汉防己甲素联合5-氟尿嘧啶壳聚糖微球防治实验性PVR的实验研究

摘要

目的:1.研究Tet与5-Fu对兔眼体外RPE细胞增殖的抑制作用,并探讨其抑制兔RPE细胞增殖的作用机制,以期初步评价药物防治PVR的可行性问题。
　　2.观察Tet联合5-Fu壳聚糖微球(Tet-5-FU-CS-MS)对实验性兔眼PVR模型的防治效果,研究药物在眼内的抗炎机制。
　　方法:1.提取培养兔RPE细胞,传至第四代并鉴定后,选取生长良好的第四代RPE细胞进行试验。设Tet分为2、5、10、15μg/mL组及空白对照组(1O％FBS-DMEM,含0.5%oDMSO, DMSO终浓度≤1‰,对细胞无毒性作用)。5-Fu为5、10、15、20μg/mL组及空白对照组(同上)。噻唑蓝比色(MTT)法检测两组药物对RPE细胞增殖的抑制率,从而测定出增殖抑制率较高而药物浓度相对较低的最佳有效浓度;流式细胞仪(FCM)检测最佳有效浓度的两组药物及空白对照组作用72h后对RPE细胞周期的影响;流式细胞仪(FCM)检测最佳有效浓度两组药物及空白对照组分别作用24h、48h、72h、96h后对RPE凋亡率、线粒体跨膜电位(ΔΨm)、细胞质内Ca2+浓度、Bax, Bcl-2蛋白表达的影响。
　　2.健康成年青紫蓝兔48只,随机分为A、B、C三组,每组16只兔32眼,建立兔眼外伤性PVR模型,向玻璃体中后部注入药物,A组注入含有Tet-5-FU-CS-MS的BSS悬浮液0.2ml,B组注入含有5-Fu聚乳酸微球的BSS悬浮液0.2ml,C组注入25mg无药物壳聚糖微球的BSS悬浮液0.2ml,术后每天观察眼底变化,必要时行眼科B超检查直到注药后第28天,药效评价按Ryan分级法,观察各组视网膜脱离的发生率。分别于术后7天、14天、28天等3个时间点抽取各术眼玻璃体液0.2ml,酶联免疫吸附法(ELISA)检测玻璃体液中TNF-α. IL-1β的含量。
　　成果:1.Tet与5-Fu明显抑制兔体外RPE细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性,除作用96h后,Tet1O、15μg/ml及5-Fu15,20μg/ml之间无统计学意义外,其余各质量浓度及时间点之间的比较均有统计学意义(p＜0.05),分别选取RPE细胞的增殖抑制率较高而药物浓度相对较低的Tet10μg/ml)组和5-FU(15μg/ml)组进行下面的实验。Tet与5-Fu两组RPE细胞在72h时G0/G1(合成前期)细胞明显增多,与相应空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05); Tet与5-Fu两组各时间点RPE细胞凋亡率与相应对照组相比明显升高,差异均有统计学意义(p＜0.05);随时间延长实验组RPE细胞线粒体ΔΨ逐渐降低,与相应对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);随时间延长细胞质内Ca2+浓度逐渐升高,与相应对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。Tet(10μg/ml)及5-Fu(15μg/ml)实验组与相应空白对照组相比,均出现Bax蛋白表达增加,Bcl2蛋白表达下降,Bcl-2/Bax比值下降,两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.Tet-5-FU-CS-MS组与5-Fu聚乳酸微球组及空白微球组相比,各时间点视网膜脱离的发生率明显降低,其玻璃体液中TNF-α、IL-1B等炎性因子的含量也显著低于其它两组,方差分析p＜0.05,差异有统计学意义。
　　结论:1.Tet与5-Fu对体外兔RPE细胞的增生有明显抑制作用,通过阻断RPE细胞增生周期,干扰Bcl-2及Bax蛋白表达而诱导RPE细胞凋亡,两药联用在防治PVR方面具有潜在价值。
　　2.Tet-5-FU-CS-MS显著降低实验性兔眼PVR的发生率,有可能在PVR炎症期发挥抗炎作用,抑制眼内炎性因子的释放,从而起到防治PVR发生的协同作用。

目录

提要

Abstract

引言

第一部分 Tet-5-FU-CS-MS的制备工艺及微球性质研究

1 研究制备Tet-5-FU-CS-MS的目的

2 Tet-5-FU-CS-MS的药理作用

2.1 壳聚糖微球(chitosan microspheres,CS-MS)的药理作用

2.2 汉防己甲素的药理作用

3 Tet-5-FU-CS-MS的制备

4 Tet-5-FU-CS-MS的特性

第二部分 Tet与5-Fu抑制兔RPE增生的体外实验研究

概述

材料和方法

1 材料

2 试验方法

3 统计方法

结果

1 RPE细胞培养及鉴定

2 Tet与5-Fu对RPE细胞增生的影响

3 Tet与5-Fu对RPE细胞周期的影响

4 Tet与5-Fu对RPE细胞凋亡及凋亡率的影响

5 Tet与5-Fu对RPE细胞线粒体ΔΨm的影响

6 Tet与5-Fu对RPE细胞质内Ca2+浓度的影响

7 Tet与5-FU对RPE Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达的影响

图片

讨论

1 Tet与5-Fu抑制体外RPE细胞增生的最佳浓度

2 Tet与5-Fu抑制RPE细胞增殖的机制

小结

第三部分 Tet-5-FU-CS-MS防治实验性兔眼PVR的体内试验研究

概述

材料和方法

1 实验模型的建立与方法

2 试验方法

3 统计学方法

结果

1 Tet-5-FU-CS-MS防治实验性PVR的效果观察

2 Tet-5-FU-CS-MS对PVR进程中炎性因子的影响

图片

讨论

1 增殖性玻璃体视网膜病变的发病机制及治疗

3 Tet-5-FU-CS-MS防治PVR的效果评价

4 Tet-5-FU-CS-MS眼内抗炎机制的研究

小结

结语

参考文献

综述

参考文献

致谢