同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的方法

摘要

同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的方法，涉及茶多酚中儿茶素的分离纯化方法。将茶多酚溶液通过弱极性大孔吸附树脂，乙醇-水二元梯度洗脱，得到富含EGCG馏分、EGCG与ECG重叠馏分、富含ECG馏分；富含EGCG馏分通过AG-β-CD介质柱层析，纯度95％以上的EGCG时回收率高于85％；富含ECG馏分同样用AG-β-CD柱层析，ECG纯度达到90％以上时的回收率为高于80％；EGCG与ECG重叠馏分循环通过同型号的大孔吸附树脂处理，继续分离富含EGCG馏分和富含ECG馏分。回收率高、产率高、分离介质价格低、无有毒溶剂、工艺简单。

说明书

技术领域

本发明涉及茶多酚中儿茶素的分离纯化方法，尤其是涉及一种利用大孔吸附树脂结合琼 脂凝胶微球键合β-CD介质从茶多酚中同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶 素没食子酸酯的方法。

背景技术

茶多酚是茶叶中主要的活性之一，其成分主要是儿茶素类物质，约占60％～80％，而其中 EGCG含量最高，约占儿茶素的50％～60％，ECG其次，约占10％～20％。EGCG具备抗菌、 抗病毒、抗氧化、抗衰老、修复电离辐射造成的皮肤损伤、降血脂、降血糖、抗癌、抑制心 血管疾病等众多生活活性特征，引起国内外学者的广泛兴趣，而研究表明，ECG也具备众多 生物活性，如抗菌、抗癌、抑制动脉硬化、调节心律等。

目前制备EGCG和ECG方法有化学合成和天然产物提取，而化学合成的步骤繁琐，产 率低，不适合工业化生产；在天然产物提取方面，主要有沉淀法、溶剂萃取法以及柱色谱等 方法，沉淀法带来的金属离子残留和溶剂萃取法中的有机溶剂残留等问题，难以达到保健食 品和医药质量标准，因此柱色谱方法比较普遍，其报道的方法，如大孔吸附树脂、硅胶、聚 酰胺、C-18反相柱、Sephadex LH-20等柱层析方法，但目前存在的缺陷在于单凭某一种方法 难以制备较高纯度，或高纯度条件下产物回收率低。如中国专利CN102702163 B中得到茶多 酚精品后，通过离子络合沉淀，过滤，酸转溶，大孔树脂吸附得到儿茶素，然后儿茶素经过 两次大孔吸附树脂纯化，得到纯度98％以上的EGCG单步收率50％左右，工艺流程非常繁琐； 中国专利CN101643466 B中茶多酚经过乙酸乙酯萃取两次，合并有机相后浓缩得到浸膏，浸 膏水溶解液先后通过聚酰胺和大孔吸附树脂吸附解析，解析液在此浓缩得到浸膏，高浓度纯 水溶解后，加晶种结晶24h，其步骤繁琐，收率也仅约为30％。中国专利CN 1199965 C中 用Sephadex LH-20一步纯化，其整个过程柱色谱参数难以放大；专利CN1193994C中用丙酮、 氯仿等溶剂在氮气保护下反复结晶后通过Sephadex LH-20纯化，步骤繁琐，难以连贯进行放 大生产。专利CN101921253B中用膜技术得到高纯度的EGCG，但整个过程也需要借助萃取， 树脂层析，高浓度结晶。CN 102276570 B中C-18键合硅胶反相柱得到高纯度EGCG，但也需 要借助SMB色谱技术，其虽然能够工艺流程连贯，但成本高。CN102964329B中也是通过高聚 合物反相柱层析得到高纯度EGCG，但是反相填料较为昂贵，投入成本较高。徐军等利用寡聚 环糊精配基键合介质分离EGCG(利用寡聚环糊精配基键合介质分离表没食子儿茶素没食子 酸酯的新方法，化工进展，2005(24),1171-1175)，其介质用琼脂糖作为材料基质，成本较 高，而且负载量较小。

由于EGCG和ECG化学性质较为相似，茶多酚精制几乎都是以EGCG为目标产物，而 将ECG作为杂质予以去除，这样造成资源浪费。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种回收率高、整个工艺过程成本低、污染小的同时制备高纯度 表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的方法。

本发明包括以下步骤：

1)用水溶解茶多酚，过滤后，得到澄清的茶多酚水溶液；

2)利用弱极性大孔吸附树脂对步骤1)得到的茶多酚水溶液进行吸附，再通过梯度洗脱， 分别得到富含EGCG馏分、EGCG与ECG重叠馏分、富含ECG馏分；

3)将步骤2)得到的富含EGCG馏分通过琼脂凝胶微球键合β-CD(简称AG-β-CD)介质 进行柱层析，以80％乙醇为流动相进行洗脱，EGCG纯度高于95％时，收率高于85％；

4)将步骤2)得到的EGCG与ECG重叠馏分，通过纯化水稀释，然后进行酒精计检测， 将醇浓度控制在≤10％，重复步骤2)；

5)将步骤2)得到的富含ECG馏分通过琼脂凝胶微球键合β-CD(简称AG-β-CD)介质 进行柱层析，以80％乙醇为流动相进行洗脱，ECG纯度高于90％时，收率高于80％；

6)将步骤3)和5)所得产物分别减压浓缩除醇后，进行冷冻干燥，分别得到高纯度表没食 子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯。

在步骤1)中，所述水可采用纯化水；所述茶多酚水溶液中按质量百分比EGCG≥30％， ECG≥10％。

在步骤2)中，所述弱极性大孔吸附树脂可采用HPD450树脂、AB-8树脂、D180树脂等 中的一种，优选AB-8树脂；所述通过梯度洗脱可通过10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％ 乙醇和50％乙醇梯度洗脱，每个梯度流动相洗脱体积可控制在1～3BV，洗脱流速可为 0.8～2.0BV/h；优选每个梯度流动相洗脱体积为2BV，洗脱流速为1.5BV/h；流动相为乙醇- 水二元流动相。

在步骤3)中，所述柱层析的上柱原液与树脂之间的承载量可为30～40g/L，优选35g/L， 其中，上柱原液以茶多酚含量计算，树脂以柱体积计算；所述柱层析的上柱原液的相关物质 的色谱纯度要求为EGCG≥40％，ECG≤1％，纯化介质的承载量可为5～7g/L，优选6g/L，其 中EGCG含量以质量计算，柱体积以体积计算；所述洗脱的流速可为2～3BV/h，优选2.5BV/h； 动相为乙醇-水二元流动相；所述琼脂凝胶微球键合β-CD(AG-β-CD)介质的形状为圆球形， 颗粒直径为50～200μm，微球骨架为10％交联琼脂，功能基团为β-CD。

在步骤4)中，所述EGCG与ECG重叠馏分，可循环通过AB-8树脂分离。

在步骤5)中，所述柱层析的上柱原液的相关物质控制范围可为ECG≥40％，EGCG≤1％。 纯化介质的承载量可为3～5g/L，优选4g/L，其中，ECG含量以质量计算，柱体积以体积计算； 所述洗脱的流速可为2～3BV/h，优选2.5BV/h，流动相为乙醇-水二元流动相；所述琼脂凝胶 微球键合β-CD(AG-β-CD)介质的形状为圆球形，颗粒直径为50～200μm，微球骨架为10％ 交联琼脂，功能基团为β-CD。

所制备的高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯可采用以下方法进行 色谱检测：

采用沃特世e296高效液相色谱系统，2998PDA紫外检测器，沃特世色谱柱，250mm× 4.6mm，填料为RP-C18硅胶柱，色谱柱温度为35℃，检测波长280nm，标准品为含量98％ EGCG和98％ECG(sigma公司)，流动相A为甲醇，流动相B为0.075％冰醋酸水溶液， 洗脱方式为梯度洗脱，结果参见表1。

表1

时间(min) 流速(ml/min) 流动相A 流动相B 0 1.00 15％ 85％ 10 1.00 15％ 85％ 30 1.00 20％ 80％ 40 1.00 50％ 50％ 50 1.00 85％ 15％ 53 1.00 85％ 15％

本发明采用如下技术方案：第一阶段以茶多酚的水溶液为原料，通过弱极性的大孔吸附 树脂，以乙醇水溶液梯度洗脱，对EGCG和ECG初步分离；第二阶段是以富含EGCG和富 含ECG馏分为柱层析的原液，分别通过琼脂凝胶微球键合β-CD(AG-β-CD)为分离介质， 以80％乙醇为流动相，进行洗脱后，分别得到高纯度的EGCG和ECG，并且两个目标产物有 80％以上的回收率。

本发明的突出技术效果在于：

1、不仅能够同时得到高纯度EGCG和ECG，而且两种目标产物回收率高，整个过程只 使用水和乙醇溶剂，工艺流程简单顺畅，成本低，无有毒溶剂，安全环保，能够充分利用资 源，增加生产的经济效应，适合工业规模化生产。

2、通过廉价的大孔吸附树脂初步分离，以廉价易得的琼脂为原料进行交联并键合功能基 团，制备的琼脂微球键合β-CD作为纯化介质。

附图说明

图1为茶多酚上柱原液HPLC色谱图。

图2为富含EGCG馏分，即20％乙醇洗脱液HPLC色谱图。

图3为EGCG与ECG重叠馏分，即30％乙醇洗脱液HPLC色谱图。

图4为富含ECG馏分，40％乙醇洗脱液HPLC色谱图。

图5为EGCG成品HPLC色谱图。

图6为ECG成品HPLC色谱图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

称量5g茶多酚，用500ml纯化水溶解，充分搅拌30min，通过HPLC分析检测，茶多酚 原液中EGCG纯度为34.53％，ECG纯度为11.12％。过滤完毕后，通过蠕动泵上柱，层析介 质为AB-8大孔吸附树脂，柱体积150ml。上柱完毕后，用10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、 40％乙醇和50％乙醇梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱体积为300ml，洗脱流速为3.5ml/min，按 照浓度梯度分段收集。通过HPLC检查，10％乙醇洗脱液和50％乙醇洗脱液几乎不含目标产 物，通过相关回收处理后弃去。20％乙醇洗脱液为富含EGCG馏分，其相关物质中EGCG为 45.64％，ECG为0.41％，该馏分通过输液泵上柱，层析介质为AG-β-CD，柱体积为25ml， 通过输液泵上柱，上柱完毕后，用80％乙醇以1ml/min流速洗脱，1BV/次的频率分段收集， 通过HPLC检测，合并色谱纯度大于95％的洗脱液，回收率为88.72％，减压浓缩除醇后冷冻 干燥，得到成品。30％乙醇洗脱液为EGCG与ECG重叠馏分，通过纯化水稀释，将其乙醇浓 度稀释为8％，重新按照茶多酚原液处理方法循环处理。40％乙醇洗脱液为富含ECG馏分， 其相关物质中ECG为48.21％，EGCG为0.88％，该馏分通过输液泵上柱，层析介质为AG-β-CD， 柱体积为25ml，通过输液泵上柱，上柱完毕后，用80％乙醇以1ml/min流速洗脱，1BV/次的 频率分段收集，通过HPLC检测，合并色谱纯度大于90％的洗脱液，回收率为85.08％，减压 浓缩除醇后冷冻干燥，得到成品。

实施例2

称量20g茶多酚，用纯化水溶解，充分搅拌30min，通过HPLC分析检测，茶多酚原液 中相关物质EGCG为36.15％，ECG为11.53％。过滤完毕后，通过蠕动泵上柱，层析介质为 AB-8大孔吸附树脂，柱体积650ml。上柱完毕后，用10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％ 乙醇和50％乙醇梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱体积为1300ml，洗脱流速为16ml/min，按照浓 度梯度分段收集。通过HPLC检查，10％乙醇洗脱液和50％乙醇洗脱液几乎不含目标产物， 通过相关回收处理后弃去。20％乙醇洗脱液为富含EGCG馏分，其相关物质中EGCG为 59.36％，ECG为0.54％，取该馏分通过输液泵上柱，层析介质为AG-β-CD，柱体积为100ml， 通过输液泵上柱，上柱完毕后，用80％乙醇以4ml/min流速洗脱，1BV/次的频率分段收集， 通过HPLC检测，合并色谱纯度大于95％的洗脱液，回收率为90.03％，减压浓缩除醇后冷冻 干燥，得到成品。30％乙醇洗脱液为EGCG与ECG重叠馏分，通过纯化水稀释，将其乙醇浓 度稀释为10％，重新按照茶多酚原液处理方法循环处理。40％乙醇洗脱液为富含ECG馏分， 其相关物质中ECG纯度为45.67％，EGCG纯度为0.82％，取该馏分通过输液泵上柱，层析介 质为AG-β-CD，柱体积为100ml，通过输液泵上柱，上柱完毕后，用80％乙醇以4ml/min流 速洗脱，1BV/次的频率分段收集，通过HPLC检测，合并色谱纯度大于90％的洗脱液，回收 率为83.67％，减压浓缩除醇后冷冻干燥，得到成品。

实施例3

称量50g茶多酚，用5L纯化水溶解，充分搅拌30min，通过HPLC分析检测，茶多酚原 液中相关物质EGCG为34.23％，ECG为11.78％。过滤完毕后，通过蠕动泵上柱，层析介质 为AB-8大孔吸附树脂，柱体积1600ml。上柱完毕后，用10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、 40％乙醇和50％乙醇梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱体积为3200ml，洗脱流速为40ml/min，按 照浓度梯度分段收集。通过HPLC检查，10％乙醇洗脱液和50％乙醇洗脱液几乎不含目标产 物，通过相关回收处理后弃去。20％乙醇洗脱液为富含EGCG馏分，其相关物质中EGCG为 60.36％，ECG为0.73％，取该馏分通过输液泵上柱，层析介质为AG-β-CD，柱体积为250ml， 通过输液泵上柱，上柱完毕后，用80％乙醇以10ml/min流速洗脱，1BV/次的频率分段收集， 通过HPLC检测，合并色谱纯度大于95％的洗脱液，回收率为92.32％，减压浓缩除醇后冷冻 干燥，得到成品。30％乙醇洗脱液为EGCG与ECG重叠馏分，通过纯化水稀释，将其乙醇浓 度稀释为10％，重新按照茶多酚原液处理方法循环处理。40％乙醇洗脱液为富含ECG馏分， 其相关物质中ECG纯度为48.35％，EGCG纯度为0.91％，取该馏分通过输液泵上柱，层析介 质为AG-β-CD，柱体积为250ml，通过输液泵上柱，上柱完毕后，用80％乙醇以10ml/min 流速洗脱，1BV/次的频率分段收集，通过HPLC检测，合并色谱纯度大于90％的洗脱液，回 收率为81.56％，减压浓缩除醇后冷冻干燥，得到成品。

茶多酚上柱原液HPLC色谱图参见图1，富含EGCG馏分，即20％乙醇洗脱液HPLC色 谱图参见图2，EGCG与ECG重叠馏分，即30％乙醇洗脱液HPLC色谱图参见图3，富含ECG 馏分，40％乙醇洗脱液HPLC色谱图参见图4。EGCG成品HPLC色谱图参见图5，ECG成 品HPLC色谱图参见图6。

本发明是将茶多酚溶液通过弱极性大孔吸附树脂，乙醇—水二元梯度洗脱，得到富含 EGCG馏分，EGCG与ECG重叠馏分，以及富含ECG馏分。富含EGCG馏分通过琼脂凝胶 微球键合β-CD(AG-β-CD)柱层析，纯度95％以上的EGCG时回收率高于85％；富含ECG 馏分同样用AG-β-CD柱层析，ECG纯度达到90％以上时的回收率为高于80％；EGCG与ECG 重叠馏分循环通过同型号的大孔吸附树脂处理，继续分离富含EGCG馏分和富含ECG馏分。 该方案不仅能够同时从茶多酚中获得高纯度的EGCG与ECG，增加了经济效应，而且保证了 其高的回收率，提高生产产率，并且其分离介质价格较低，无有毒溶剂，工艺流程简单流畅， 利于规模化生产。