一种产漆酶的鲍曼不动杆菌及产漆酶的方法和应用

摘要

本发明公开了一种产漆酶的鲍曼不动杆菌及产漆酶的方法和应用，其该鲍曼不动杆菌于2014年5月7日提交保藏，保藏号为：CCTCC NO：M201489。本发明的公开了利用鲍曼不动杆菌产漆酶的方法，以及漆酶在染料脱色中的应用。本发明所述的鲍曼不动杆菌具有较高的活性，生长速度快，稳定性好、不易变异，其发酵培养可以获得漆酶；本发明中利用鲍曼不动杆菌产漆酶的方法，操作简单，成本低；得到的漆酶活性高；本发明中通过当漆酶结合丁香醛连氮作为脱色液，不仅具有高活性，还具有较高的稳定性，进而能够有效提高漆酶的脱色效果。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种产漆酶的鲍曼不动杆菌及产漆酶的方法和应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。鲍曼不动杆菌有荚膜、菌毛，无芽孢和鞭毛；具有较强的粘附力，易于附着于物体表面。鲍曼不动杆菌具有复杂的抗原构造，包括菌体抗原以及荚膜抗原，根据不同的抗原可以将鲍曼不动杆菌分为34个血清型。

漆酶(1accase)是一种含铜的多酚氧化酶，含有19种氨基酸，漆酶有一定的含糖量，真菌漆酶是一种糖蛋白，由肽链、糖配基和Cu²⁺三个部分组成，分子量在60-390kDa，肽链一般由500-550个氨基酸组成，糖配基有氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，占整个分子重量的10％-80％糖配基组成及含量的不同是漆酶分子量存在较大差异的主要原因。漆酶能够催化酚类、芳胺类、羧酸类、甾体类激素、生物色素、金属有机化合物和非酚类物质生成醌类化合物、羰基化合物和水，属于铜蓝氧化酶(或称为铜蓝蛋白酶)中的一小族，广泛存在于真菌、植物和昆虫中，有报道细菌也能产生漆酶。目前还没有关于鲍曼不动杆菌也能产漆酶的报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产漆酶的鲍曼不动杆菌，鲍曼不动杆菌能够产生漆酶。

本发明的另一目的在于提供一种利用鲍曼不动杆菌产漆酶的方法，通过该方法获得漆酶，用于染料脱色。

本发明还提供了漆酶在染料脱色中的应用。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种产漆酶的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)，其该鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)于2014年5月7日提交保藏，保藏号为：CCTCC NO：M2014189；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072。

所述鲍曼不动杆菌分离方法步骤如下：

1)取食品厂排污口土样，添加到含有CuSO₄质量浓度为0.05％的LB液体培养基中，在37℃培养箱进行富集培养40-50小时；

2)利用无菌水进行梯度稀释，然后用固体LB液体培养基进行稀释平板法分离单个菌落；

3)利用含有1％质量愈创木酚的乙醇溶液和1％质量的α-萘酚的乙醇溶液进行显色反应，挑选呈现粉红色或灰黑色菌落进行反复划线筛选获取纯菌落，接种于斜面培养基并进行摇瓶发酵复筛，对筛选出的菌株进行形态、生理生化特征采用Vitek 2系统方法、16sRNA基因分析等进行鉴定，鉴定出鲍曼不动杆菌。

本发明所述的鲍曼不动杆菌应用于生产漆酶。

利用本发明所述的鲍曼不动杆菌生产漆酶的方法，包括如下步骤：

1)培养基处理：在三角瓶中和试管中分别装入培养基，调节培养基的pH值为6-8，灭菌后备用；

2)配置硫酸铜溶液：配制4％的硫酸铜溶液，灭菌后备用；

3)接种：将鲍曼不动杆菌接种步骤1)的试管中，在32-45℃的培养箱中培养，然后按照5％的接种量将试管中的菌体接种到步骤1)的三角瓶中；三角瓶放置在摇床培养箱中培养；

4)发酵培养：然后在三角烧瓶中加入步骤2)配制的硫酸铜溶液，使培养基中的铜离子的浓度为0.02-0.08％，继续发酵培养5-8h；

5)收集4)发酵培养液，在5000-8000r/min离心5-15分钟，得到的沉淀物用蒸馏水溶解，在冰浴条件下，利用超声细胞破碎仪破碎20-40分钟后，再用10000-15000r/min高速离心10-30分钟，丢沉淀取上清液，即为漆酶液。

具体地，上述方案中，步骤1)和步骤2)中，灭菌温度为120-125℃，灭菌时间为15-25min。

具体地，上述方案中，步骤3)中培养箱中培养时间为20-25小时。

具体地，上述方案中，步骤3)中，培养条件为温度37-47℃，摇床转速为150-250r/min，培养20-25小时。

一种漆酶，其是利用本发明所述的鲍曼不动杆菌通过上述方法获得。

一种生物脱色液，包含本发明所获得的漆酶液，还包含丁香醛连氮和硫酸铜；该生物脱色液中，所述丁香醛连氮浓度为0.2-0.8mol/L；铜离子浓度≤0.04％(wt/v)，漆酶浓度为45000-46000U/L。

漆酶具有脱色的效果，但是其稳定性容易受温度和pH值的影响，在本发明的研究中发现，在其脱色过程中添加丁香醛连氮不仅能提高其活性还能提高其稳定性；因此，当漆酶结合丁香醛连氮使用时，能够有效提高其脱色效果。

在本发明的研究过程中，发明人发现：铜离子的存在对细菌漆酶产漆酶活性具有明显的影响，当铜离子的浓度在0.02-0.08％这个范围时，能够明显提高漆酶酶活。并且，进一步发现，铜离子的浓度在0.04％以下，漆酶活性随着铜离子的浓度增加而逐步增加，但是当铜离子浓度大于0.04％以后，漆酶活性却随着铜离子的浓度增加而逐步降低，可能原因是铜离子抑制菌体生长而是菌体浓度偏低而导致的漆酶活性降级。因此，为了提高漆酶活性，作为优选的方案，在生物脱色液中铜离子的浓度≤0.04％

利用本发明所述的生物脱色液对结晶紫脱色的方法，其步骤为：将需要脱色的结晶紫染料用蒸馏水溶解后加入到上述生物脱色液中，于40-50℃的恒温水浴锅中反应。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明所述的鲍曼不动杆菌具有较高的活性，生长速度快，稳定性好、不易变异，其发酵培养后可以获得漆酶；

2.本发明中利用鲍曼不动杆菌产漆酶的方法，操作简单，成本低；得到的漆酶活性高；

3.本发明中通过当漆酶结合丁香醛连氮作为脱色液，不仅具有高活性，还具有较高的稳定性，进而能够有效提高漆酶的脱色效果。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为铜离子浓度对漆酶活性影响结果，其中横坐标为铜离子浓度(wt/v％),纵坐标为酶活性(IU)；

图2为pH值对漆酶活性影响结果，其中横坐标为pH值，纵坐标为酶活性(IU)；

图3为摇床培养温度对漆酶活性影结果，其中横坐标为摇床培养温度(℃)，纵坐标为酶活性(IU)；

图4为添加硫酸铜与不添加硫酸铜对漆酶活性对照图，其中横坐标为培养时间(min)，纵坐标为酶活性(IU)。

具体实施方式

实施例1

产漆酶的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)，其该鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii LMUDac)于2014年5月7日提交保藏，保藏号为：CCTCC NO：M2014189；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072。

所述鲍曼不动杆菌分离方法如下：从广州益海嘉里有限公司的排污口取土样1g，添加到含有CuSO₄质量浓度为0.05％的LB液体培养基100ml中，在37℃培养箱进行富集培养48小时，利用无菌水进行梯度稀释，然后用固体LB液体培养基进行稀释平板法分离单个菌落，利用含有1％质量愈创木酚的乙醇溶液和1％质量的α-萘酚的乙醇溶液进行显色反应，挑选呈现粉红色或灰黑色菌落进行反复划线筛选获取纯菌落，接种于斜面培养基并进行摇瓶发酵复筛，鉴定其是否产漆酶；对筛选出的菌株进行形态、生理生化特征采用Vitek 2系统方法、16sRNA基因分析等进行鉴定，鉴定为出鲍曼不动杆菌。

实施例2

一种漆酶，通过以下方法获得：

1)培养基处理：在三角瓶中和试管中分别装入培养基，调节培养基的pH值为6，于120℃灭菌25min，灭菌后备用；

2)配置硫酸铜溶液：配制4％的硫酸铜溶液，于125℃灭菌15min，灭菌后备用；

3)接种：将鲍曼不动杆菌接种步骤1)的试管中，在32℃的培养箱中培养25小时，然后按照5％的接种量将试管中的菌体接种到步骤1)的三角瓶中；三角瓶放置在摇床培养箱中培养，培养条件为温度37℃，摇床转速为150r/min，培养25小时；

4)发酵培养：然后在三角烧瓶中加入步骤2)配制的硫酸铜溶液，使培养基中的铜离子的浓度为0.02％(wt/v)，继续发酵培养5h；

5)收集4)发酵培养液，在5000-8000r/min离心5分钟，得到的沉淀物用蒸馏水溶解，在冰浴条件下，利用超声细胞破碎仪破碎40分钟后，再用10000r/min高速离心30分钟，弃沉淀取上清液，即为漆酶液。

实施例2

一种漆酶，通过以下方法获得：

1)培养基处理：在三角瓶中和试管中分别装入培养基，调节培养基的pH值为7，于121℃灭菌20min，灭菌后备用；

2)配置硫酸铜溶液：配制4％的硫酸铜溶液，于121℃灭菌20min，灭菌后备用；

3)接种：将鲍曼不动杆菌接种步骤1)的试管中，在37℃的培养箱中培养24小时，然后按照5％的接种量将试管中的菌体接种到步骤1)的三角瓶中；三角瓶放置在摇床培养箱中培养，培养条件为温度42℃，摇床转速为200r/min， 培养24小时；

4)发酵培养：然后在三角烧瓶中加入步骤2)配制的硫酸铜溶液，使培养基中铜离子的浓度为0.04％(wt/v)，继续发酵培养，得到漆酶液，漆酶液干燥后得到漆酶。

实施例3

一种漆酶，通过以下方法获得：

1)培养基处理：在三角瓶中和试管中分别装入培养基，调节培养基的pH值为8，于125℃灭菌15min，灭菌后备用；

2)配置硫酸铜溶液：配制4％的硫酸铜溶液，于120℃灭菌5min，灭菌后备用；

3)接种：将鲍曼不动杆菌接种步骤1)的试管中，在45℃的培养箱中培养20小时，然后按照5％的接种量将试管中的菌体接种到步骤1)的三角瓶中；三角瓶放置在摇床培养箱中培养，培养条件为温度47℃，摇床转速为250r/min，培养20小时；

4)发酵培养：然后在三角烧瓶中加入步骤2)配制的硫酸铜溶液，使培养基中铜离子的浓度为0.08％(wt/v)，继续发酵培养6h；

5)收集4)发酵培养液，在5000-8000r/min离心10分钟，得到的沉淀物用蒸馏水溶解，在冰浴条件下，利用超声细胞破碎仪破碎30分钟后，再用12000高速离心20分钟，弃沉淀取上清液，即为漆酶液。

实施例5

一种生物脱色液，包含本发明所获得的漆酶和作为溶剂的蒸馏水，还包含丁香醛连氮和硫酸铜；该生物脱色液中，所述丁香醛连氮浓度为0.2mol/L；铜 离子浓度为0.04％，漆酶浓度为45823U/L。

实施例6

一种生物脱色液，包含本发明所获得的漆酶和作为溶剂的蒸馏水，还包含丁香醛连氮和硫酸铜；该生物脱色液中，所述丁香醛连氮浓度为0.6mol/L；铜离子浓度0.04％，漆酶浓度为45000U/L？。

对比例1

考察铜离子浓度对漆酶活性影响，分别按照本发明生产漆酶的方法，考察培养基中铜离子浓度为0、0.02％、0.04％、0.08％、0.12％时漆酶的活性。结果参见图1。

图1的结果表明：铜离子的存在对细菌漆酶产漆酶活性具有明显的影响，铜离子的浓度在0.04％以下，漆酶酶活随着铜离子的浓度增加而逐步增加，但是当铜离子浓度大于0.04％以后，，漆酶酶活随着铜离子的浓度增加而逐步降低，可能原因是铜离子抑制菌体生长而是菌体浓度偏低而导致的漆酶活性降级。

对比例2

考察pH值对漆酶活性影响，分别按照本发明生产漆酶的方法，考察培养基pH值为4、5、6、7、8、9漆酶的活性。结果参见图2。

图2的结果表明：当pH值为6-8时，漆酶酶活高。

对比例3

考察摇床培养温度对漆酶活性影，分别按照本发明生产漆酶的方法，考察摇床培养温度为32℃、37℃、42℃、47℃、52℃漆酶的活性。结果参见图3。

图3结果表明：漆酶摇床培养最适温度范围为37-47℃之间。

对比例4

考察铜离子对漆酶活性的影响，分别按照本发明生产漆酶的方法，考察在 生产方法中加入硫酸铜、不加硫酸铜、以及在培养24小时之后再加入硫酸铜对漆酶活性的影响。结果参见图4。

图4结果表明：在无铜离子情况的培养基培养菌体，产酶活力较弱，而24小时在添加铜离子其漆酶活性在添加铜离子后，酶活会有一个飞跃，大约过了六个小时酶的活性达到最大，接近于一开始就添加铜离子培养菌体产生的酶活，且达到最高值的时间缩短了24h小时。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。