一种检测喷气燃料中特征真菌Amorphotheca resinae的方法

摘要

本发明提供一种检测喷气燃料中特征真菌Amorphotheca resinae的方法，设计了1套LAMP引物，建立了反应温度63℃，时间35min，LFD试纸条直接观察的检测体系，并随后进行了特异性和灵敏度评价。结果显示，应用LAMP-LFD方法对A.resinae基因组DNA和纯培养物检测最低检测线分别为26fg/μL和8cfu/mL；特异性验证实验中，用喷气燃料中曾发现的4株真菌，绿色木霉、绳状青霉菌、黑曲霉、出芽短梗霉和A.resinae作为特异性试验菌株，LAMP-LFD法检测只对A.resinae呈阳性反应。本发明的检测方法能快速检测喷气燃料中的A.resinae，且结果可视化。该方法耗时短、操作简便、特异性强、灵敏度高、不依赖特殊检测设备，作为一种全新的检测方法有望在将来用于检测喷气燃料中特征真菌A.resinae的实地现场检测。

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测喷气燃料中特征真菌Amorphotheca resinae的方法。

背景技术

Amorphotheca resinae中文名为树脂枝孢霉，是一种能在喷气燃料中生长的真菌。有研究发现A.resinae与储备喷气燃料中的悬浮物有关，而悬浮物是影响喷气燃料洁净性的一个重要指标。A.resinae是喷气燃料中的主要污染菌，有93％的污染案例都是由该真菌引起。检测A.resinae是为了提高喷气燃料被污染的预警能力。目前，国际航空运输协会(The International Air Transport Association，IATA)推荐了4种检测方法针对飞机油箱中的微生物，但是针对检测A.resinae并不常见，MicrobMoiter2、Easicult Combi是一种运用培养基培养微生物的定量评估方法，在适宜的温度(28～30℃)下需要培养1～4d，若温度不适宜培养时间需长达6d。FUELSTAT^TM resinae是一种免疫检测法，定性评估真菌污染情况，虽然检测时间短但不是单一针对A.resinae这种特征真菌。HY-LiTE Jet A1是快速定量评估ATP的方法，需要购买特定的仪器及对应的试剂，设备较昂贵。以上4种方法均为国外研发，在国内鲜有使用。实验室中常使用的检测方法为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法检测，PCR需要昂贵的实验仪器，而且该方法需要凝胶电泳装置和呈相系统，在凝胶时需要荧光染料溴化乙啶(ethidium bromide，EB)等有毒试剂，还需配置大体积的电泳缓冲液，操作复杂且耗时长。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测喷气燃料中特征真菌Amorphotheca resinae的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种检测真菌Amorphotheca resinae的LAMP引物组，包括有：

F3：TAAATAGCCAGGCCCGCTT(SEQ ID NO:1)、

B3：AGGCATTCCTCGTTGAAGAG(SEQ ID NO:2)、

FIP(SEQ ID NO:3)：

GCGGCCCAGAACATCTAAGGG-AGAGGGACTATCGGCTCAAG、BIP(SEQ ID NO:4)：

GCGCTACACTGACAGAGCCAA-CCCCAGCACGACAGAGTT、LF(SEQ ID NO:5)：TTGCCTCAAACTTCCATCGG。

其中FIP用生物素标记，在LF上加上FITC；

上述的引物组用于制备检测真菌Amorphotheca resinae的制品；

所述的制品优选为试剂盒。

上述的引物组用于检测喷气燃料中的真菌Amorphotheca resinae；其中结果用LFD试纸条进行检测。

本发明建立了A.resinae的LAMP-LFD检测方法，运用该方法可快速检测特征真菌A.resinae，进而对喷气燃料中是否存在A.resinae污染作出判断。本发明的方法具有操作简便、检测时间短、特异性好、灵敏度高、结果直观可见的特点。运用本发明的方法对储备中的喷气燃料进行检测，能更好地提高了特征真菌污染喷气燃料的预警能力，这对保障喷气燃料质量及飞机的飞行安全有着重要的意义。

具体实施方式

本发明所使用的Amorphotheca resinae、绿色木霉(Trichoderma viride CGMCC3.2942)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum CGMCC3.3875)、黑曲霉(Aspergillus niger CGMCC3.3928)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans CGMCC3.3984)均可为市售的菌株，例如购自中国武汉普通微生物菌种保藏管理中心。

以上菌种均选用沙保氏液体培养基培养，放置于摇床培养4d，温度为25℃。沙保氏液体培养基的制备简述：4g葡萄糖、1g蛋白胨加入100mL的去离子水中混匀，115℃高压灭菌20min，贮存备用。

实施例1:引物设计与合成

申请人在长期的研究中发现，喷气燃料中的真菌除A.resinae外，还会有绿色木霉(Trichoderma viride)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，因此，将A.resinae18S基因序列于上述四种细菌进行比对后，筛选出A.resinae的特异性序列设计LAMP组，再经过灵敏性和特异性筛选后，获得包括外引物(F3、B3)、内引物(FIP、BIP)、环引物(LF、LB)共6条LAMP引物(表1)。其中FIP用生物素标记，在LF上加上FITC。引物由大连宝生物公司合成。

表1：A.resinae LAMP引物序列

实施例2：A.resinae的检测

以A.resinae的基因组DNA作为模板进行扩增条件优化。LAMP法DNA反应试剂盒购自荣研生物科技有限公司。各引物浓度为：FIP-bio和BIP各1.6μmol/L，F3和B3各0.2μmol/L，LF-fitc和LB各0.8μmol/L；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO₄8mmol/L，(NH₄)₂SO₄10mmol/L，Tween200.1％，Betaine 0.8mol/L，dNTPs 1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶；A.resinae基因组DNA用试剂盒法提取。LFD采用德国Milenia GenLine HybriDetect试剂盒。LAMP-LFD反应体系见表2。

表2：LAMP-LFD反应体系

双蒸水定容至25μL，阴性对照实验不加DNA模板。在优化的反应温度和时间下进行扩增，通过LFD试纸条(LAMP-LFD检测方法)以及1％的琼脂糖凝胶电泳检测反应情况。

对LAMP反应条件进行优化，选择61、63、65℃3个不同的反应温度进行LAMP扩增,反应进行15min后每隔10min停止一个LAMP试验并将其灭活用LFD试纸条进行检测，看是否出现扩增。阴性对照管在最后一个反应时间取出，并进行LFD检测，看是否出现假阳性现象。最终选择63℃，35min作为后续LAMP-LFD扩增的最佳反应条件。

以实施例1中设计的LAMP外引物F3、B3为PCR引物对A.resinae进行模板DNA扩增，反应各组分浓度为：10μmol/L F3和10μmol/L B3各1μL，Premix Taq酶(TaKaRa)25μL，A.resinae模板3μL，蒸馏水定容至50μL体系。优化后 的PCR反应条件：预变性95℃5min；95℃40s，51℃40s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

LAMP-LFD的特异性试验：

选取绿色木霉(Trichoderma viride)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)4株真菌作为阴性待测菌株特异性试验菌株，提取真菌的DNA，用建立的LAMP-LFD方法和PCR方法分别对实验菌株进行扩增，试纸条和1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

对A.resinae及4种曾经在喷气燃料中出现真菌进行检测。凝胶电泳结果和LFD试纸条结果和LAMP扩增产物凝胶电泳结果都显示A.resinae呈阳性，其余4株真菌呈阴性，蒸馏水作为阴性对照无扩增，特异性良好。PCR扩增结果显示，A.resinae出现扩增，短梗霉(Aureobasidium pullulans)、木霉菌(Trichoderma viride)、曲霉菌(Aspergillus niger)出现非特异性扩增，青霉菌(Penicillium funiculosum)未出现扩增。LFD试纸条结果显示只有A.resinae呈阳性反应，其余均呈阴性。

上述的结果表明本发明的引物组能够保证检测时的特异性。

LAMP-LFD的灵敏度试验：

用试剂盒法提取的A.resinae基因组DNA，并检测其浓度，以10倍梯度稀释，稀释DNA原液至10^-9，选取各个稀释度作为模板用于比较文中建立的LAMP-LFD和PCR扩增灵敏度差异。

将培养4天的A.resinae培养液以10倍梯度稀释，稀释原菌液至10^-6，取各稀释度菌液1mL进行平板计数，同时取各稀释度菌液1mL用Chelex-100法提取DNA，并作为LAMP-LFD扩增模板。

提取的A.resinae基因组DNA浓度为26ng/μL，将其进行10倍梯度稀释，LFD试纸条结果表明稀释倍数为10⁰至10^-5时凝胶显示条带明显，稀释倍数为10^-6时还能获得扩增条带，即检测的最低稀释浓度为10^-6，模板浓度为26fg/μL。凝胶电泳图显示稀释度10⁰至10^-3扩增条带明显，稀释倍数为10^-5时还能获得扩增条带，即PCR扩增最低浓度为260fg/μL。上述结果表明本发明的引物组能够保证检测时的灵敏性。

实施例3：喷气燃料样品的检测应用

从9个储罐底部取样，将每个油样100mL经0.45μm滤膜抽滤，收集滤膜并分别对几个样进行标记Jet fuel 1、Jet fuel 2、Jet fuel 3、Jet fuel 4、Jet fuel 5、Jet  fuel 6、Jet fuel 7、Jet fuel 8、Jet fuel 9，收集的滤膜用500μL 10％chelex-100反复洗脱，收集洗脱液于1.5mL的EP管内，用chelex-100法提取DNA模板。并用已设计好的LAMP-LFD方法检测是否存在A.resinae；结果如表3所示。

表3：LAMP-LFD与培养法对喷气燃料样品检测结果

注：+.阳性；—.阴性

上述结果表明本发明的引物组及检测方法所获得的结果与细菌培养的结果一致，证明了本发明的可靠性。