同时含有5-氟尿嘧啶和齐墩果酸衍生物的壳聚糖微球及其制备方法

摘要

本发明公开了一种同时含有5-氟尿嘧啶和齐墩果酸衍生物的壳聚糖微球及其制备方法。首先采用离子交联法制备同时包裹5-氟尿嘧啶和齐墩果酸丁二酸单酯(齐丁酯)的壳聚糖微球，所得微球，5-氟尿嘧啶包封率为52.23±1.76％，形态圆整，表面光滑，粒径均匀，平均粒径为563±101nm。本发明的制备方法工艺稳定可靠，所得壳聚糖微球有良好的缓释效果，可同时发挥两者的协同抗肿瘤作用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及同时含有5-氟尿嘧啶和齐墩果酸衍生物的壳聚糖微 球及其制备方法。

背景技术

癌症是我国发病率和致死率最高的疾病之一，严重威胁着人们健康。目前癌症的治疗手 段主要限于手术、放射治疗和化疗三种方法。肿瘤的化疗由于具有适用面广泛，毒副作用相 对较小等特点，在肿瘤的治疗中占据重要地位。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是一种 重要的临床常用抗代谢类抗肿瘤药物，被广泛应用于治疗消化道癌、乳腺癌及各种实体瘤的 治疗。研究表明，5-氟尿嘧啶(5-FU)在体内的半衰期约10～20min，口服吸收不规则，生 物利用度较低，需要频繁给药。5-氟尿嘧啶的毒副作用主要包括腹泻、呕吐等消化道反应症 状及白细胞、血小板减少等骨髓抑制。研究表明，5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用与其在肿瘤部位 的局部浓度和作用时间密切相关。为了延长药效，降低毒副作用，国内外学者对5-氟尿嘧啶 的前药和剂型进行了大量的研究，开发并上市了卡莫氟、替加氟、氟脲苷和氟达拉滨等前体 药物，同时也在研究各种5-氟尿嘧啶新剂型，包括微球、脂质体、纳米粒等。但是现有技术 中大都只是研究将5-氟尿嘧啶制备成合适的给药剂型，没考虑到药物的联用和协同效应。

发明内容

本发明的目的是将5-氟尿嘧啶(5-FU)和齐墩果酸(OA)或其衍生物同时包封于一个 壳聚糖微球中，发挥两者的协同抗肿瘤作用。

为了实现上述目的，本发明，首先采用化学合成方法制备了齐墩果酸的衍生物齐墩果酸 丁二酸单酯(Succinyl oleanolic acid(SOA)，齐丁酯)。其次，采用离子交联法制备壳聚糖 微球，以包封率和载药量为指标，制备同时包封5-氟尿嘧啶和齐墩果酸的壳聚糖微球。

本发明采用的技术方案是：同时含有5-氟尿嘧啶和齐墩果酸衍生物的壳聚糖微球，是将 5-氟尿嘧啶和齐墩果酸衍生物同时包封于壳聚糖中，得到壳聚糖微球。所述的齐墩果酸衍生 物是齐墩果酸或齐丁酯。

优选的，同时含有5-氟尿嘧啶和齐墩果酸衍生物的壳聚糖微球，5-氟尿嘧啶与壳聚糖的 质量比为1:10-30；齐墩果酸衍生物与壳聚糖的质量比为1:10-30。

一种同时含有5-氟尿嘧啶和齐墩果酸衍生物的壳聚糖微球的制备方法，方法如下：将壳 聚糖溶于醋酸溶液中，得壳聚糖醋酸溶液；将齐墩果酸或齐丁酯溶解于有机溶剂中，得溶液 A；将5-氟尿嘧啶溶解于蒸馏水或缓冲溶液中，得溶液B；在快速搅拌条件下，将溶液A和 溶液B加入到壳聚糖醋酸溶液中，搅拌乳化15-45min后，得溶液C；滴加三聚磷酸钠溶 液，滴加完毕后，继续搅拌20-40min，即得目标微球。

优选的，壳聚糖醋酸溶液的浓度为1.0-3.0％。

优选的，溶液A中齐墩果酸或齐丁酯的质量百分浓度为0.05-5.00％。所述的有机溶剂 是乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)或二甲亚砜(DMSO)。

优选的，溶液B中，5-氟尿嘧啶的浓度为100-300mg/ml。所述的缓冲溶液是pH为2.0 -8.0的磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。

优选的，三聚磷酸钠(TPP)溶液的浓度为0.05-10.0％，三聚磷酸钠溶液与溶液C的体 积比为1：10-100。

本发明的有益效果是：

1.通过制备一个壳聚糖微球的复方制剂，将5-氟尿嘧啶和齐丁酯同时包封于一个壳聚糖微 球中，发挥两者的协同抗肿瘤作用。

2.本发明的制备方法简单可靠，工艺路线成熟，容易实现工业化生产。

3.壳聚糖微球是一种新型靶向给药系统。本发明将5-氟尿嘧啶和齐丁酯同时包封于一个壳 聚糖微球中，制成壳聚糖微球，既提高了药物稳定性，降低了毒副作用，提高了生物利 用度，而且改变了给药途径，利用体内肿瘤和炎症组织附近的EPR作用增加药物的被动 靶向性能。

4.采用本发明的方法制备的壳聚糖微球，结果显示粒径为563±101nm，zeta电位为 49.13±1.99mv，5-氟尿嘧啶的包封率好，成球形好。通过药物的释放实验，体外释放研 究表明，本发明制备的壳聚糖微球在pH值为7.40的缓冲液中具有一定的缓释作用。

附图说明

图1是实施例3制备的壳聚糖微球在不同pH值的缓冲液中的释放结果。

具体实施方式

实施例1 齐墩果酸丁二酸单酯(齐丁酯)制备

分别将1.14g(2.5mmol)齐墩果酸、1.25g(12.5mmol)丁二酸酐加入三口瓶中，以 甲苯溶解完全，再加入DMAP 1.53g(12.5mmol)。保温65℃，搅拌反应3小时，硅胶板展 开检测原料点消失(流动相：乙酸乙酯:石油醚＝3:1)，停止反应。蒸干溶剂后，乙酸乙 酯溶解，以PH为1的盐酸溶液洗涤，再以蒸馏水洗涤至中性，取乙酸乙酯层旋干得白色粉 末产物即为目标产物，收率95.0％。

实施例2 壳聚糖微球制备工艺条件的优化

方法：将壳聚糖溶于1％(v/v)的醋酸溶液中，得壳聚糖醋酸溶液；将齐丁酯溶解于乙 醇中，得齐丁酯浓度为0.5％(m/m)的溶液A；将5-氟尿嘧啶溶解于蒸馏水中，得5-氟尿 嘧啶(5-Fu)浓度为200mg/ml的溶液B；在快速搅拌条件下，将溶液A和溶液B按比例加 入到壳聚糖醋酸溶液中，搅拌乳化后，得溶液C；滴加三聚磷酸钠(TPP)溶液，三聚磷酸 钠溶液与溶液C的体积比为1:100，滴加完毕后，继续搅拌30min，即得目标微球。G-50凝 胶色谱法测:5-氟尿嘧啶的包封率。

(1)壳聚糖浓度的影响

齐丁酯与壳聚糖的质量比1:20；5-Fu与壳聚糖的质量比1:20；TPP的浓度为0.20％ (m/m)，搅拌乳化时间为15min，考察壳聚糖醋酸溶液浓度分别为1.0、2.0、3.0％时，5- 氟尿嘧啶的包封率，结果如表1。

表1 壳聚糖浓度的影响

由表1可见，随着壳聚糖浓度增加，包封率先增加后减小，而且从制备的产品可以明显 看出浓度为3％时，微球很不均匀，球体形状不好，壳聚糖浓度大时得到的微球粒径也较 大。

(2)齐丁酯加入的影响

壳聚糖醋酸溶液的浓度为2.0％，5-Fu与壳聚糖的质量比1:20；TPP的浓度为0.20％ (m/m)，搅拌乳化时间为15min，考察齐丁酯与壳聚糖的质量比为1:10，1:20，1:30时，5- 氟尿嘧啶的包封率，结果如表2。

表2 齐丁酯加入的影响

由表2可见，结果显示，在考察范围内，齐丁酯加入量的增加对5-氟尿嘧啶的包封率有 一定影响，而且在1:20时的5-氟尿嘧啶的包封率最大。此时，再增加齐丁酯的加入量导致 5-氟尿嘧啶的包封率降低，原因可能是齐丁酯超过了壳聚糖微球结构所能承受的最大吸附 量，导致5-氟尿嘧啶包封下降。

(3)5-Fu与壳聚糖的比例的影响

壳聚糖醋酸溶液的浓度为2.0％，SOA与壳聚糖的质量比1:20，TPP的浓度为0.20％ (m/m)，搅拌乳化时间为15min，分别考察5-Fu与壳聚糖的质量比为1:10，1:20，1:30 时，5-氟尿嘧啶的包封率，结果如表3。

表3 5-Fu与壳聚糖的比例的影响

由表3可见，在考察的范围内，随5-氟尿嘧啶加入量增加，包封率增加，在5-氟尿嘧 啶与壳聚糖的质量比为1:20时的包封率达到最大，随5-氟尿嘧啶的再次增加，壳聚糖微球 不能包覆所有的5-氟尿嘧啶，导致包封率降低。

(4)乳化时间的影响

壳聚糖醋酸溶液的浓度为2.0％，SOA与壳聚糖的质量比1:20，5-Fu与壳聚糖的质量比 1:20，TPP的浓度为0.20％(m/m)，分别考察乳化时间分别15min，30min，45min时，5- 氟尿嘧啶的包封率，结果如表4。

表4 乳化时间的影响

由表4可见，实验结果显示，在考察范围内，乳化时间对于5-氟尿嘧啶的包封率有较大 影响。

(5)TPP浓度的选择

壳聚糖醋酸溶液的浓度为2.0％，SOA与壳聚糖的质量比1:20，5-Fu与壳聚糖的质量比 1:20，乳化时间15min，分别考察TPP浓度为0.05，0.10，0.20，0.30，1.0、5.0、10.0％ 时，5-氟尿嘧啶的包封率，结果如表5。

表5 TPP浓度的选择

由表5可见，随TPP浓度的增加，包封率基本呈逐渐增大趋势，但是当浓度大于0.3％ 时，制备的微球，粒径大，成球不均匀，出现粘结状况。

(6)正交试验优化结果

在单因素考察的基础上，选择壳聚糖浓度、5-Fu与壳聚糖的质量比、齐丁酯与壳聚糖的 质量比、乳化时间四个因素，设计L₉(3⁴)正交实验，进一步优化壳聚糖微球的制备工艺。结 果如表6。

表6 正交试验优化结果

由表6可见，影响包封率的因素由大到小的顺序为5-Fu与壳聚糖的质量比、壳聚糖的 浓度、齐丁酯与壳聚糖的质量比、乳化时间。最终确定最佳实验条件为壳聚糖浓度2.00 ％，SOA与壳聚糖的质量比1:20；5-氟尿嘧啶与壳聚糖的比例为1:10，乳化温度为25 ℃，乳化时间为30min，TPP浓度为0.20％，交联温度为25℃。

实施例3 同时含有5-氟尿嘧啶和齐丁酯的壳聚糖微球

(一)制备方法

将壳聚糖溶于1.0％(v/v)的醋酸溶液中，得浓度为2.00％(m/m)的壳聚糖醋酸溶 液；将齐丁酯溶解于乙醇中，得齐丁酯浓度为0.5％(m/m)的溶液A；将5-氟尿嘧啶溶解 于蒸馏水中，得5-氟尿嘧啶浓度为200mg/ml的溶液B；按比例，SOA与壳聚糖的质量比 1:20，5-氟尿嘧啶与壳聚糖的质量比1:10取溶液A和溶液B，在快速搅拌条件下，将溶液 A和溶液B加入到壳聚糖醋酸溶液中，搅拌乳化30min后，得溶液C；滴加0.20％的三聚 磷酸钠(TPP)溶液，三聚磷酸钠溶液与溶液C的体积比为1:50，滴加完毕后，继续搅拌 30min，即得目标微球。

(二)检测结果

G-50凝胶色谱法测5-氟尿嘧啶的包封率，5-氟尿嘧啶的包封率为52.23±1.76％，5-氟 尿嘧啶载药量为壳聚糖质量的20.0％，齐丁酯的载药量为壳聚糖质量的20.0％。

所得微球经适当稀释后，采用激光粒度仪(Nano–ZS 90，马尔文仪器有限公司)测得微 球的平均粒度为563±101nm，所得微球形态圆整，表面光滑，粒径均匀。

所得微球经适当稀释后，采用Nano-ZS 90测定其zetaz电位为49.13±1.99mv，说明该 体系具有较大的正电荷，比较稳定。

(三)微球的体外释放

精密称取适量壳聚糖微球，置于透析袋MwCO 8000中，于pH值分别为1.4、7.4的磷 酸盐缓冲液中，在37±0.5℃恒温水浴中，搅拌，定时取样考察其释放情况。计算5-氟尿嘧啶 的累计释放百分比。结果如图1所示。在pH值为7.4的缓冲液中，该微球对5-氟尿嘧啶具 有一定的缓释效果。由释放试验结果可以看出，所得微球具有一定的突释效应。在开始的 10分钟内，药物的释放量达到20％左右，后期释放减缓。开始出现的快速释放是微球中的 外相药物快速释放，扩散阻力很小，释放速度快。待外相药物完全释放后，微球内部的药物 由于微球载体材料的阻滞和吸附作用导致缓慢释放。同时，5-Fu子中的强电负性原子(O、 N、F)与壳聚糖分子中的-OH氢原子形成了比较强的氢键，或者5-Fu中的-NH-中氢原子与 CS分子中的氧原子和氮原子之间形成了氢键，随着释放时间的延长，5-Fu与壳聚糖之间的 氢键被破坏，5-Fu逐渐从微球中缓慢释放出来。另外，微球在酸性环境中的释放速度比在中 性环境中的快。这可能是在强酸环境中氢离子与微球体表面的氨基很快结合形成铵盐，使微 球表面较快溶胀，高分子链伸展，交联网络孔径增大，药物和介质分子容易进出并释放药 物，因此导致药物的释放较快。

实施例4 不同有机溶剂对5-氟尿嘧啶壳聚糖微球包封率的影响

方法同实施例3，替换有机溶剂。结果如表7。

表7 有机溶剂的影响

实施例5 不同缓冲溶液中5-氟尿嘧啶壳聚糖微球的包封率

方法同实施例3，将蒸馏水替换为缓冲溶液。结果如表8。

表8 不同缓冲溶液中5-氟尿嘧啶壳聚糖微球的包封率