梭曼抗原、梭曼疫苗及其用途

摘要

本发明涉及梭曼抗原及梭曼疫苗，具体涉及由梭曼半抗原和载体蛋白偶联得到的免疫抗原，以及利用该免疫抗原制备的梭曼疫苗组合物。本发明还涉及所述免疫抗原和疫苗组合物用于制备预防或治疗梭曼中毒的药物和/或疫苗中的用途，以及乙肝表面抗原作为载体蛋白的用途。本发明的疫苗组合物能显著提高免疫动物的特异性体液免疫和细胞免疫，有效预防梭曼中毒。

说明书

技术领域

本发明涉及梭曼抗原及梭曼疫苗，具体涉及由梭曼半抗原和载体 蛋白偶联得到的免疫抗原，以及利用该免疫抗原制备的梭曼疫苗组合 物。本发明还涉及所述免疫抗原和疫苗组合物的用途，以及乙肝表面 抗原作为载体蛋白的用途。

背景技术

梭曼(甲氟磷酸频哪基醇酯，式Ⅲ所示)为一种剧毒的、难防难治的 神经性毒剂。其毒理学特点复杂：（1）梭曼在体内外形成的膦酰化乙 酰胆碱酯酶老化极快；（2）梭曼抑制的乙酰胆碱酯酶难以重活化；（3） 梭曼的中枢作用强；（4）梭曼有AChE-Ach系统外的直接生化毒性作 用。

目前研究用于梭曼中毒预防和治疗的药物主要以下几类药物：（1） N样和M样胆碱能受体拮抗剂：如美加明（mecxmylamine）和阿托品； （2）胆碱酯酶重活化剂：如双吡啶单肟HI-6、对称双吡啶季铵盐和氟 化钠；（3）抗氧化剂：如葡萄糖酸锌[Zn(C₆H₁₁O₇)₂]、维生素A和E； （4）有机磷水解酶：如中华大蟾蜍血清；（5）触酶：如过氧化氢酶等； （6）抗惊厥药：如安定（叶和钰，中国药学杂志，1990,25（8）：451-453）。

从20世纪90年代，我国率先开始采用化学免疫的方法研究梭曼中 毒的预防和治疗。设计和合成梭曼类似物（四配位的α-羟基膦酸频哪酯， P4），并与牛血清白蛋白和血蓝蛋白偶联，制备人工抗原（徐勤惠，等. 细胞与分子免疫学杂志，2003,19（2）：172-174）。这种抗原免疫小鼠， 能产生显著地抗体活性，且半抗原、梭曼和对氧磷能竞争性地抑制血清 抗体（赵毅民，等.军事医学科学院院刊，1995,19（3）：203）。Pei J 等以膦酸梭曼水解过渡态类似物（五配位-羟基膦酸酯,3-羟基-1-对硝基 苯基甲膦酸单频哪基醇酯，P6）为半抗原，与血蓝蛋白偶联后免疫小鼠， 能较好地对抗1.5倍梭曼中毒（Pei J,et al.Toxicol Lett. 2009,187(1):45-51）。Li B等将梭曼分子与人血清白蛋白477或转铁蛋 白257-293的酪氨酸偶联，免疫兔获得血清抗体，能识别梭曼分子（Li B, Chem Res Toxicol.2013Mar21.Epub ahead of print）。

由于半抗原P6为小分子物质，需要与大分子载体蛋白共价偶联形 成“半抗原-载体蛋白”偶联物（也称完全抗原）才具有一定免疫原性。

匙孔型血蓝蛋白(KLH)是一种含铜蛋白,属于非亚铁血红素蛋白,称 为血蓝蛋白。由于这种蛋白具有很强的免疫原性，但同时也具有较强的 毒性，因此常常只作为载体蛋白用于动物实验研究所用。因此本领域亟 需找到适合人用梭曼疫苗的载体蛋白。

发明内容

本发明的目的是选择合适的载体蛋白，再将免疫原性弱的半抗原 P6与选择的载体蛋白偶联，制备梭曼疫苗的新抗原，然后再与佐剂合 用，用于梭曼中毒的预防和治疗。

本发明的发明人经过不懈地努力和大量实验，发现以O¹-甲基 -O²-(1,2,2-三甲基丙基)-(5-氨基-2-羟基苯基)甲基膦酸(P6)为梭曼半抗原， 与载体蛋白偶联制备免疫抗原，能显著提高免疫动物的特异性体液免疫 和细胞免疫，有效预防梭曼中毒，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及一种偶联物，其由式Ⅰ所示的化合物与载体 蛋白偶联形成，

其中所述载体蛋白选自乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、破伤风毒 素、白喉类毒素、霍乱毒素。

在本发明的实施方案中，所述载体蛋白为乙肝表面抗原。

根据本发明第一方面任一项的偶联物，其中式Ⅰ所示的P6化合 物与载体蛋白通过重氮键偶联形成。

在本发明的实施方案中，其中式Ⅰ所示化合物与载体蛋白形成如 式Ⅱ所示的偶联物。

其中：Pin代表嚬哪基团；Prot代表载体蛋白。

本发明第二方面涉及药物组合物，其含有本发明第一方面任一项 的偶联物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明第三方面涉及疫苗组合物，其含有本发明第一方面任一项 的偶联物。

根据本发明第三方面的疫苗组合物，其还含有免疫佐剂。

在本发明的实施方案中，其中所述免疫佐剂为多糖佐剂、铝佐剂 或多糖佐剂与铝佐剂的混合物。

在本发明的实施方案中，其中所述多糖为从板蓝根提取的多糖成 分。

在本发明的具体实施方案中，所述从板蓝根提取的多糖成分选自 以下多糖成分中的一种或两种：

（1）多糖成分S1，其分子量范围为2000～5000Da，其由α构型 的吡喃型葡萄糖组成，主要糖苷键构型为1→4连接，即→1) α-D-Glcp(4→；

（2）多糖成分S3，其分子量范围为4.0×10⁴～10.0×10⁴Da，由阿拉 伯糖、半乳糖及糖醛酸组成，其中阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶ Gal=1.0:(1.0～3.0)，糖醛酸含量为10%～20%，主要连接片段为 →1)Galp(3,6→，还包括其它连接片段→1)Galp(6→，→1)Araf， →1)Araf(5→，→1)Araf(2,3→和→1)Galp；优选地，其中阿拉伯糖和半 乳糖的摩尔比为Ara∶Gal=1.0:(1.5～2.0)。

根据本发明第三方面的疫苗组合物，其中所述的铝佐剂为氢氧化 铝佐剂、磷酸铝佐剂或硫酸铝佐剂。

在本发明的实施方案中，所述免疫佐剂为氢氧化铝佐剂。

在本发明的另一个实施方案中，所述免疫佐剂为多糖成分S1或S3。

在本发明的另一个实施方案中，所述免疫佐剂为多糖成分S1与氢 氧化铝联用，或者多糖成分S3与氢氧化铝联用。

本发明第四方面涉及本发明第一方面任一项的偶联物或第三方面 任一项的疫苗组合物在制备用于预防或治疗梭曼中毒的药物和/或疫 苗中的用途。

本发明还涉及本发明第一方面任一项的偶联物或第三方面任一项 的疫苗组合物在制备抗梭曼抗体中的用途；优选地，所述抗体为单克 隆抗体或多克隆抗体。

本发明还涉及一种制备抗梭曼抗体的方法，所述方法包括使用本 发明第一方面任一项的偶联物或第三方面任一项的疫苗组合物免疫动 物的步骤；优选地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明中，所述动物为哺乳动物，例如为小鼠、大鼠或人。

在本发明中，利用抗原或半抗原制备抗体的技术是公知的。

本发明还涉及乙肝表面抗原作为载体蛋白与半抗原偶联用于制备 疫苗的用途。

在本发明的实施方案中，所述半抗原为P6化合物。

在本发明的实施方案中，所述乙肝表面抗原与P6偶联用来制备梭 曼疫苗。

本发明还涉及本发明第三方面任一项的疫苗组合物的制备方法， 其包括将本发明第一方面任一项的偶联物与免疫佐剂混合的步骤。

在本发明中，所述半抗原是指能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、 又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免 疫原性，又称不完全抗原。

在本发明中，所述免疫佐剂又称非特异性免疫增强剂，其本身不具 有抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性或改变免 疫反应类型。

在本发明中，所述乙肝表面抗原（HBsAg）是指乙肝病毒的外壳蛋 白。在本发明的实施方案中，所述乙肝表面抗原为重组乙肝表面抗原。

在本发明中，所述重组乙肝表面抗原的制备方法为本领域公知，是 指通过重组表达的方式将乙肝表面抗原基因克隆入重组载体、并转入细 胞中进行表达而得到的乙肝表面抗原。所述细胞例如为原核细胞或真核 细胞，所述原核细胞例如为大肠杆菌，所述真核细胞例如为酵母（例如 酿酒酵母、汉逊酵母）或哺乳动物细胞（例如CHO细胞）。

在本发明中，所述多糖成分S1和S3是通过以下方法制备的：

1）取板蓝根，加入水浸泡，得到水提液；

2）将步骤1）得到的水提液进行乙醇沉淀，取沉淀部分加入水中 溶解，取上清液进行透析；

3）取透析液浓缩后得到板蓝根总多糖；任选地，浓缩后还包括冷 冻干燥的步骤。

以上步骤1）－3），还具有以下特征中的一项或多项：

（1）步骤1）中所述的板蓝根，为未经提取的板蓝根，或者为经 过有机溶剂例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、环己烷、正 丁醇、乙醇或甲醇萃取后得到的板蓝根残渣；

（2）步骤1）中所用水为蒸馏水或去离子水；

（3）步骤1）中，加入水浸提的温度为4～100℃，优选为20～ 60℃；

（4）步骤1）中，将水提后得到的板蓝根残渣按照相同条件进行 一次或多次水提，合并水提液；

（5）步骤1）中水的用量为板蓝根残渣的5－20倍量（L/Kg）；

（6）步骤1）中，水提期间进行搅拌；

（7）步骤1）中，将得到的水提液在50℃－55℃下进行减压浓缩， 得到浓缩的水提液；

（8）步骤2）中，乙醇沉淀的条件是：醇沉后乙醇的终浓度为60 －80％，例如70-75%；优选地，醇沉的时间大于12小时，例如为48-72 小时；

（9）步骤2）中，将乙醇沉淀后离心得到的沉淀再进行一次或多 次乙醇沉淀，合并上清液；

（10）步骤2）中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000；

（11）步骤2）中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；

（12）步骤2）中，透析进行一次或多次；

（13）步骤3）中所述浓缩为在50℃－55℃下进行减压浓缩。

取上述制备得到的板蓝根总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层 析，依次用H₂O、0.25mol/L NaHCO₃和0.5mol/L NaHCO₃洗脱，硫 酸-苯酚法检测糖，分别得到多糖组分BLGP-A、BLGP-B、BLGP-C；

多糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，纯化获得多糖成分 S1；和/或

多糖组分BLGP-B经Sephadex G-100柱层析，获得多糖成分S3。

在本发明的具体实施方案中，首先涉及到半抗原P6的制备：即以 2-溴甲基-4-硝基苯酚为原料，与亚磷酸三甲酯反应得膦酸二甲酯，再 与频哪醇酯交换得到硝基半抗原P6’，然后催化氢化还原得氨基半抗原 P6；其次涉及到免疫抗原和检测抗原的制备：即通过将P6重氮化得重 氮盐P6L，再分别与相应的载体蛋白—牛血清白蛋白（BSA）或人乙 肝表面抗原（HBsAg）交联,即得所需的相应检测抗原或免疫抗原。具 体合成路线如下式所示：

同时，采用铝盐佐剂，或多糖佐剂，或铝盐佐剂与多糖佐剂混合为 疫苗佐剂。采用肌肉注射或皮下注射途径进行免疫，能显著提高免疫动 物的特异性体液免疫和细胞免疫，有效预防梭曼中毒。

发明的有益效果

本发明将P6化合物与可用于人疫苗的载体蛋白偶联，得到完全抗 原，该完全抗原具有较好的免疫原性。该完全抗原与多糖佐剂和/或铝佐 剂联用，能够诱发较强的体液免疫和细胞免疫反应，可以用于梭曼中毒 的预防和治疗。

在本发明的实施方案中，首次选用乙肝表面抗原作为半抗原的载体 蛋白，在与佐剂联用后，获得了较好的免疫效果。且重组乙肝抗原具有 良好的安全性，而且该疫苗免疫后对乙型肝炎病毒预防也可能有作用。

附图说明

以下各图中，^*-代表与生理盐水组比较，^*p<0.05,^**p<0.01, ^***p<0.001;^#-代表与单独抗原组比较，^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001。

图1总多糖经DEAE-纤维素柱层析的洗脱曲线图

图2.BLGP-A经Sephadex G-75柱层析分离图（λ=490nm处检测）

图3.BLGP-B经Sephadex G-100柱层析的分离图（λ=490nm处 检测）

图4.多糖S1分子量测定图谱

图5.多糖S3分子量测定图谱

图6多糖S1和S3与梭曼抗原联用初次免疫的抗体滴度（肌注）， 其中Saline为生理盐水

图7多糖S1和S3与梭曼抗原联用二次免疫的抗体滴度（肌注）， 其中Saline为生理盐水

图8多糖S1和S3与梭曼抗原联用三次免疫的抗体滴度（肌注）， 其中Saline为生理盐水

图9多糖S1和S3与梭曼抗原联用三次免疫抗体亚类的滴度（肌 注）其中control为生理盐水

图10多糖S1和S3与梭曼抗原联用三次免疫的抗毒效果（肌注免 疫），其中Saline为生理盐水

图11多糖S1和S3与梭曼抗原联用初次免疫的抗体滴度（皮下）， 其中control为生理盐水

图12多糖S1和S3与梭曼抗原联用三次免疫的抗体滴度（皮下）， 其中control为生理盐水

图13多糖S1和S3与梭曼抗原联用三次免疫的抗毒效果（皮下免 疫），其中Saline为生理盐水

图14S3与氢氧化铝混合与梭曼抗原联用初次免疫的抗体滴度（肌 注免疫）其中control为生理盐水

图15S3与氢氧化铝混合与梭曼抗原联用三次免疫的抗体滴度（肌 注免疫）其中control为生理盐水

图16梭曼疫苗免疫小鼠肌肉注射部位图（未见不良反应）

图17P6与载体蛋白偶联后的SDS-PAGE图

其中图6-9、11、12、14、15中的纵坐标为A450值。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。

实施例1抗原合成

（1）2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸二甲酯的合成：

以等摩尔的α-溴代-5-硝基-2-甲基苯酚与亚磷酸三甲酯在丙酮中回 流至无气体放出为止，冷却，过滤、收集所生成的固体，干燥即得目标 产物，产率95%，mp162-164℃。

（2）O¹-甲基-O²-(1,2,2-三甲基丙基)2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸 (P6’)的合成：

称取3.8g(0.0145mol)2-羟基-5-硝基苯基甲基膦酸二甲酯，置入反应 瓶中，加入催化量的4-二甲胺基吡啶及35ml干燥的乙二醇二甲醚，装 上短分馏装置，在搅拌下加热，缓缓蒸出溶剂，使蒸出物沸点低于80℃， 反应20h，蒸去大部分溶剂，加入5ml2mol.L^-1HCl和一些水，以 CH₂Cl₂(35ml×4)提取，合并有机层，水洗一次；以20%K₂CO₃(25ml×4) 反提，少量水洗二次，合并水溶液，再以浓盐酸酸化至pH1-2，然后以 CH₂Cl₂(40ml×4次)提取，合并有机层，水洗一次，然后用无水硫酸钠干 燥，回收溶剂，硅胶柱层析，CHCl₃-AcOEt-AcOH(40:2:1)洗脱，第二 组分即产物，得4.2g，产率87.5%，mp108～110℃。元素分析(C₁₄H₂₂NO₆P): 计算值(%)C50.76,H6.69,N4.23;实测值(%)C50.67,H6.61,N4.31。 NMR(ppm,CDCl₃)δ_H:0.86310.9455(2×s,9H,t-Bu),1.1531.326(dd,3H, J³=6.11Hz,J_H-P=18.97Hz,CH₃-C),3.20-3.30(m,2H,J_H-P=21.36Hz), 3.74-3.79(m,3H,CH₃-O),4.20-4.32(m,1H,CH-O),6.90-6.94(dd,1H, J³=9.16Hz,J⁴=3.67Hz,Ar-H),7.97-8.05(m,2H,Ar-H₂);MS(m/z，FAB⁺): 663.1(2M+H)⁺,332.1(M+H)⁺,316.1(M+H-O)⁺,302.1(M+H-OCH3)⁺， 248.0(100%,(M+2H-Pin)⁺),231.0(M+H-OPin)⁺。

（3）O¹-甲基-O²-(1,2,2-三甲基丙基)-(5-氨基-2-羟基苯基)甲基膦酸 (P6)

称取P6’0.50g，溶于10ml甲醇，加入60mg10%Pd-C，于常温常 压及搅拌下氢化12h，滤去催化剂，少量醇洗涤，旋转蒸发溶剂得浅棕 色固体即为目标化合物P6，由于P6易氧化变色，产物的纯度又足够作 下一步用途，密封备用。

(4)检测抗原的合成：

取23mg P6，溶于5ml0.5mol.L^-1HCl,在搅拌及冰浴冷却下，滴 入溶有16mg亚硝酸钠的1ml水液，滴毕，再反应1h，即得重氮盐溶液； 继而在搅拌下将上述溶液滴到溶有120mg牛血清白蛋白(BSA)和400mg 碳酸钠的5ml水液，再次反应1h，然后以稀盐酸中和至pH7，透析一 天以上，冷冻干燥，即得检测抗原。采用SDS-PAGE电泳法检测偶联 后的抗原（见图17）。

（5）免疫抗原的合成：

称取21mg P6溶于4.5ml0.5mol.L^-1HCl,在搅拌及冰冷下，滴入 溶有14mg亚硝酸钠的1ml水液，滴毕，再反应1h，即得重氮盐溶液； 继而在搅拌下将上述溶液滴到溶有100mg重组乙肝表面抗原(购于大连 汉信生物制药有限公司)和350mg碳酸钠的4.5ml水液，再次反应1h， 然后以稀盐酸中和至pH7，透析一天以上，冷冻干燥，即得免疫抗原。 采用SDS-PAGE电泳法检测偶联后的抗原（见图17）。以下实施例中， 如未特别注明，即是指免疫抗原。

实施例2：多糖S1、S3的制备

中药材板蓝根1kg，粉碎，室温下加入10L75％乙醇浸泡24小时， 过滤，离心（3000r/min×10min），残渣同样条件再浸提一次，合并 滤液，40℃－45℃减压回收浸膏。经过75％乙醇浸提后的板蓝根残渣 50℃烘干后，加入15L蒸馏水，在50℃下浸提5小时，期间不时搅拌； 然后过滤，滤液离心10min（转速3000r/min），浸提后的板蓝根残渣 在同样条件下进行第二次提取。合并两次提取的水提液，50℃－55℃ 减压浓缩至1000ml，然后加入3倍体积（3000ml）95％的乙醇进行 72小时的醇沉。醇沉溶液离心（3000r/min×10min），沉淀部分加入 1000ml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作两次。合并溶解的上清液， 装入透析袋（截留分子量>1000），自来水透析48小时后换蒸馏水再 透析24小时。该透析液50℃－55℃减压浓缩至200ml左右，装入小 瓶进行冷冻干燥，获得淡黄色粉末，即板蓝根总多糖（BLGP）。

称取1g板蓝根总多糖，溶于蒸馏水进行DEAE-纤维素（HCO₃-） （购自上海试剂二厂）柱层析，依次用H2O、0.25mol/L NaHCO₃和 0.5mol/L NaHCO₃洗脱，流速1ml/min，洗脱液隔管检测A490（苯酚 硫酸法，参考文献：Dubois M.,et al.Colorimetric method for  detemination of sugars and related substances.Anal.Chem.1956;28: 350-56），收集吸收峰，蒸馏水透析48h，然后冷冻干燥。分别得到 多糖组分BLGP-A、BLGP-B、BLGP-C三个含糖组分（见图1）。多 糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，用水洗脱，流速0.3ml/min， 纯化获得分子量均一多糖S1；多糖组分BLGP-B经Sephadex G-100 柱层析，流速0.3ml/min，得到0.1mol/L NaCl洗脱部分，该部分再 次用Sephadex G-100柱层析，用水洗脱，流速0.3ml/min，即得到多 糖S3（见图2和3）。

实施例3：多糖S1和S3的理化性质

1、多糖S1和S3分子量测定（HPLC方法）：

凝胶色谱柱：TSK-4000

流动相：0.1M Na₂SO₄

流速：0.6ml/min

检测器：示差

S1和S3分子量测定结果见图4和图5。

分子量测定结果表明多糖S1峰高分子量为3600Da，S3峰高分子 量为66400Da。

2、多糖S1和S3的单糖组成测定（气相色谱法）

S1和S3经过完全酸水解，还原、乙酰化后制成糖醇乙酸酯衍生物， 进行气相色谱分析。气相色谱分析表明多糖S1由葡萄糖组成，为葡聚 糖。S3由阿拉伯糖和半乳糖组成，摩尔比为1：1.5。

3、多糖S1的结构确定

S1甲基化产物的气相色谱质谱联用（GC-MS）结果见表1。

表1多糖S1甲基化产物的GC-MS结果分析

以上研究结果表明S1由α构型的吡喃型葡萄糖组成，主要糖苷键 构型为1→4连接，即→1)α-D-Glcp(4→。

4、多糖S3的结构确定

S3甲基化产物的气相色谱质谱联用（GC-MS）结果见表2。

表2多糖S3甲基化产物的GC-MS结果分析

以上研究结果表明多糖S3主要由吡喃型半乳糖和呋喃型阿拉伯糖 组成，主要含有以下连接片段：

主要骨架片段为→1)Galp(3,6→，以及其它片段→1)Galp(6→， →1)Araf，→1)Araf(5→，→1)Araf(2,3→和→1)Galp。

实施例4：多糖S1、S3或铝盐对梭曼抗原的佐剂活性（肌肉注射）

动物：雌性Balb/c小鼠,6-8W

实验分组：生理盐水组、单独抗原组（P6-HBsAg）、抗原+多糖 S1组、抗原+多糖S3组、抗原+氢氧化铝（氢氧化铝佐剂购于美国 Thermo公司）组，每组11只小鼠。

剂量：P6-乙肝表面抗原，10μg/鼠；S1或S3剂量：150μg/鼠；氢 氧化铝：200μg/鼠。

免疫途径：肌肉注射；

抗体检测：ELISA方法；

初次免疫2周后ELISA方法测定小鼠血清抗体滴度，然后进行第 二次免疫。第二次免疫2周后再次测定抗体滴度，进行第三次免疫。第 三次免疫后2周测定抗体滴度和抗体亚型，然后进行1倍致死量的梭曼 染毒，皮下注射梭曼（梭曼购自中国人民解放军防化学院），0.2mg/kg 体重。

结果：板蓝根多糖S1、S3和氢氧化铝分别与梭曼抗原联用，肌肉 注射免疫小鼠2次，对初次免疫、二次免疫和三次免疫小鼠的血清特异 性抗体滴度测定结果见图6-图8，抗体亚类滴度结果见图9。结果表明 多糖S1、S3和铝佐剂均能显著提高梭曼抗原免疫的特异性抗体滴度， 增强体液免疫能力，但铝佐剂起效慢，多糖S1和S3佐剂效应快。经过 三次免疫后所有联用佐剂组的小鼠能有效抵抗梭曼1倍中毒剂量，中毒 后2小时，仍有60%小鼠存活（见图10）。

实施例5：多糖S1、S3或铝盐对梭曼抗原的佐剂活性（皮下注射）

动物：雌性Balb/c小鼠,4-6W

实验分组：生理盐水组、单独抗原组（P6-HBsAg）、抗原+多糖 S1组、抗原+多糖S3组、抗原+氢氧化铝组，每组11只小鼠。

剂量：P6-乙肝蛋白表面抗原：10μg/鼠；S1或S3剂量：150μg/鼠； 氢氧化铝：200μg/鼠。

免疫途径：皮下注射；

抗体检测：ELISA方法；

初次免疫2周后ELISA方法测定小鼠血清抗体滴度，然后进行第 二次免疫。第二次免疫2周后再次测定抗体滴度，进行第三次免疫。第 三次免疫后2周测定小鼠血清抗体滴度。再进行1倍致死量的梭曼进行 染毒实验，皮下注射梭曼，0.2mg/kg体重。

实验结果：

板蓝根多糖S1、S3和氢氧化铝分别与梭曼抗原联用，皮下注射免 疫小鼠3次，对初次免疫和三次免疫小鼠血清特异性抗体滴度见图11 和图12。结果显示：多糖S1、S3和铝佐剂与梭曼抗原联用，采用皮下 注射途径进行免疫，也均能显著提高梭曼抗原免疫的特异性抗体滴度， 但抗毒效果不及肌肉注射方式（见图13）。

实施例6：多糖S3与铝盐作为混合佐剂对梭曼抗原的佐剂活性（肌肉注射）

动物：雌性Balb/c小鼠,4-6W

实验分组：生理盐水组、单独抗原组（P6-HsAg）、抗原+混合佐 剂组（S3+氢氧化铝）、抗原+氢氧化铝组，每组11只小鼠。

剂量：P6-乙肝表面抗原：10μg/鼠；S3剂量：150μg/鼠；氢氧化 铝：200μg/鼠。

免疫途径：肌肉注射；

抗体检测：ELISA方法；

初次免疫2周后ELISA方法测定小鼠血清抗体滴度，然后进行第 二次免疫。第二次免疫2周进行第三次免疫。第三次免疫后2周测定小 鼠血清抗体滴度。

实验结果：

S3和氢氧化铝分别与梭曼抗原联用，肌肉注射免疫小鼠三次，对初 次免疫和第三次免疫的小鼠血清特异性抗体滴度结果见图14和图15。 结果显示：S3和铝佐剂作为混合佐剂，与梭曼抗原合用，采用肌肉注射 途径进行免疫小鼠3次，均能显著提高梭曼抗原免疫的特异性抗体滴度， 其效果分别优于多糖S3和铝佐剂本身，具有明显的协同作用（见图14 和图15）。

实施例7梭曼疫苗的毒性实验

动物：雌性Balb/c小鼠,6-8W

实验分组：生理盐水组、单独抗原组（P6-HBsAg）、抗原+多糖 S1组、抗原+多糖S3组、抗原+氢氧化铝（氢氧化铝佐剂购于美国 Thermo公司）组，每组11只小鼠。

剂量：P6-乙肝表面抗原，10μg/鼠；S1或S3剂量：150μg/鼠；氢 氧化铝：200μg/鼠。

免疫途径：肌肉注射；

抗体检测：ELISA方法；

初次免疫2周后ELISA方法测定小鼠血清抗体滴度，然后进行第 二次免疫。第二次免疫2周后再次测定抗体滴度，进行第三次免疫。第 三次免疫后2周测定抗体滴度和抗体亚型。小鼠眼眶取血后，处死，对 疫苗注射部位进行解剖，观察注射部位肌肉组织的变化。实验结果见图 16。结果显示无任何异常现象，与盐水对照组无差别。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。