一种C型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌

摘要

本发明涉及一种C型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的是一种酶活性显著提高的C型β-葡萄糖苷酶突变体及其构建方法，属于生物工程技术领域；本发明将来源于台湾白蚁的β-葡萄糖苷酶进行定点突变，将第170位的赖氨酸K分别变为丝氨酸S和色氨酸W，第182位的苯丙氨酸F变为甲硫氨酸M，第252位的氨基酸组氨酸H变为天冬酰胺N，分别表示为Glu1C- K170S、Glu1C- K170W、Glu1C- F182M、Glu1C- H252N；本发明所得到的突变体的酶活性与突变前相比分别提高了5.2倍、2.05倍、2.9倍、2.1倍；本发明所得四株C型β-葡萄糖苷酶突变体的酶活都有了不同程度的提高，更适合于生物催化工艺的应用，为工业化应用提供了有利的基础，更能满足社会生产的要求，有广阔的市场前景。

说明书

技术领域

    本发明涉及一种C型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的是一种酶活性显著提高的C型β-葡萄糖苷酶突变体及其构建方法，属于生

物工程技术领域。

背景技术

C型β-葡萄糖苷酶（β-C-吡喃葡萄糖苷水解酶，E.C. 3.2.1.21）是一类能水解苷类和寡糖的糖苷键并释放非还原性末端葡糖残基的酶。这些酶普遍存在于所有领域的生命体中，在古细菌、真细菌和真核生物中发挥多种功能和作用。包括微生物内的生物质转换、动物体糖脂和外源性糖苷的降解、细胞壁寡糖的木质化和分解代谢、防御、植物激素结合共轭激活作用、植物中气味释放以及植物-微生物和植物-昆虫相互作用等。

白蚁是自然界中纤维素的最主要消耗者，白蚁主要通过内源和外源纤维素酶的协同作用分解纤维素，最终转化为葡萄糖。白蚁体内就是一个微型的生物发酵器，若能模拟白蚁的纤维素酶降解系统，工业化纤维素-葡萄糖-酒精-燃料的生产体系必是解决当前环境问题能源危机的一条重要途径。

至今，国内外对白蚁体内的内源性C型β-葡萄糖苷酶的研究已经逐步加深，目前人们主要集中在对该酶进行结构功能研究，并通过改造获得高表达、高活性的β-葡萄糖苷酶用于工业经济应用(Zhang, et al., 2010)。目前已有的研究显示，该类纤维素水解酶的催化效率较低、人工提取和表达的酶纯化难度较大，若能通过同源建模等手段进行理性分子设计，对白蚁内源性β-葡萄糖苷酶蛋白的催化活性、稳定性、底物特异性、耐热性和耐酸碱性等进行合理化改造，将使此类酶具有更大的应用前景，实现巨大工业经济价值。Hsiao-lin Lee等人（Mutations in the substrate entrance region of β-glucosidase from Trichoderma reesei improve enzyme activity and thermostability）已经在来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶中研究了突变后的酶，获得了一些活性增强的突变体。

本发明从台湾家白蚁的cDNA中克隆得到C型β-葡萄糖苷酶（命名：CfBG Glu1C），根据蛋白质结构预测和同源性序列分析，找出了一系列突变位点，在这些氨基酸位点上进行点突变，得到了一系列突变体酶。经过蛋白质表达与验证，发现有几个突变体酶的催化活性显著增强。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程的手段对白蚁C型β-葡萄糖苷酶(CfBG Glu1C)进行定点突变改造，得到酶活性显著提高的C型β-葡萄糖苷酶突变体，使该酶能更好的应用到工业生产和实际应用中。

本发明提供的一系列定点突变改造的C型β-葡萄糖苷酶突变体，是由来源于白蚁的C型β-葡萄糖苷酶(CfBG Glu1C)进行定点突变产生的。

原亲本C型β-葡萄糖苷酶(CfBG Glu1C)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于原亲本氨基酸序列的第170位的赖氨酸K分别变为丝氨酸S和色氨酸W，第182位的苯丙氨酸F变为甲硫氨酸M，第252位的氨基酸组氨酸H变为天冬酰胺N。

    将定点突变改造获得的C型β-葡萄糖苷酶突变体质粒转入大肠杆菌DH5α（Novagen公司）中，筛选阳性克隆，提取质粒测序后与模板序列SEQ ID NO.1比对，确认得到四个酶活显著提高的突变体。

突变体的表示方法为：Glu1C- 原始氨基酸-位置-突变后氨基酸，所述突变体为：Glu1C- K170S、Glu1C- K170W、Glu1C- F182M、Glu1C- H252N。

本发明的另一目的是提供一种包含有C型β-葡萄糖苷酶突变体DNA序列的突变质粒；

本发明的另一目的是提供一种含有上述突变质粒的重组突变菌株。

所述突变体构建的具体步骤如下：

（1）    突变表达载体的构建：

本发明从实验室饲养的台湾家白蚁的唾液腺和肠道组织中，提取出RNA，经过反转录，得到cDNA。

在NCBI基因数据库查到台湾家白蚁的β-葡萄糖苷酶基因（GenBank 登录号为JN565079），根据序列同源性，设计扩增引物，以得到的台湾家白蚁cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物插入到载体pET-28a（Novagen公司）上的多克隆位点BamH I 和 Xho I之间，转入Ecoli.DH5α（Novagen公司）感受态细胞中，筛选转化子，测序后与已有的序列（JN565079）比对，不完全相同，本实验室得到的重组质粒称为pET-28a-Glu1C。

将所得重组质粒转化入Ecoli.BL21(DE3)（Novagen公司）进行表达，得到C型β-葡萄糖苷酶(CfBG Glu1C)，作为活性测定的对照。

我们在此酶的基础上，对其基因进行突变改造，以pET-28a-Glu1C为模板，设计含有突变位点的核苷酸序列引物，扩增通过PCR扩增得到突变质粒全长序列，将其利用Dpn                                                消化DNA模板后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，经T4 DNA连接酶处理后，将连接产物直接转化到Ecoli.DH5α（Novagen公司）的感受态细胞中，筛选转化子，提取质粒测序，看相应位点上的氨基酸是否突变成功。突变成功的重组质粒称为pET-28a- Glu1C-X（X为原始氨基酸-位置-突变后氨基酸）分别转化Ecoli.BL21(DE3)（Novagen公司）进行表达，即得到对应的突变体表达菌株。

（2）    重组突变体表达菌株诱导表达产生突变体酶

将突变体表达菌株活化后，以1%的接种量转接入200mL的LB培养基（含50μg/mL的卡那霉素）中振荡培养，待OD₆₀₀约为0.4时加入0.2mM的诱导剂IPTG，25℃振荡培养6h。收集菌液，10000g离心收集菌体，加入20mL Tris-HCl缓冲液超声破碎，离心取上清得到突变体酶，分别测定酶活性。

本发明的优点：

通过定点突变技术，对台湾家白蚁C型β-葡萄糖苷酶(CfBG Glu1C)第170位的赖氨酸K、第182位的苯丙氨酸F和第252位的组氨酸H进行改造，构建了C型β-葡萄糖苷酶突变体，显著提高了C型β-葡萄糖苷酶的酶活，本发明得到的突变体分别为Glu1C- K170S、Glu1C- K170W、Glu1C- F182M、Glu1C H252N，这四株突变体的酶活都有了不同程度的提高，分别为5.2倍、2.05倍、2.9倍、2.1倍。这对现今降解生物质尤其是纤维素类具有重大的意义，可以使自然界中的秸秆等在β-葡萄糖苷酶的促进催化作用下，更好更快速的降解产生葡萄糖，实现催化过程的高效优化。产生的葡萄糖又可以进一步参与更多的工业过程，如生物燃料乙醇的生产，生物洗涤剂等一系列相关工艺。通过改造β-葡萄糖苷酶使其活性增强，更能满足社会生产的要求，有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明中所得的突变体的突变位点处核苷酸示意图，箭头指向位点为突变位点；

图2为本发明构建的突变株以及原始菌株中C型β-葡萄糖苷酶的表达情况；

图3为本发明构建的突变株以及原始菌株表达酶的酶活性情况。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：突变表达质粒的构建及重组大肠杆菌的获得

1. 突变表达质粒的构建

根据蛋白质结构预测和同源性序列分析，找出了一系列突变位点，在这些氨基酸位点上进行点突变，得到了一系列突变体酶。经过蛋白质表达与验证，发现有几个突变体酶的催化活性显著增强。构建过程如下：

（1）从实验室饲养的台湾家白蚁的唾液腺和肠道组织中，提取出RNA，经过反转录，得到cDNA。

（2）在NCBI基因数据库查到台湾家白蚁的β-葡萄糖苷酶基因（JN565079），根据序列同源性，设计扩增引物，对步骤（1）得到的白蚁cDNA进行扩增，PCR扩增后，将扩增产物插入到载体pET-28a（Novagen）上的相应的多克隆位点BamH I 和 Xho I之间，转化入Ecoli.DH5α（Novagen）感受态细胞中，筛选转化子，测序后与已有的序列（JN565079）比对，不完全相同，本实验室得到的重组质粒称为pET-28a-Glu1C。

带有限制酶Hind III和Xho I的酶切位点的扩增引物序列如下：

F: BamH I  5'-  CGGGATCCATGTCTGCCCTGAAGTTTCC

R: Xho I  5'-   CCGCTCGAGTCAATGAGAAGTCTCGAC

（3）将得到的重组质粒pET-28a-Glu1C转化入Ecoli.BL21(DE3)（Novagen）进行表达，得到C型β-葡萄糖苷酶(CfBG Glu1C)。

（4）我们在此酶的基础上，对其基因进行突变改造，以pET-28a-Glu1C为突变模板，设计含有突变位点的核苷酸序列引物，以pET-28a-Glu1C为扩增模板，通过PCR反应得到包含突变氨基酸的全长质粒片段。

用于定点突变的引物为：（下划线部分为突变位点）

 K170S -F： P-TSGTCAATTGCTATCGGATATAG

 K170S-R：P-GGGTTCGTTGATAGTGTTCCAC

 K170W-F：P-TSGTCAATTGCTATCGGATATAG

 K170W-R：P-GGGTTCGTTGATAGTGTTCCAC

 F182M -F：P-ATGGCACCTCATATTCTCACC

 F182M -R：P-TCCAAACGGTACGCTATATCCG

 H252N -F：P-AATGTAGGATGGGTGTTACACC

 H252N -R：P-CATCTGCCGCGCTCTCTCAG

PCR反应体系如下：                  

PCR反应程序如下：

95℃  5min 1循环；（95℃   30s；58℃   30s ；72℃     820s ）×30 循环；72℃  7min；4℃  ∞。

    PCR产物片段经Dpn消化DNA模板后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，经T4 DNA连接酶处理后，直接转化到Ecoli.DH5α（Novagen公司）感受态细胞中，筛选转化子，提取质粒测序，得到相应位点上的氨基酸突变的突变体，如图1所示，在序列中相应的位点发生了突变。

2. 重组突变体表达菌株诱导表达产生突变体酶

将突变体表达菌株活化后，以1%的接种量转接入200mL的LB培养基（含50μg/mL的卡那霉素）中振荡培养，待OD₆₀₀约为0.4时加入0.2mM的诱导剂IPTG，25℃振荡培养6h，收集菌液，10000g离心收集菌体，加入20mL Tris-HCl缓冲液超声破碎，离心取上清得到突变体酶，分别测定酶活性。原菌株pET-28a- Glu1C表达产物作为对照。表达情况如图2所示。突变体酶的表达量与未突变的原CfBG Glu1C酶没有显著性差异。

实施例2：突变前后C型β-葡萄糖苷酶的活性测定

按照实施例1中的方法分别对原大肠杆菌pET-28a- Glu1C以及其他突变株进行诱导表达，测定酶活性，得到结果如图3所示，通过附图3可以看出突变之后的菌株酶活性与突变之前的相比，分别提高了5.2倍、2.05倍、2.9倍、2.1倍。

本发明所述的突变之后的酶的活性相对于突变前有了很大的提高。结果表明在关键位点突变氨基酸，可以使该酶的活性及其他性质发生改变，这种策略可以广泛应用于酶学性质的改进，加速了酶在工业生产中的应用，具有重要的社会意义。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏大学

 

<120>  一种C型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌

 

<130>  一种C型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  476

<212>  PRT

<213>  Coptotermes formosanus

 

<400>  1

 

Met Ser Ala Leu Lys Phe Pro Asp Gly Phe Leu Phe Gly Val Ala Thr

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Trp Lys Glu Asp Ser Lys Gly Glu

            20                  25                  30         

 

 

Ser Ile Trp Asp Arg Leu Thr His Asp Arg Pro Glu Val Ile Lys Asp

        35                  40                  45             

 

 

Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Cys Asn Ser Tyr Arg Leu Tyr Lys Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Asp Val Arg Met Leu Lys Asp Leu Gly Val His Phe Tyr Arg Phe Ser

65                  70                  75                  80 

 

 

Ile Ser Trp Pro Arg Ile Leu Pro Thr Gly His Asp Asn Val Val Asn

                85                  90                  95     

 

 

Gln Ala Gly Ile Asp Tyr Tyr Asn Asn Leu Ile Asn Glu Leu Ile Ala

            100                 105                 110        

 

 

Asn Gly Ile Gln Pro Val Val Thr Met Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln

        115                 120                 125            

 

 

Pro Leu Gln Asp Leu Gly Gly Trp Thr Asn Pro Val Leu Ala Asn Tyr

    130                 135                 140                 

 

 

Phe Glu Asp Tyr Ala Arg Val Leu Tyr Ala Asn Phe Gly Asp Arg Val

145                 150                 155                 160

 

 

Lys Trp Trp Asn Thr Ile Asn Glu Pro Lys Ser Ile Ala Ile Gly Tyr

                165                 170                 175    

 

 

Ser Val Pro Phe Gly Phe Ala Pro His Ile Leu Thr Pro Gly His Gly

            180                 185                 190        

 

 

Gln Tyr Leu Val Ile His Thr Ile Leu Leu Ser His Ala Arg Ala Tyr

        195                 200                 205            

 

 

Arg Leu Tyr Glu Arg Glu Phe Lys Ala Thr Arg Gly Gly Lys Val Ser

    210                 215                 220                

 

 

Ile Ala Ala Ser Cys Gln Trp Ile Glu Pro Thr Thr Asp Ser Glu Glu

225                 230                 235                 240

 

 

Glu Glu Glu Ala Ala Glu Arg Ala Arg Gln Met His Val Gly Trp Val

                245                 250                 255    

 

 

Leu His Pro Ile Phe Ser Ala Thr Gly Asp Tyr Pro Pro Val Met Lys

            260                 265                 270        

 

 

Glu Trp Leu Gly Lys Lys Cys Lys Glu Glu Gly Tyr Ser Arg Ser Arg

        275                 280                 285            

 

 

Leu Pro Ser Phe Thr Lys Glu Glu Ile Glu Leu Val Arg Gly Thr Trp

    290                 295                 300                

 

 

Asp Tyr Leu Gly Ile Asn His Tyr Thr Thr Ile Phe Thr Tyr Gln Ser

305                 310                 315                 320

 

 

Asp Lys Gly Glu Phe Ile Phe Thr Asp Met Gly Val Ala Arg Ile Arg

                325                 330                 335    

 

 

His Asp Lys Tyr Ala Met Ala Ala Ser Gly Trp Leu Gln Val Val Pro

            340                 345                 350        

 

 

Trp Gly Phe Arg Lys Leu Leu Asn Trp Ile Ala Lys Glu Tyr Asn Asn

        355                 360                 365            

 

 

Pro Pro Val Leu Ile Thr Glu Asn Gly Phe Ser Asp His Gly Glu Ile

    370                 375                 380                 

 

 

Asp Asp Thr Asn Arg Val Asp Tyr Tyr Ile Lys Tyr Leu Cys Glu Leu

385                 390                 395                 400

 

 

Leu Lys Ala Val Lys Glu Asp Gly Cys Asn Val Phe Gly Tyr Thr Val

                405                 410                 415    

 

 

Trp Ser Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Gly Ala Gly Tyr Thr Glu Arg

            420                 425                 430        

 

 

Phe Gly Leu Phe His Val Asp Phe Asn Asp Pro Asp Arg Lys Arg Thr

        435                 440                 445            

 

 

Ala Lys Lys Ser Ala Glu Phe Phe Ser Lys Leu Ile Lys Ser Asp Ala

    450                 455                 460                

 

 

Ile Pro Val Glu Tyr Leu Ala Val Glu Thr Ser His

465                 470                 475