA的电泳检测：将电泳槽、梳齿等置于3％H2O2过夜浸泡，配置1.5％的琼脂糖 凝胶(用0.5×TBE溶液配制)，取5μL总RNA加1μL上样缓冲液，进行30min电泳检测，对 提取的RNA质量进行测定。

2.cDNA第一链的合成

cDNA的反转录实验按照相关试剂盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa))操作方法进行。

具体如下：

取上述斑节对虾总RNA与反转录引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)(10 pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链。

轻微混匀，70℃温育10min后冰浴2min，离心数秒后放回冰上

混和均匀并短暂离心；PCR仪42℃反应60min后，70℃，15min取出放置冰上，-20℃保存 备用。

3.对斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因cDNA全序列的克隆

根据已获得EST序列设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplific  ation of cDNA ends，RACE)和半巢式PCR(semi-nest PCR)技术扩增斑节对虾CDK8基因 的3′和5′未知序列。

在3′RACE中，一扩使用正向引物K8FSP1(5>CTCCAGAGAGTATTCCTTTCACACG<3) 和接头通用引物AP(5>GGCCACGCGACTAGTAC<3)；二扩使用正向引物K8FSP2(5>GC AGGTCACAAAGGGAATGGTCAAG<3)和接头通用引物AP(5>GGCCACGCGACTAGTAC <3)。

在5′RACE中，以K8RSP1(5>TGCTGACATAGACAATCCAGTGCCT<3)和oligo-dG 为引物进行一扩，用K8RSP2(5>GGATGTTTCAACTCTCGCAGCAATG<3)和oligo-dG (5>GGGGGGGGGGGGGGG<3)进行二次PCR。(1)一扩PCR反应体系配方：10×Ex T  aq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture(2.5mM)2μL；cycH-F1(10μM)1μL；AP(10μM) 1μL；Ex Taq(5U/μL)0.25μL；MgCL21.5μL；cDNA 1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25 μL。

一扩PCR实验的反应程序如下所示：

(2)二扩PCR反应体系配方：10×Ex Taq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture(2.5mM)2μL； K8FSP2(10μM)1μL；AP(10μM)1μL；MgCL21.5μL；Ex Taq(5U/μL)0.25μL； 稀释100倍的一扩PCR产物1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。

二扩PCR实验的反应程序如下所示：

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆 到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交 上海英骏生物技术有限公司进行测序。

5.对斑节对虾周期蛋白依赖性激酶8基因的测定

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆 到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，进行 测序，如SEQ ID NO:1所示。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾周 期蛋白依赖性激酶8基因的同源序列。

6、斑节对虾周期蛋白依赖性激酶8的分布和表达

提取健康的斑节对虾不同组织(包括卵巢、肝胰腺、脑、心、肠、血和淋巴)以及不同发 育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)操作手册进行反转 录为cDNA模板。将不同组织样品cDNA稀释1倍作为模板，采用SYBR GreenⅠ染料法， 在Roche荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。依照TaKaRaPrimeScriptTM R  TPCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行PCR反应。反应体系为10μL，包含5μL 的2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，3μL稀释的模板，各0.2μL正、反引物 (10μmol/L)及1.6μL的双蒸水。每个时间点设置3个重复。反应参数为95℃预变性10s； 然后95℃变性15s，60℃退火延伸20s，共45个循环。使用引物reCDK8-F(5>TGACTTTCG GACTGTTTCGC<3)和reCDK8-R(5>TTCCTTTCCCCTTACGCTTT<3)扩增目标基因，RTE  F-F(5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3)和RTEF-R(5>CGTGGTGCATCTCCACA GACT<3)扩增EF-1α基因作为内参，实验数据采用相对ΔCT法(2-ΔΔCT法)分析斑节对 虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因在各样品中的相对表达量。

以reCDK8-F(5>TGACTTTCGGACTGTTTCGC<3)和reCDK8-R(5> TTCCTTTCCCCTTACGCTTT<3)为引物，分别对斑节对虾的7种组织的样品和卵巢发育五期 的样品进行RT-PCR实验，对RT-PCR反应结束后所得的溶解曲线进行分析发现，该曲线全 部为单一峰，没有杂峰存在，说明此次实验成功，即实验没有被污染，没有非目标产物存在。 利用相对CT法对实验进行分析发现，在样本虾种，细胞周期蛋白依赖性激酶8的mRNA在 所测的卵巢、肝胰腺、脑、心、肠、血和淋巴中的表达各不相同，在肠内的表达量最高，在 肝胰腺、脑、心、血、淋巴中的表达量次之，而在卵巢中的表达量最低。通过单因子方差方 法分析显示，不同组织中PmCDK8的mRNA的表达差异明显，具体结果如图1所示。各个 不同的时期，Ⅰ期:卵原细胞期；Ⅱ期：核染色质期；Ⅲ期：周边核仁期；Ⅳ期：卵黄囊期； Ⅴ期：成熟期。如图2所示，Ⅰ期表达量最高，Ⅳ期最低。垂直线表示平均值±标准误差(重 复样品数＝3)，不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)，垂直线表示平均值±标准误差(重 复样品数＝3)

6、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的体外重组表达

根据已经获得的胞周期蛋白依赖性激酶8开放阅读框(ORF)设计原核表达引物(F和 R)扩增目的片段，并与pET21a进行连接。重组质粒用通用引物进行测序。连接和序列正确 的单克隆扩大培养并提取重组质粒。

将测序正确的重组质粒CDK8/pET21a转入大肠杆菌BL21(DE3)，将表达菌种以1∶1 00(V∶V)接入三个200mL新鲜LA液体培养基，在37℃、30℃和22℃条件下诱导7h和 30℃条件下分别诱导1h、3h、5h、7h、9h、和11h。用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAG E)分析诱导结果。结果如图3所示：M：为10-170预染蛋白MARK；1：重组质粒未诱导； 2-4分别在22℃，30℃和37℃诱导。以及在30℃条件下，不同时间诱导CDK8/pET21a在B L21(DE3)中的表达，结果如图4所示：M：10-170kD蛋白MARKER；1h-11h：不同的诱 导时间。

7、目的蛋白的纯化和鉴定

取诱导的菌液离心法收集菌体，超声破碎(超4s，歇6s，共15分钟)后10000rpm离心 分离上清和沉淀，沉淀用8M脲素溶解后，用镍柱进行亲和层析，纯化的蛋白经SDS-PAGE 检测结合和洗涤效果。充分脱色后，切取目的条带低温保存，进行质谱分析和鉴定。用垂直 电转仪(Bio-Rad)将SDS-PAGE胶中的蛋白转至硝酸纤维素(NC，MILLIPORE，USA)膜 上，通过预染蛋白Maker转移效果检测目的蛋白的转移情况，然后进行Western blot检验。 主要步骤为：转膜后用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜；次日PBST洗膜三次，每次10min；带有 HRP标记的兔源6×His标签抗体(1∶2000，V∶V，封闭液稀释)中室温孵育60min；PBST 洗膜3次，每次10min后，用HRP/DAB显色试剂盒(天根生物)避光显色。结果如图5所 示：M:10-170kD蛋白MARKER；1-3：CDK8重组蛋白。

上述的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示

该基因所编码的蛋白以SEQ ID NO:1的30bp处的起始密码子ATG编码至1458bp处的 终止密码子TGA，编码476个氨基酸序列，具体编码氨基酸的基因片段的核苷酸序列为SEQ  ID NO:3。