四种真菌毒素高效液相色谱检测方法的建立和山东省饲料中真菌毒素污染调查

摘要

真菌毒素是由真菌或霉菌产生的有毒次级代谢产物，广泛污染各种饲料原料和成品饲料。动物食入被真菌毒素污染的饲料会造成动物的真菌毒素中毒。进而影响动物生产成绩，也会给人类健康带来极大的影响。因此加强检测技术的研究，能为进一步的去毒技术研究提供技术支撑，就显得特别重要。
　　 真菌毒素F-2，又名玉米赤霉烯酮(Zearalenone，F-2)为白色晶体，是由多种镰刀菌在代谢过程中产生的一种非类固醇结构产物，其具有雌激素样活性，主要对动物繁殖机能造成影响。
　　 真菌毒素T-2属于单端孢酶烯族毒素。单端孢酶烯族毒素是一大类化学结构相似的倍半萜烯类化合物，是头孢菌、镰孢菌、葡萄状穗霉和木霉菌等真菌的次级代谢产物。根据结构可分为A、B、C和D组。A组主要包括T-2毒素、HT-2毒素和蛇形菌素等;B组主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)等;C组主要包括扁虫菌素和燕茜素等;D组主要包括黑葡萄穗霉毒素和杆孢菌素等。T-2毒素具有肠毒性、肝毒性及其它毒性作用。
　　 伏马菌素(FB)是由串珠镰刀菌产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。到目前为止，发现的伏马菌素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11种，其中FB1是其主要组分。FB1具有神经毒性、肺毒性、免疫毒性、致癌性、胚胎毒性、植物毒性等多种毒性作用。
　　 黄曲霉毒素(AFT)是黄曲霉(asergillus flavus)和寄生曲霉(aspergillus parasiticus)等真菌产生的一大类结构相似的次级代谢产物。目前已发现黄曲霉毒素及其衍生物有18种，即B1、B2、G1、G2、M1、M2以及B2。、G2a、P1、Q1、R0等，其中除AFB1、BZ和AFTGI、GZ为天然产生的以外，其余的均为它们的衍生物。它们的毒性强弱与其结构有关，凡吠喃环末端有双键者，毒性强，并有致癌性。已证明AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTM1都可以诱发多种试验动物发生肝癌。在这些毒素中又以AFTB1的毒性及致癌性最强。
　　 本论文主要研究真菌毒素F-2、T-2、FB1、AFTB1的高效液相色谱检测技术。本文建立的高效液相色谱检测技术为科研机构和大型饲料企业集团的快速、高效、精准、经济的检测饲料中F-2毒素、T-2毒素、FB1毒素、AFTB1毒素提供了检测方法和技术支持，并为下一步的饲料去毒、脱毒、转化、机理研究等，减少霉菌毒素对动物的危害提供了技术支撑。
　　 试验一F-2毒素的高效液相色谱检测方法的建立
　　 建立和改良了高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)定量检测饲料中镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA，又名F-2）的方法。采用层析柱和免疫亲和柱结合净化提取液的方法，优选确定了乙腈-水（体积分数，9∶1）为最佳提取溶液，优选确定了色谱条件为流动相:甲醇-水-乙腈（体积分数，10∶46∶44）;检测波长（激发波长Ex274 nm，发射波长Em440 nm）;柱温25℃;流速0.6 mL·min-1。高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)对F-2毒素进行定量分析，F-2毒素在0.025～0.8μg·mL-1范围内线性关系良好，线性方程为:y=1416362.2459x+2771.5771，线性回归良好，相关系数R2=1.0000，加标回收率高达88.74％,检测限为5.7 ng·mL-1，定量限(LOQ)为19μg·kg-1，相对标准偏差（RSD）低于4.15％。高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)精确、灵敏度高可作为定量检测F-2毒素的有效手段。
　　 试验二T-2毒素的高效液相色谱检测方法的建立
　　 建立和改良了T-2毒素的高效液相色谱检测方法，以甲醇-水为提取溶液，采用硅镁吸附剂层析柱结合T-2毒素免疫亲和柱两阶段净化、柱后衍生，确立了饲料中T-2毒素的高效液相色谱结合荧光器检测的方法。衍生液选用2-萘酰氯(2-NC)，4-甲基氨基吡啶(DMAP)做为反应促进剂。本方法确立的提取溶液为甲醇-水（体积分数;80∶20），确立的色谱检测条件为流动相:乙腈-水（体积分数;75∶25）;激发波长(Ex)381 nm，发射波长(Em)470 nm;流速是0.6 mL·min-1;柱温是30℃;进样量20μL。流动相经过抽滤和超声处理。该方法的检测限是1.8 ng·mL-1，定量限为6×103 ng·kg-1，相对标准偏差（RSD）低于4.25％，回收率72.24％～83.31％。T-2毒素在25～800 ng·mL-1范围内，线性回归良好，线性方程为:y=2186.2x-31953，相关系数R2=0.9992，本方法简单快速、灵敏、准确、重复性好，能满足饲料中检测T-2毒素的需要。
　　 试验三FB1毒素的高效液相色谱检测方法的建立
　　 建立和改良了伏马菌素B1(FB1)毒素的高效液相色谱检测方法，以乙腈-水-乙酸（体积分数，49∶50∶1）为提取溶液，采用硅镁吸附剂层析柱结合FB1毒素免疫亲和柱两阶段净化、柱后衍生，确立了饲料中FB1毒素的高效液相色谱结合荧光器检测的方法，衍生液选用邻苯二甲醛(OPA)。本方法确立的提取溶液为乙腈-水-乙酸（体积分数，49∶50∶1）;色谱检测条件为流动相:甲醇-0.1mol·L-1磷酸二氢钠(体积分数;77∶23)，用磷酸调至pH3.3左右，流动相过0.45μm滤膜;流速0.6 mL·min-1;荧光检测条件为激发波长(Ex)333 nm;发射波长(Em)440 nm;柱温:30℃;进样量20μL。流动相经过抽滤和超声处理。该方法的检测限是2.16 ng·mL-1，定量限为7.2μg·kg-1，加标400μg·kg-1，相对标准偏差（RSD）低于3.9％，回收率95.03％，FB1毒素在25～1000 ng·mL-1范围内，线性回归良好，线性方程为:y=20257x-104237，相关系数R2=0.9996，本方法简单快速、灵敏、准确、重复性好，能满足饲料中检测FB1毒素的需要。
　　 试验四黄曲霉毒素B1(AFTB1)的高效液相色谱检测方法的建立
　　 建立和改良了黄曲霉毒素B1(AFTB1)的液相色谱检测方法，以乙腈-水-乙酸（体积分数，84∶15∶1）为提取溶液，采用硅镁吸附剂层析柱结合AFTB1毒素免疫亲和柱两阶段净化、柱后衍生，确立了饲料中AFTB1毒素的高效液相色谱结合荧光器检测的方法，衍生液选用三氟乙酸(TFA)。本方法确立的提取溶液为乙腈-水-乙酸（体积分数，84∶15∶1）;色谱检测条件为流动相:乙腈-水(体积分数，25∶75)，流动相过0.45μm滤膜;流速0.6 mL·min-1;荧光检测条件:激发波长(Ex)360 nm;发射波长(Em)440 nm;柱温:30℃;进样量20μL。流动相经过抽滤和超声处理。该方法的检测限是0.034 ng·mL-1，定量限为0.114μg·kg-1，加标100μg·kg-1，相对标准偏差（RSD）低于4.4％，回收率93.17％，AFTB1毒素在0.5～100 ng·mL-1范围内，线性回归良好，线性方程为:y=118682x-35105，相关系数R2=0.9999。该方法简单快速、灵敏、准确、重复性好，能满足饲料中检测AFTB1毒素的需要。
　　 试验五山东省饲料中四种真菌毒素污染调查
　　 为了具体地了解饲料中真菌毒素的污染状况，于2011年的1月～10月对来自山东省的济南、济宁、菏泽、聊城、德州、滨州、东营、淄博等17个地区的420份饲料样品进行了F-2、T-2、FB1、AFTB1毒素的含量进行了检测。全部420份饲料样品中F-2毒素、T-2毒素、伏马菌素B1(FB1)、黄曲霉毒素B1(AFTB1)的检出率分别为85.24％、79.52％、96.19％、83.81％;说明在全部饲料样品中F-2毒素、T-2毒素、伏马菌素B1(FB1)、黄曲霉毒素B1(AFTB1)的污染范围广;F-2毒素、T-2毒素、伏马菌素B1(FB1)、黄曲霉毒素B1(AFTB1)的阳性样品中毒素平均含量分别为410.16μg·kg-1、78.73μg·kg-1、2583.85μg·kg-1、12.75μg·kg-1，说明污染程度属伏马菌素B1(FB1)最重，黄曲霉毒素B1(AFTB1)最轻;从超标率看，T-2毒素为零，说明T-2毒素污染较轻或制定的限量标准过于宽泛;而F-2毒素为37.99％，FB1毒素为70.79％，黄曲霉毒素B1为20.45％;说明超标率最重的是FB1毒素，其次是F-2毒素，再次是黄曲霉毒素B1。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语表

第一篇 综述部分

第一章 饲料中真菌毒素的毒性及危害

1 玉米赤霉烯酮

2 单端孢霉烯族毒素

3 伏马菌素

4 黄曲霉毒素

5 赭曲霉毒素

6 杂色曲霉毒素

参考文献

第二篇 试验部分

第二章 F-2毒素液相色谱检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 T-2毒素液相色谱检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 伏马菌素B1液相色谱检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 黄曲霉毒素B1(AFTB1)液相色谱检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第六章 山东省饲料中真菌毒素污染调查

1 样品与检测方法

2 仪器与试剂

3 真菌毒素限量标准和污染程度判定标准

4 结果

5 讨论

参考文献

全文总结

全文创新点

附录

致谢

攻读博士学位期间发表和完成的学术论文