影响中国西门塔尔牛脂肪沉积的FDFT1基因关键位点

摘要

本发明公开了一种影响中国西门塔尔牛脂肪沉积的FDFT1基因关键位点，涉及中国西门塔尔牛脂肪沉积性状相关FDFT1基因单核苷酸多态性的检测方法，该方法以中国西门塔尔牛基因组DNA或包含中国西门塔尔牛FDFT1基因的DNA序列为模板，利用PCR引物对P1和P2，扩增中国西门塔尔牛FDFT1基因功能区域片段，通过测序筛查，限制性内切酶Hae-III和Hpa-II进行酶切、电泳分析，从而确定中国西门塔尔牛FDFT1基因第4内含子第130位的SNP1（T>C）和第8外显子第500位的SNP2（C>T）。筛查获得的SNPs中SNP1位点的T等位基因和TT基因型及SNP2位点的C等位基因和CC基因型可作为显著提高中国西门塔尔牛脂肪沉积和肌间脂肪酸含量性状的有效分子遗传标记，以用于肉牛肉质性状早期标记辅助选择分子育种。

说明书

技术领域

本发明公开一种影响中国西门塔尔牛脂肪沉积的FDFT1基因关键位点，涉及中国西门塔尔牛脂肪沉积性状相关FDFT1基因单核苷酸多态性及其检测方法和其作为辅助选择标记在肉乳兼用牛育种中的应用，属于肉乳兼用牛选育技术领域。

背景技术

中国西门塔尔牛是我国于20世纪五十年代引进后自主培育的大型肉乳兼用品种。以其独特性和良好的肉乳生产性能在中国草原、平原、山地和丘陵等地区被广泛推广，并表现出其作为新的肉乳兼用型牛品种的巨大优势和发展潜力，成为国内饲养最多，分布最广泛的兼用牛品种，是目前我国肉牛产业化生产中的主导品种。随着国内外市场的变化及消费者对牛肉需求程度的提高，中国西门塔尔牛肉用性能进一步选育和提高成为该品种的主要目标。要提高肉用性能就必须采用常规育种技术和分子育种方法从肉用性状各重要指标方面进行选育。

消费者对畜禽肉品质的下降日益感到关切，迫使肉牛生产者和肉牛的育种改良计划都把肉质性状列为重要的指标。肉质和脂肪沉积性状是肉乳兼用牛重要的经济性状，随着养牛业集约化、规模化的快速发展，对育肥期内生长速度快、发育好、脂肪沉积能力强的肉牛品种的需求也越来越大。脂肪沉积性状是评判牛肉品质优劣的重要指标，使背腰最长肌肌内脂肪沉积维持较为丰富的水平是当前提高牛肉品质的主要育种目标之一。在肉牛生长发育过程中，骨骼和肌肉等组织的增长速度随着年龄和体重的增加呈现逐渐下降趋势，而脂肪组织沉积速度则呈现上升趋势。脂肪沉积的发生和发育包括皮下脂肪沉积，内脏周围脂肪沉积，肌肉间脂肪沉积以及肌肉内脂肪沉积。

中国西门塔尔牛经过多年持续选育，具备了体大、耐粗饲、肉用性能好等优点。其中一些优良个体具有相当好的肉用体型，其产肉性能在良好营养条件下，可以达到欧美优良肉牛品种生产水平。但是由于向肉用方向选育程度还很低，尚存在脂肪沉积能力低、后躯肌肉不丰满、优质高档肉块产量少等不足之处，需要进一步选育提高。

根据生产性状的表型值估计育种值进行肉牛的选种和培育，已经极大促进了肉牛生长发育和肉质性状的遗传改良。但是脂肪沉积性状的测定只能在肉牛屠宰时才能测量，这就意味着昂贵的同胞和后裔测验才有助于育种工作。随着现代分子生物学技术的飞速发展，以分子标记为核心的分子标记辅助选择和主效功能基因筛查等分子育种技术与常规育种技术相结合大大加速了肉牛育种的进程。目前筛查对目标性状具有较大作用的主效基因及其与之紧密连锁的分子标记成为肉牛分子育种的基础和前提，也是将来肉牛分子生物学领域研究的重点。

脂肪沉积和代谢通路中，法尼基二磷酸法尼基转移酶1基因（farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1，FDFT1）编码一个由417个氨基酸组成的位于甲羟戊酸途径分支点上的一种膜关键酶---鲨烯合成酶。该酶可以催化两分子的法尼基二磷酸经还原性二聚作用缩合成前角鲨烯二磷酸，后者在辅酶NADPH的作用下通过异裂、异构化生成鲨烯，鲨烯再经过多步反应最终生成胆固醇。脂肪酸和胆固醇对维持动物细胞膜结构、能量代谢和细胞内信号传导等都有非常重要的作用, FDFT1在脂肪代谢和胆固醇代谢过程中具有重要作用，尤其在脂肪酸生成和分解代谢途径中发挥复杂而又精密的调剂作用。牛的FDFT1基因位于8号染色体短臂，基因全长26.45 kb包括8个外显子和7个内含子，mRNA长为2022 bp，CDS序列长为1254 bp，编码417个氨基酸。目前关于FDFT1基因与牛脂肪沉积、胴体组成和肉品质性状相关性的研究尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于并提供一种影响中国西门塔尔牛脂肪沉积的FDFT1基因关键位点，涉及中国西门塔尔牛脂肪沉积性状相关FDFT1基因单核苷酸多态性及其检测和应用方法，

本发明提供的一种中国西门塔尔牛脂肪沉积性状相关FDFT1基因遗传标记的检测方法，是通过以下技术方案来实现：

利用DNA池测序和PCR-RFLP技术筛查和检测中国西门塔尔牛FDFT1基因功能突变的的方法。通过关联分析寻找与中国西门塔尔生长发育和脂肪沉积性状相关的SNPs作为分子遗传标记，应用于肉牛早期选择和分子聚合育种，进一步加快中国西门塔尔牛生长发育和肉用性能的选育和提高。

本发明提供一种检测中国西门塔尔牛脂肪沉积性状的遗传标记，其特征在于：

核苷酸序列如序列表Seq ID NO.3和Seq ID NO.6所示，在序列表Seq ID NO.3第149bp处有149T-149C的突变，导致Hae-III-RFLP多态性；在序列表Seq ID NO.6第390处有390C-390T的突变，导致Hpa-II-RFLP多态性。

本发明公开的中国西门塔尔牛脂肪沉积性状遗传标记的检测方法，其特征在于，

设计扩增如权利要求1 所述的中国西门塔尔牛FDFT1基因遗传标记的引物对，得到的引物序列如下所示：

P1正向引物F：5' CCTGGAGGACTTCCCAACGGTAG   3'，

       P1反向引物R：5' CCTGGAGAATGCTATGGACAGAGGG 3'；

       P2正向引物F：5' CTACTCGCCCATCTACCTGTCG  3'，

P2反向引物R：5' TCACACCTGCTACATTCAAGTCC 3'；

用所示的特异性引物在中国西门塔尔牛基因组中进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，其中分别包括FDFT1基因130T>C和500 C>T的单核苷酸碱基突变，并且利用PCR-RFLP方法对中国西门塔尔牛群体中FDFT1基因2个SNPs进行了检测。

本发明所述中国西门塔尔牛脂肪沉积性状遗传标记的检测方法，其特征在于，

所述的PCR扩增条件是：25 μL反应体系，包括DNA 模板（50 ng/μL）1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、dNTPs（2 mmol/L）2.5 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL、Mg²⁺（25 mmol/L）1.5 μL、10×PCR 缓冲液2.5 μL、超纯水15.2 μL； 所述的PCR 扩增反应程序为：95℃变性5 min，95℃变性30 s，57℃（P1）、60℃（P2）退火45 s，72℃延伸30 s，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。

本发明所述中国西门塔尔牛脂肪沉积性状遗传标记的检测方法，其特征在于：

检测中国西门塔尔牛群体遗传标记的限制性内切酶为：SNP1（I4-130 T>C）为HaeIII内切酶，在功能区域识别序列为GG/CC；SNP2（E8-500 C>T）为HpaII内切酶，在功能区域识别序列为C/CGG。

本发明与现有技术相比具有以下的积极效果：

本发明把DNA池测序筛查SNP与PCR-RFLP 结合起来解决了SSCP的繁琐和不稳定性，提供了一种简单、快速、低成本、精确度高、便于在DNA水平上筛查和检测与中国西门塔尔牛脂肪沉积性状密切相关的FDFT1等基因的遗传标记，可用于肉牛的分子聚合育种。

本发明筛查获得中国西门塔尔牛群体中FDFT1基因2个SNPs位点不同基因型个体与部分脂肪沉积性状间显著相关，可用于肉牛的早期辅助选择和分子聚合育种。

附图说明

图1 中国西门塔尔牛FDFT1基因P1引物对扩增、测序和酶切；

a.为中国西门塔尔牛FDFT1基因第4内含子P1引物对PCR扩增产物电泳图；b.为中国西门塔尔牛FDFT1基因第4内含子第130位T>C突变位点测序图；c.为中国西门塔尔牛FDFT1基因第4内含子突变位点HaeIII酶切图。

图2中国西门塔尔牛FDFT1基因P2引物对扩增、测序和酶切；

a.为中国西门塔尔牛FDFT1基因第4内含子P2引物对PCR扩增产物电泳图；b.为中国西门塔尔牛FDFT1基因第4内含子第500位C>T突变位点测序图；c.为中国西门塔尔牛FDFT1基因第4内含子突变位点HpaII酶切图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

牛FDFT1基因片段的获得及功能区域多态性检测方法的建立。

1.1 试验材料：449头28月龄中国西门塔公牛来自内蒙古通辽市宝龙山肉牛育肥场。颈静脉采血，所采血样均为10 mL/头，用ACD抗凝剂抗凝，-20℃冻存。用基因组DNA提取试剂盒从血样中提取基因组DNA。

1.2 引物设计及PCR扩增：选择中国西门塔尔牛为试验材料，根据牛FDFT1基因序列设计以下2对引物：

P1正向引物F：5' CCTGGAGGACTTCCCAACGGTAG   3'，

       P1反向引物R：5' CCTGGAGAATGCTATGGACAGAGGG 3'；

       P2正向引物F：5'   CTACTCGCCCATCTACCTGTCG  3'，

P2反向引物R：5' TCACACCTGCTACATTCAAGTCC 3'；

用上述引物对在中国西门塔尔牛基因组中进行PCR扩增。PCR扩增反应为25 μL体系，包括：上、下游引物（10 μmol/L）1 μL；dNTPs（2 mmol/L）2.5 μL；Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL；DNA 模板（50 ng/μL）1 μL；Mg²⁺（25 mmol/L）1.5 μL；10×PCR 缓冲液2.5 μL；超纯水15.2 μL。PCR 扩增反应程序：95℃变性5 min；95℃变性30 s， 57℃（P1）、60℃（P2）退火45 s，72℃延伸30 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min。

PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后获得目的基因片段P1和P2（图1a和图2a所示）。凝胶回收纯化目的基因片段，pMD18-T载体连接、转化DH5α，菌液PCR检测后，阳性克隆进行测序和系列比对分析。FDFT1基因功能区域存在2个突变位点：130 T>C和500 C>T，碱基突变引起HaeIII和HpaII酶切位点多态（图1b和图2b所示）。（其中P1片段本身不含有酶切识别位点，经修饰后，即将I4-131位点的T碱基修饰成C碱基，从而创造出符合HaeIII内切酶的识别位点。）

1.3 PCR-RFLP 检测：每个样本取10 μL PCR 产物用限制性内切酶（HaeIII和HpaII）进行酶切，以检测中国西门塔尔牛群体多态性。酶切反应总体积为20μL，其中RNase Free水7.5 μL，内切酶(10 u/μL) 0.5 μL，10×buffer 2 μL，37℃恒温条件下酶切4 h，经2.5%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统观察并记录酶切分型结果。

酶切图谱如图1c和图2c所示，对于SNP（I4-130 T>C）和（E8-500 C>T）均显示3 种基因型：SNP（I4-130 T>C）仅有174 bp 目的片段的样本不含HaeIII 酶切位点，命名为TT 型；含有148 bp和26 bp两条带的为含有HaeIII酶切位点的纯合型（26bp片段较小，电泳时跑出凝胶），命名为CC 型；同时含有174 bp、148 bp和26 bp三条带的为杂合型样本，命名为TC 型。TT 和CC 相比在内含子4非编码区的130 bp处有一个T>C的突变。当I4-130 bp 处为C时，HaeIII酶切产生148 bp和26 bp的片段；当I4-130bp 处为T 时，无HaeIII酶切位点。

SNP(E8-500 C>T) 所在的目的片段中含有两个HpaII酶切位点，其中一个为固定存在，位于99bp处，因此无论样本是否发生突变，电泳结果中总会显示出长度为99bp的条带。含有99bp和472bp的仅含一个HpaII酶切位点，命名为TT型；含有99bp、182bp和290bp的为含有两个HpaII酶切位点的纯合型，命名为CC型；同时含有99bp、182bp、290bp和472bp四条带的为杂合型样本，命名为CT型。CC和TT相比在外显子8非编码区的500 bp处有一个C>T的突变。当E8-500bp 处为C时，HpaII酶切产生99bp、182bp和290 bp的片段；当E8-500bp 处为T时，HpaII酶切产生99bp和472bp的片段。

实施例2

筛查获得的FDFT1基因遗传标记在中国西门塔尔牛群体中的多态性分布检测。

在中国西门塔尔牛群体中检测FDFT1基因第4内显子PCR-Hae-III-RFLP和第8外显子PCR-Hpa-II-RFLP多态性分布频率。检测结果显示，SNP1（I4-130 T>C）的三种基因型中，野生型TT个体所占比例较高。SNP2（E8-500 C>T）虽位于外显子中，但并不编码蛋白质，而是位于下游调控区域。该SNP的三种基因型中突变纯合个体TT 基因型个体最少，野生型CC基因型个体分布最多，在群体中占优势，为0.66；等位基因C频率为0.81，为优势基因（表1）。

表1.中国西门塔尔牛群体FDFT1基因内含子区T130C和外显子区C500 T突变位点基因频率及基因型频率。

实施例3

筛查获得的FDFT1基因功能区域遗传标记与中国西门塔尔牛脂肪沉积性状的关联分析及应用。

性状测定：研究的脂肪沉积和肉品质性状包括胴体重、屠宰率、肾脏、肾脏脂肪、生殖器脂肪、胴体长、胴体深、胴体胸深、后腿围、后腿宽、后腿长、大腿肉厚、腰部肉厚、背膘厚、脂肪覆盖率、大理石花纹、眼肌面积，背腰最长肌间不饱和脂肪酸含量等。所有性状的测定根据国家标准GB/T1723821998 执行。

为了确定FDFT1基因内含子区T 130C和外显子区C 500 T突变位点与中国西门塔尔牛的脂肪沉积和肉品质性状的相关性，采用实施例1所建立的Hae-III-RFLP和Hpa-II-RFLP方法进行多态性检测，采用SPSS 13.0的ANOVA方法分析各SNPs不同基因型对中国西门塔尔杂交牛脂肪沉积和肉品质性状的影响，各基因型间的多重比较采用Duncan法。

牛FDFT1基因内含子区T 130C和外显子区C 500 T多态位点各基因型与脂肪沉积和肉质性状的最小二乘均值及标准误如表2和表3所示。SNP1（130 T>C）主要与部分中国西门塔尔牛的脂肪沉积性状显著相关，具体表现在肾脏脂肪重方面，TT基因型个体显著高于CT和CC基因型个体（p<0.05）；在脂肪覆盖率方面，该位点的TT基因型个体显著高于CT基因型个体（p<0.05）。

SNP2（500 C>T)主要与部分中国西门塔尔牛的胴体和肉品质性状显著相关。胴体长方面，CT基因型个体与CC基因型个体之间出现极显著差异（p<0.05）；胴体深方面，TT基因型个体显著高于CC基因型个体（p<0.05）；背膘厚方面，TT基因型个体显著高于CT基因型个体（p<0.05）；后腿长方面，TT基因型个体极显著高于CC基因型个体（p<0.01），显著高于CT基因型个体（p<0.05）。在脂肪覆盖率方面，CC基因型个体极显著高于TT基因型个体（p<0.01）。

结果表明，牛FDFT1基因的SNP1和SNP2位点处T>C与C>T的突变导致中国西门塔尔牛群体中部分携带TT基因型（130 T>C位点）和C等位基因（500 C>T位点)的个体在皮下脂肪沉积和内脏周围脂肪沉积方面具有优势，这些SNPs可以作为分子遗传标记应用于肉牛生产和优良肉牛的选育。

表2. 牛FDFT1基因FDFT1-I4-130 T>C（Hae-III-RFLP）多态位点基因型与脂肪沉积和肉品质性状的关联分析。

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，同列不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。

表3.牛FDFT1基因FDFT1-E8-500C>T（Hpa-II-RFLP）多态位点基因型与脂肪沉积和肉品质性状的关联分析。

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，同列不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)

牛FDFT1基因SNPs基因型与西门塔尔牛背腰最长肌肌间14种不饱和脂肪酸含量的相关性分析结果显示，在检测、筛查到的2个SNPs中，SNP1(I4-130 T>C)位点与α亚麻酸的含量存在显著相关性，TC基因型个体显著高于TT基因型个体(p<0.05，表4)。SNP2(E8-500 C>T)位点则与珠光脂酸、二十碳一烯酸和花生四烯酸的含量存在显著相关性，与花生酸的含量极显著相关。中国西门塔尔牛群体中，携带TT基因型个体背腰最长肌珠光脂酸含量显著低于CC基因型个体(p<0.05，表4)；TT基因型个体背腰最长肌二十碳一烯酸含量显著高于CC基因型个体(p<0.05，表4); CC基因型个体背腰最长肌花生四烯酸含量显著高于CT基因型个体(p<0.05，表4)；TT基因型个体背腰最长肌花生酸含量极显著高于CT、CC基因型个体(p<0.01，表4)。结果表明，牛FDFT1基因的SNP1和SNP2位点处T>C与C>T的突变导致中国西门塔尔牛群体中部分携带C等位基因（130 T>C位点）和T等位基因（500 C>T位点）的个体背腰最长肌中具有较高含量的α亚麻酸、花生酸、二十碳一烯酸和花生四烯酸含量，具有较高的肌间和肌内不饱和脂肪酸合成和沉积能力。不饱和脂肪酸可以保持动物细胞膜的相对流动性、维持细胞的正常生理功能，酯化胆固醇、降低血液中胆固醇和甘油三酯含量、调节血脂、改善内分泌，降低血液黏稠度、防止血栓的形成、改善血液微循环，可以增强机体免疫力、提高脑细胞的活性。因此，这些SNPs可以作为分子遗传标记应用于优质、高档牛肉生产和优良肉牛的选育。

表4. 中国西门塔尔牛FDFT1基因2个SNPs基因型与西门塔尔牛背最长肌肌间脂肪酸含量的关联分析

注：表中数值以Mean±Std.Error表示，同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，同列不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。

<110> 吉林大学

<120> 影响中国西门塔尔牛脂肪沉积的FDFT1基因关键SNP位点及应用

<160> 6

 

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1上游引物

<400> 1

cctggaggacttcccaacggtag                                                                         23

 

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1下游引物

<400> 2

cctggagaatgctatggacagaggg                                                                              25

 

<210> 3

<211> 174

<212> DNA

<213> 中国西门塔尔牛（Bos Taurus，bovine，Chinese simmental）

<220>

<223>牛FDFT1基因第4内含子P1引物扩增核苷酸序列

<400> 3

cctggaggacttcccaacggtagtaggactagtggggtgcagtcgcgtgcatgattggtg  60

gggtggctgtcagccagcttgtgtgcctggttgtcattgtttagttcctaagttgctttt   120

gcgactctgtggactgtagccccccaggttcctctgtccatagcattctccagg         174                                       

 

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2上游引物

<400> 4

ctactcgcccatctacctgtcg                                                                   22

 

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2下游引物

<400> 5

tcacacctgctacattcaagtcc                                                                    23

 

<210> 6

<211> 571

<212> DNA

<213> 中国西门塔尔牛（Bos Taurus，bovine，Chinese simmental）

<220>

<223> 牛FDFT1基因第8外显子P2引物扩增核苷酸序列

<400>  6

ctactcgcccatctacctgtcgttcgtcatgctcctggcggccctgagctggcagtacct     60

gagcaccctgtcccaggtcacagaggactatgttcagaccggggagcactgactggctcg     120

gtctggagactgaacgcccctcctcccaagcccctatctgggaaacagactgaccttctc     180

ttcagggatggatgtgggctccttctcttttttcccctactgttttaatccctcaaagag     240

tactgtgggcctggacctttagaaactgtgacctgtggtggagaaaaagataggattaaa     300

gggaaaggacagctcagccacctgtactcacctgtgcggggtgactgacgccgaacgttc     360

acggctgccatcagggaaggggctgcatcaggggctgcagaggagatcatagtgtgaata    420

caggctagagttacaattaaatgtatttaatgcaaaacaacttttgaatacctatcacag     480

tagaaagtgaagtgaattttctttccattcgcttcttgttttttttccatcattttgtct     540

cttccagtggacttgaatgtagcaggtgtga                                        571