含巴西蜡的兽用抗寄生虫制剂

摘要

一种含巴西蜡的兽用抗寄生虫注射剂，制剂主要由抗寄生虫药物、巴西蜡和油性介质组成；抗寄生虫药物为阿维菌素类药物、吡喹酮、奥芬哒唑；油质介质为植物油、油酸乙酯或苯甲酸苄酯，它们可一种以上组合使用。在制剂中还可加入单油酸甘油酯，巴西蜡与单油酸甘油酯组合应用，制剂的缓释效果更好。选择的制剂组成为(按1000ml计算)：阿维菌素类抗寄生虫药物36-80g，巴西蜡10-70g，单油酸甘油酯80-120g，抗氧剂0.1-0.3g，苯甲醇10-20％g，油性介质加至终体积。

说明书

技术领域

本发明属于兽药制剂制备技术，具体涉及用巴西蜡或巴西蜡和单油酸甘油酯为缓释材料，制备含抗寄生虫药物的兽用长效注射剂。

背景技术

巴西蜡又称巴西棕榈蜡，它无毒，无刺激性，被公认是安全的药用辅料，在药剂中常被用作片剂或丸剂包衣的抛光剂、软膏基质、栓剂基质，以及固体分散体的分散介质和口服制剂的缓释材料。有关巴西蜡在注射剂中的应用，报导的不多。专利CN86105087C公开了一种制备含牛生长激素长效注射剂的技术方案，牛生长激素悬浮在由巴西蜡和植物油组成的油性介质中，巴西蜡适宜含量为5-10％，皮下注射该油剂，单次给药，牛生长激素的有效持续释放时间可达到28天左右。还有一些专利(如：专利CN1572302A、CN1698637A、CN1236758A、CN1461640A、CN1444925A、CN1421199A、CN1572300A)提到了可用巴西蜡作为注射剂的缓释材料或助悬剂等，但对于具体的制备技术方案(如配方的组成等)及其临床效果等核心内容都没有公开或清晰的论述。

我们在开发抗寄生虫药物长效注射剂的过程中观察到：(1)含植物油和巴西蜡的油质注射剂，比单用植物油制备的油质注射剂更具有明显的长效作用；(2)药物浓度对制剂的缓释作用有明显影响，当制剂中药物浓度提高到一定的水平时，绵羊体内的有效血药浓度持续时间明显延长；(3)巴西蜡与单油酸甘油酯组合应用，缓释效果更好。由此可见，用植物油和巴西蜡或用植物油、巴西蜡和单油酸甘油酯(GMO)来制备含较高浓度的阿维菌素类抗寄生虫药物的兽用注射剂，会有很好的商业前景。

发明内容

本发明将详细介绍用巴西蜡或用巴西蜡/单油酸甘油酯来制备含抗寄生虫药物的长效注射剂。

1、制剂组成：

制剂包含抗寄生虫药物；巴西蜡；植物油或油酸乙酯或苯甲酸苄酯，它们可一种以上一起使用。

所述的抗寄生虫药物包括阿维菌素类药物、吡喹酮、奥芬哒唑中的一种或一种以上的组合物。阿维菌素类药物包括阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、乙酰胺基阿维菌素、莫西菌素。它们在兽医临床主要用于动物寄生虫病防治(朱模忠主编，兽药手册，化学工业出版社，2002年7月第1版，第167-174页)。在制剂中，阿维菌素类药物的浓度为1-15％，重量/体积比。在研究中发现，当制剂中阿维菌素浓度达到3％或3％以上时，制剂的缓释作用明显加强(见实施例3)。因此，从制备长效制剂角度考虑，阿维菌素类药物在油剂中的浓度大于3％更好。综合考虑动物体重大小、希望达到的药效持续时间和给药剂量等因素，用于猪或羊的制剂，药物浓度在3-4％(重量/体积比)为好；用于牛、马等大动物的制剂，药物浓度在6％(重量/体积比)左右适宜；制备含高浓度巴西蜡的半固体油剂，药物浓度为10-15％合适。吡喹酮或奥芬哒唑在制剂中的适宜浓度为8-20％，重量/体积比。

所述的巴西蜡又称巴西棕榈蜡，它在制剂中的浓度为0.7-10％。在一定浓度范围内，巴西蜡的浓度愈大，制剂的释药维持时间也越长(见实施例2)，但巴西蜡浓度过高时，会使制剂过于粘稠，粘着率增大，注射时需较大的推力，并需较长的时间才能完成注射过程，给使用带来不方便。在本制剂中，巴西蜡浓度的上限是按制剂应具有较好的流动性或可轻松的通过16号注射用针头(半固体制剂)，同时还参考药液的粘着性和希望的药效维持时间等重要因素来确定。试验表明，巴西蜡在本制剂中较好的浓度范围为0.7-6％，重量/体积比；制剂中巴西蜡浓度小于2％时，制剂的流动性和粘着性处于可接受的状态，随着浓度的进一步增加，粘度增加显著，当巴西蜡浓度大于5％时，适合制备半固体状态的、要求释药期较长的油剂，这种半固体状态的油剂适合用注射器作为包装容器(将油剂直接灌装在注射器中)，并且药物浓度应尽可能的提高，这样可以克服因粘着性而造成的油剂损失，并可以通过提高药物浓度来减少注射体积，以克服给药困难等不足。适合制备含高浓度巴西蜡、含高浓度药物的半固体油剂的抗寄生虫药物应具备活性高、安全性好的特点，阿维菌素类药物是迄今为止已应用于临床的活性最高(最低有效剂量为0.01mg/kg b.w.)的广谱抗寄生虫药物。用阿维菌素类药物制备的半固体油剂，以高剂量皮下注射给药，药效维持时间显著延长，如含伊维菌素15％和巴西蜡6.5％的半固体油剂，用于越冬期羊寄生虫病防治，按1.5mg/kg b.w.剂量，单次皮下注射，药效维持时间可长达103天或更长(见实施例10)；用于牛按1.5mg/kg b.w.剂量，单次皮下注射(植入)含伊维菌素15％和巴西蜡6.5％的半固体油剂，有效血药浓度的维持时间长达125天(见实施例11)。另外，巴西蜡在本油剂中还可起到助悬剂的作用。

GMO是一种由甘油和油酸合成的甘油单酯类化合物，在药剂中一般作为乳化剂或分散剂使用。由于GMO具有在体内吸收水分达到35％的平衡含量后发生相变的特性(由层流状转化为高粘度的立方相)，因此，近些年探讨利用GMO制备原位胶凝长效注射剂的报导很多，并有商品上市。我们在配方筛选过程中发现，制剂中加适量的GMO，不但可以克服因在植物油中加入巴西蜡造成的药剂粘着率增大之不足(见实施例1)，更主要的是，同时含有GMO和巴西蜡的油剂，其缓释作用明显增强，优于仅含有巴西蜡的油剂，也优于仅含有植物油和GMO的油剂(见实施例4)。因此，在制备本发明制剂时，可通过加入GMO来提高制剂的缓释效果。制剂中GMO的适宜浓度为3-20％，更好的浓度为8-12％，重量/体积比。另外，试验中还观察到，将含GMO和巴西蜡的油剂注入水中，形成的疏水性团块紧密不散，水分不易渗入，这提示我们，加入GMO后缓释作用的提高，似乎与GMO具有相变的特性无直接的密切关系。

所述的植物油为注射用植物油，优选大豆油、玉米油、茶籽油、棉籽油、蓖麻油中的一种。这些植物油作为药用溶剂或油性分散介质，已被更多的用于兽用长效注射剂的制备(如专利CN102316876A、CN101703776A、CN104095812A、CN1215331A、CN1421199A、WO 00/35445等)。在用植物油制备的油剂中加入适量的油酸乙酯或苯甲酸苄酯，可降低油剂的粘度，并可提高对阿维菌素类药物的溶解能力，因此选择合适的比例将植物油与苯甲酸苄酯或油酸乙酯组合使用，能制备出流动性较好的油剂；制备含高浓度阿维菌素类药物的油剂时，加入适量的苯甲酸苄酯会使制剂药效来得快，同时制剂并不丧失其长效性。

由于制剂中存在易氧化的成份，如植物油、油酸乙酯等，因此，在必要时(如在不充氮气灌封的情况下)，油剂中还需加入抗氧剂，选择的抗氧剂为叔丁基-4-羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)或没食子酸丙酯(PG)中的一种或一种以上任何比例的混合物，抗氧剂在制剂中的适宜浓度为0.1-0.5g/1000ml。为了减轻注射时诱发的疼痛，制剂中还应加入适量的局部止痛剂，选择的局部止痛剂为苯甲醇，其适宜浓度为10-20g/1000ml制剂。

2、制备方法：

本剂制备过程应在无菌条件下进行，选择的制备方法为：

将活性成份用1.5-2倍量的乙酸乙酯溶解，得活性成份/乙酸乙酯溶液；将巴西蜡与植物油混合，加热到85-90℃，待巴西蜡溶解后，与活性成份/乙酸乙酯溶液混合，在搅拌下减压除去乙酸乙酯，冷却到室温，加入剩余的其它成份，用高速剪切机均质化，即得本油剂。或将巴西蜡与植物油混合，加热到85-90℃，待巴西蜡溶解后，在搅拌条件下，降至室温，加入活性成份和剩余的其它成份，用高剪切均质机或胶体磨研磨至活性成份粒径小于15μm，即得本油剂。或将活性成份、巴西蜡和其它辅料成份混合在一起，过管线式高剪切研磨机，经反复研磨，将药物粒径研磨至小于15μm，即得本油剂。

3、油剂的粘着性及简易的测定方法：

一般来说，当油剂中包含具有增加制剂粘度的缓释材料时，会有一定量的药剂粘着在盛装药剂的容器壁上，使用时，用注射器抽取不净，从而导致药剂损失；粘着在瓶壁上的药剂越多，损失越大。在本发明中，把粘着在瓶壁上的那部分药剂量占总药剂量/瓶的重量百分比，称之为粘着率(％)；油剂的粘着率增大，其商品价值下降，并且油剂粘着程度越大，表明油剂的粘度越大，用注射器抽取药液和推注药液所需的力量会越大，导致给药费时费力，增加了劳动强度和劳动力成本，并且往往会诱发动物的应激反应和疼痛反应更加强烈。本发明认为，作为油剂的初筛指标，用粘着率来反映制剂的粘稠程度，更直观、更实用，并且测定简单，易操作。在本发明中粘着率的测定采用如下方法进行。

将制备好的油剂灌装到已称重量(W₁)的25ml西林瓶中，每瓶装量为25ml，灌装完毕，称重(W₂)，W₂-W₁即为25ml的药剂重量(W₃)。称重后加塞、扎盖，室温静置1个月。测定时，往复摇动每瓶药液，使之充分混合，静置10分钟后，取下铝盖和胶塞，倾出药液，并保持瓶子倒置3分钟，称量倾出的药剂重量(W₄)，(W₃-W₄)/W₃x 100即为药剂的粘着率(％)。

用以上方法测定本发明制剂的粘着性，结果显示(见实施例1)：(1)油剂中巴西蜡浓度越大，粘着率越大；(2)含GMO的油剂，其粘着率明显低于不含GMO的油剂。

具体实施方式

实施例1、巴西蜡浓度及制剂中GMO的存在对油剂粘着率(％)的影响

表中油剂1至油剂7是以大豆油为分散介质并用大豆油加至油剂的终体积，油剂中阿维菌素浓度(％)、巴西蜡浓度(％)、GMO浓度(％)，均为重量/体积百分比浓度；油剂粘着率的测定按以上发明内容中所述的方法进行，以下表中粘着率(％)为3个平行试样的平均值，测定温度为室温(21-24℃)。

以上油剂1至油剂7的制备过程如下：

将巴西蜡与大豆油混合，在85-90℃，使巴西蜡溶解，得透明油溶液，降至室温后，加入阿维菌素和GMO(油剂5、油剂7)，用高速剪切式均质机在12000-16000r/min条件下，反复剪切研磨1小时，即得油剂1-油剂7。

比较油剂1至油剂3的配方组成可见，油剂中巴西蜡浓度越大，粘着率越高；比较油剂4和油剂5、油剂6和油剂7的配方组成可见，包含GMO的油剂5和油剂7，其粘着率低于不含GMO的油剂4、油剂6；当巴西蜡浓度达到5％时，粘着率大于8％，因此，巴西蜡浓度大于5％的油剂不适合用瓶子作为包装容器，适合用特制的塑料注射器作为盛装油剂的容器。

实施例2、绵羊注射实施例1中的油剂1、油剂2、油剂3和对比制剂后的血药浓度检测。

(1)对比制剂的制备：取纯度为96％(B_1a含量)的阿维菌素5.21g，与497ml大豆油混合，用高速剪切式均质机在12000-16000r/min条件下，反复剪切1小时，即得含阿维菌素1％的对比制剂。

(2)试验动物、给药及血样采集：选体重在38-45公斤的健康绵羊(小尾寒羊)20只，随机分成4组，每组5只，分别编号为组1、组2、组3、组4，组1颈部皮下注射对比制剂0.4mg/kgb.w.，组2、组3、组4分别注射实施例1中的油剂1、油剂2、油剂3，颈部皮下注射，给药剂量均为0.4mg/kg b.w.。给药后从羊颈静脉按时采血，每次准确采血4ml，将同一试验组同一时间采集的血样放入到同一支含肝素钠的20ml离心管中，混合后以3000r/min离心10min，取上层液(血浆)，置于-18至-20℃保存。

(3)血样处理及血浆中阿维菌素检测：血样处理和血浆中阿维菌素的检测方法按文献[潘保良，王玉万，汪明，阿维菌素长效注射液(油悬剂)与普通注射液在绵羊体内的药代动力学比较研究，中国兽药杂志，2003，37(3)：18-21]中的方法进行，检测结果见表1。

表1、绵羊注射实施例1中的油剂1-油剂3和对比制剂后的血药浓度(ng/ml)

一般来说，缓释制剂的血药浓度-时间数据不适合用经典药代动力学模型进行数据分析。在不考虑进行药代动力学参数系统计算的前提下，应用动物体内血药浓度水平评估的方法筛选配方时，可仅在要求达到的药效维持期间的有代表性的时间点采集血样，并将同组同时间的血样以等量混合后在进行血浆分离、预处理和检测。这样做，样品的检测量可极显著减少，从而可大大减少工作量，有益于应用血药浓度检测的手段进行更广泛、更科学和更接近于实际(与体外模拟试验比较)的配方筛选。已公开的试验结果和临床应用显示，市售的以1，2-丙二醇和甲醛缩甘油为共溶剂制备的1％伊维菌素注射剂或1％阿维菌素注射剂，以0.2mg/kg b.w.的剂量，单次给绵羊皮下注射，药效维持时间可达18天左右，在第21天左右血药浓度水平约0.2ng/ml；以0.4mg/kg b.w.的剂量，单次给绵羊皮下注射，药效维持时间可达26-28天，第26天左右血药浓度水平约0.5ng/ml。

基于上述，在本项研究的配方筛选试验方案中，拟定的要求被筛选制剂达到的效果是：以0.4mg/kg b.w.的剂量给药，在给药后第3天至第5天血药浓度如能达到最低有效血药浓度的10倍以上(大于10ng/ml)，并且在给药后第36天左右，血药浓度仍能保持在2ng/ml水平(文献报导，阿维菌素或伊维菌素对牛、羊的体内线虫和体外寄生虫的最低有效血药浓度为0.5-1.0ng/ml)，可达到这样血药浓度水平的被筛选制剂，就有商业性开发的必要。基于此，本试验选择了两个有代表性的时间点采集血样，以了解被筛选油剂的缓释效果。第一个采血时间点是在给药后第3天和第5天，第二个采集血样的时间点是在给药后第36天和第38天。从表1检测数据可见，试验结果显示出了一定的规律性，并且给出了有明显差异性的结果：在给药后第36天至38天，不含巴西蜡的油剂血药浓度明显低于含巴西蜡的油剂，随着巴西蜡在制剂中的浓度增加，第36-38天的血药浓度水平在提高。当制剂中巴西蜡浓度达到一定水平时(如油剂3，巴西蜡浓度为5％)，可更有效的延缓药物释放，在给药后第38天，血药浓度仍处于令人满意的有效水平。

实施例3、绵羊注射实施例1中的油剂2、油剂4、油剂6后血药浓度的检测。

(1)试验动物、给药及血样采集：选体重在40公斤左右的健康绵羊(小尾寒羊)15只，随机分成3组，每组5只，分别在颈部皮下注射实施例1中的油剂2、油剂4、油剂6，给药剂量均为0.4mg/kg b.w.。给药后从羊颈静脉按时采血，每次准确采血4ml，将同一试验组同一时间采集的血样放入到同一支含肝素钠的20ml离心管中，混合后以3000r/min离心10min，取上层液(血浆)，置于-18至-20℃保存。

(2)血样处理及血浆中阿维菌素检测：血样处理和血浆中阿维菌素的检测方法同实施例2，试验结果见表2。

表2、绵羊注射实施例1中的油剂2、油剂4和油剂6后的血药浓度(ng/ml)

从表2可见，制剂中药物浓度达到3％以上时，缓释作用有明显提高，因此，用植物油和巴西蜡来制备含阿维菌素类抗寄生虫药物的兽用长效注射剂时，制剂中的药物浓度达到3％以上时，会具有更好的临床效果(长效作用)。

实施例4、绵羊注射实施例1中的油剂4、油剂5和对比制剂后血药浓度的检测。

(1)对比制剂的制备：取纯度为96％(B_1a含量)的阿维菌素9.375g与GMO 30g混合，加入大豆油至300ml，用高速剪切式均质机在12000-16000r/min条件下，反复剪切1小时，即得含阿维菌素3％的对比制剂。

(2)试验动物、给药及血样采集：选体重接近(约40公斤)的健康绵羊(小尾寒羊)24只，随机分成4组，每组6只，第1组、第2组、第3组分别在颈部皮下注射实施例1中的油剂4、油剂5和对比制剂，给药剂量均为0.4mg/kg b.w.，第4组按0.8mg/kg b.w.的剂量皮下注射油剂5；给药后从羊颈静脉按时采血，每次准确采血4ml，将同一试验组同一时间采集的血样放入到同一支含肝素钠的20ml离心管中，混合后以3000r/min离心10min，取上层液(血浆)，置于-18至-20℃保存。

(3)血样处理及血浆中阿维菌素检测：血样处理和血浆中阿维菌素的检测方法同实施例2，检测结果见表3。

表3、绵羊注射实施例1中的油剂4、油剂5和对比制剂后的血药浓度(ng/ml)

从表3可见，制剂中含有GMO和巴西蜡的油剂5(第2组)的缓释作用优于仅含有巴西蜡的油剂4(第1组)，与仅含有GMO的对比制剂(第3组)比较，两者差异显著。该试验结果表明，通过将GMO与巴西蜡组合使用，可延长药效维持时间。比较第2组(给药剂量0.4mg/kg b.w.)与第4组(给药剂量0.8mg/kg b.w.)试验结果可见，增加给药剂量，可有效的提高后期(给药后第36-45天)的血药浓度水平。这告诉我们，本发明油剂在使用时通过增加给药剂量，可有效的延长药效作用时间。

综合以上实施例2、实施例3、实施例4的试验结果可见，通过调正巴西蜡浓度、药物浓度、给药剂量以及GMO的加入与否，可制得具有预期效果的长效注射剂。

实施例5、几种3.6％伊维菌素注射液的制备和对绵羊疥螨的防治效果

(1)制剂的制备

制剂a：取巴西蜡20g、GMO 100g、纯度为97％(B_1a含量)的伊维菌素37.11g，加入油酸乙酯定容至1升，充分混合，于80-90℃，将巴西蜡完全溶解，降至室温，用高速剪切式均质机在12000-16000r/min条件下，反复剪切1小时，即得制剂a。

制剂b：取巴西蜡20g、纯度为97％(B_1a含量)的伊维菌素37.11g，加入油酸乙酯定容至1升，充分混合，于80-90℃，将巴西蜡完全溶解，降至室温，用高速剪切式均质机在12000-16000r/min条件下，反复剪切1小时，即得制剂b。

制剂c：取GMO 100g、纯度为97％(B_1a含量)的伊维菌素37.11g，加入油酸乙酯定容至1升，充分混合，于80-90℃，将伊维菌素完全溶解，降至室温，用高速剪切式均质机在12000-16000r/min条件下，反复剪切1小时，即得制剂c。

制剂d：取纯度为97％(B_1a含量)的伊维菌素37.11g，用油酸乙酯定容至1升，用高速剪切式均质机在12000-16000r/min条件下，反复剪切1小时，即得制剂d。

(2)临床疗效评价

试验动物为50只已确诊感染疥螨的绵羊，体重为30-45公斤，随机分5组，每组10只。第1组不打药；第2组、第3组、第4组、第5组的绵羊分别皮下注射制剂a、制剂b、制剂c、制剂d。给药剂量均为0.4mg/kg b.w.，给药后混群圈养55天。试验结果如下：

第1组，0-55天期间10只绵羊均可检出活螨。

第2组(注射制剂a)，在给药后第8-11天所有感染疥螨的绵羊都得到有效的控制，驱净率达100％；于给药后第47天，有1只绵羊被检出活螨，这说明制剂a的药效维持时间接近于47天。

第3组(注射制剂b)，在给药后第10-13天所有感染疥螨的绵羊都得到有效的控制，驱净率达100％；于给药后第44天，有2只绵羊被检出活螨，这说明制剂b的药效维持时间接近于44天。

第4组(注射制剂c)在给药后第7-11天所有感染疥螨的绵羊都得到有效的控制，驱净率达100％；于给药后第35天，有2只绵羊被检出活螨，这说明制剂c的药效维持时间接近于35天。

第5组(注射制剂d)在给药后第9-12天所有感染疥螨的绵羊都得到有效的控制，驱净率达100％；于给药后第36天，有3只绵羊被检出活螨，这说明制剂d药效维持时间接近于36天。

实施例6、制备6％乙酰胺基阿维菌素注射液

取纯度为90％的乙酰胺基阿维菌素13.2g，用28ml乙酸乙酯溶解；将巴西蜡3g、GMO10g，与油酸乙酯120ml和苯甲酸苄酯60ml混合，在80-90℃水浴中，使巴西蜡溶解；将含乙酰胺基阿维菌素的溶液和含巴西蜡的溶液混合，在搅拌下降至室温，用高速剪切研磨机，在14000r/min，充分剪切1小时，得6％乙酰胺基阿维菌素注射液。

实施例7、制备10％奥芬哒唑注射剂

取20g奥芬哒唑，2g巴西蜡，加茶籽油至200ml，用高速剪切研磨机，在14000r/min，充分剪切，至奥芬哒唑的粒径小于5μm，得10％奥芬哒唑注射液。

实施例8、制备15％吡喹酮油质注射剂

制剂组成：吡喹酮15％(折百计)，重量/体积比；巴西蜡6.5％，重量/体积比；GMO 10％，重量/体积比；BHT 0.03％，重量/体积比；注射用茶籽油加至终体积。

制备方法：将吡喹酮与茶籽油混合，充分研磨至吡喹酮粒径小于20μm，加入巴西蜡和GMO，加热至80-90℃，使巴西蜡完全溶解，在搅拌条件下降温至50-55℃，用高剪切均质机，进一步剪切处理，并在此温度条件下，将油剂灌装到5ml塑料注射器中(密封圈材质为硅胶)，即得本制剂。

实施例9、制备15％伊维菌素油质注射剂

制剂组成：伊维菌素15％(折百计)，重量/体积比；巴西蜡6.5％，重量/体积比；GMO 10％，重量/体积比；BHT 0.03％，重量/体积比；注射用茶籽油加至终体积。

制备方法：将伊维菌素与茶籽油混合，充分研磨至伊维菌素粒径为15μm左右，加入巴西蜡和GMO，加热至80-90℃，使巴西蜡完全溶解，在搅拌条件下降温至50-55℃，用高剪切均质机，进一步剪切处理，并在此温度条件下，将油剂灌装到5ml塑料注射器中(密封圈材质为硅胶)，即得本制剂。

实施例10、实施例9的油质注射剂用于绵羊寄生虫病防治的疗效试验

用于越冬期绵羊疥螨病防治的试验。选放养的绵羊71只(一群)，随机分成两组，第1组20只，第2组51只。第1组皮下注射市售的1％伊维菌素注射液(用1，2-丙二醇、甲醛缩甘油制备)，给药剂量为1.5mg/kg b.w.，第2组皮下注射实施例9油质注射剂1.5mg/kg b.w.，给药后定期检查疥螨感染情况，试验结果如下：

第1组在给药前有4只羊已感染疥螨，在给药后第12天检查，20只绵羊均检查不到活螨存在；在给药后第36天检出1只绵羊再次感染疥螨，第41天检出12只绵羊再次感染疥螨。

第2组在给药前有13只羊已感染疥螨，在给药后第12天检查，51只绵羊均检查不到活螨。在给药后的第103天在2只绵羊身体上检出活螨，给药后的117天检出11只绵羊再次感染疥螨。

实施例11、实施例9的油质注射剂在牛体内血药浓度的检测

(1)试验动物，给药及血样采集：选体重为190-220公斤的健康黄牛6头，分别在牛耳背部皮下注射实施例9的油质注射剂(用16号针头)，给药剂量为1.5mg/kg b.w.，给药后从牛颈静脉按时采血，每次准确采血3ml，将同一时间采集的6头牛的血样注入同一支含肝素钠的20ml离心管中，混合后以3000r/min离心10min，取上层液(血浆)，置于-18至-20℃保存。

(2)血样处理及血浆中伊维菌素检测：血样处理和血浆中伊维菌素的检测参考实施例2中阿维菌素的检测方法进行，试验结果见表4。

表4牛皮下注射(1.5mg/kg b.w.)实施例9制剂后血浆伊维菌素浓度(ng/ml)