由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元

摘要

本发明部分基于化学上定义的由人多能干细胞(hPSC)生成神经干细胞(NSC)和多巴胺能(DA)神经元的方法。本发明的所述DA神经元可衍生自hPSC和NSC。本发明还提供了用于由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元的试剂和试剂盒。

说明书

发明领域

本发明总体涉及干细胞并且更具体地涉及由人多能干细胞衍生神经干细胞 和多巴胺能神经元的方法。

背景信息

人胚胎干(ES)细胞是可以分化成多个细胞类型的多能细胞。干细胞与其它细 胞类型的区别在于两个重要特征。第一，它们是有时在长期失活后，能够通过细 胞分裂自我更新的非特化细胞。第二，在某些生理或实验条件下，它们可经诱导 变成具有特定功能的组织或器官特异性细胞。在一些器官，例如肠和骨髓中，干 细胞定期分裂以修复和更换磨损或损伤组织。然而，在其它器官，例如胰腺和心 脏中，干细胞只在特定条件下分裂。

胚胎发育期间，干细胞由3大主要细胞群形成机体组织：外胚层、中胚层和 定形内胚层。中胚层产生血细胞、内皮细胞、心肌和骨骼肌及脂肪细胞。定形内 胚层生成肝脏、胰腺和肺部。外胚层产生神经系统、皮肤和肾上腺组织。

干细胞的潜在应用是产生用于医药疗法的细胞和组织。如今，常常将捐赠的 器官和组织用于置换患病或受损的器官和组织。不幸的是，需要移植物的人数远 远超出可用于移植的器官数量。干细胞提供了替代细胞和组织可再生源的可能 性，以治疗大量疾病、病状和残疾，包括帕金森氏症(Parkinson's disease)、肌萎 缩侧索硬化、脊髓损伤、烧伤、心脏病、糖尿病和关节炎。

帕金森氏症(PD)是由黑质致密部中的中脑多巴胺(DA)神经元进行性变性引 起的神经障碍。DA神经元变性引起运动系统逐步机能失凋，导致例如震颤、强 直和运动徐缓等症状。对于PD而言，目前尚无治愈并且虽然治疗例如深部脑刺 激和左旋多巴可以减轻一些症状，但是它们往往随时间推移而失效。然而，黑质 (SN)中DA神经元损失的局部特性使得细胞替代疗法成为有吸引力的治疗帕金 森氏症(PD)患者的方法。已经证实植入神经元细胞，例如神经干细胞(NSC)和DA 神经元改善了PD动物模型中的运动症状。为了使对PD的基于干细胞的疗法变 成现实，关键是能够生成将根据在患者脑部或在培养物中是否发生终末分化，依 次在原位或在体外生成功能性DA神经元的同源NSC群体。

发明概述

本发明部分基于化学上定义的由人多能干细胞(hPSC)生成神经干细胞(NSC) 和多巴胺能(DA)神经元的方法。本发明的所述DA神经元可衍生自hPSC和NSC。 本发明还提供了用于由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元的试剂 和试剂盒。

本发明提供通过用至少一种神经干细胞诱导化合物处理人多能干细胞 (hPSC)并且测定细胞的神经干细胞标志物衍生神经干细胞(NSC)。本发明还提供 经由稳定的NSC期以稳健且可重现的方式由hPSC衍生高纯度DA神经元群， 其中可使用新研发的化学定向分化法扩增和冷藏细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了一种生成神经干细胞(NSC)的方法。所述 方法包括用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多 能干细胞(hPSC)并且分析所述细胞的神经干细胞标志物。一方面，CK1抑制剂为 SB218078。另一方面，BMP抑制剂可能为Dorsomorphin、LD-193189或DMH-1。 在特定方面，CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomorphin；CK1抑 制剂为SB218078而BMP抑制剂为LD-193189；和CK1抑制剂为SB218078而 BMP抑制剂为DMH-1。

一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导型 多能干细胞(iPSC)或由其衍生的细胞系。

一方面，神经干细胞标志物包括BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、 FABP7、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋白、OTX2、 PAX6、TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5或其任何组合。

另一方面，用SB218078和DMH-1处理hPSC。所得NCS表达LMX1A和 FOX2A并且为中脑腹侧神经外胚层细胞。中脑腹侧神经外胚层细胞为多巴胺能 神经元的前体。

在一个实施方案中，本发明提供神经干细胞(NSC)。通过用检测点激酶1(CK1) 抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)并且分析所述 细胞的神经干细胞标志物生成主题NSC。一方面，CK1抑制剂为SB218078。另 一方面，BMP抑制剂可能为Dorsomorphin、LD-193189或DMH-1。在特定方面， CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomorphin；CK1抑制剂为 SB218078而BMP抑制剂为LD-193189；和CK1抑制剂为SB218078而BMP抑 制剂为DMH-1。

一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导型 多能干细胞(iPSC)或由其衍生的细胞系。

在另一实施方案中，本发明提供了一种生成多巴胺能神经元的方法。所述方 法包括用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能 干细胞(hPSC)；通过测定经处理的hPSC的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞； 用至少一种多巴胺能神经元诱导化合物处理NSC并且分析细胞的多巴胺能神经 元细胞标志物。在某些方面，CK1抑制剂为SB218078并且BMP抑制剂为 Dorsomorphin、LD-193189或DMH-1。在一个优选方面，CK1抑制剂为SB218078 而BMP抑制剂为DMH-1。

一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导型 多能干细胞(iPSC)或由其衍生的细胞系。

在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、 CXCR4、DCX、FABP7、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、 巢蛋白、OTX2、PAX6、TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5或其 任何组合。

在所述方法的某些方面，多巴胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、L- 半胱亚磺酸、犬尿喹啉酸、(R)-(+)-HA-966、间氯苯基双胍盐酸盐、钙蛋白酶抑 制剂、Dimaprit二盐酸盐、8-羟基-DPAT-氢溴酸盐、反式-4-羟基巴豆酸、盐酸法 舒地尔、噻普酰胺、视黄酸、AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI 215,001盐 酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺哌隆、肯泡隆(Kenpaullone)、CL 218872、CV 1808、 Ro 15-4513、二盐酸利诺吡啶、没药甾酮(Guggulsterone)、Ch 55、3-MATIDA、 SEW 2871、Immethridine二氢溴酸盐、LY 364947、反苯环丙胺盐酸盐、(-)-野靛 碱或尼鲁米特或其任何组合。在一个优选方面，多巴胺能神经元诱导化合物为没 药甾酮。

在所述方法的另一方面，多巴胺能神经元细胞标志物可能为TUJ1、TH、Dat、 Foxa2、Nurr-1、Girk2、MAPT、SYT4、FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、 LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、 PITX1或VMAT2或其任何组合。

另一实施方案中，本发明提供多巴胺能神经元。通过用检测点激酶1(CK1) 抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)；通过测定经处 理的hPSC的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞；用至少一种多巴胺能神经元诱 导化合物处理NSC并且分析细胞的多巴胺能神经元细胞标志物生成主题DA神 经元。在某些方面，CK1抑制剂为SB218078并且BMP抑制剂为Dorsomorphin、 LD-193189或DMH-1。在一个优选方面，CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制 剂为DMH-1。

一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导型 多能干细胞(iPSC)或由其衍生的细胞系。

在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、 CXCR4、DCX、FABP7、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、 巢蛋白、OTX2、PAX6、TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5或其 任何组合。

在所述方法的另一方面，多巴胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、L- 半胱亚磺酸、犬尿喹啉酸、(R)-(+)-HA-966、间氯苯基双胍盐酸盐、钙蛋白酶抑 制剂、Dimaprit二盐酸盐、8-羟基-DPAT-氢溴酸盐、反式-4-羟基巴豆酸、盐酸法 舒地尔、噻普酰胺、视黄酸、AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI 215,001盐 酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺哌隆、肯泡隆、CL 218872、CV 1808、Ro 15-4513、 二盐酸利诺吡啶、没药甾酮、Ch 55、3-MATIDA、SEW 2871、Immethridine二 氢溴酸盐、LY 364947、反苯环丙胺盐酸盐、(-)-野靛碱或尼鲁米特或其任何组合。 在一个优选方面，多巴胺能神经元诱导化合物为没药甾酮。

在所述方法的再一方面，多巴胺能神经元细胞标志物可能为TUJ1、TH、Dat、 Foxa2、Nurr-1、Girk2、MAPT、SYT4、FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、 LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、 PITX1或VMAT2或其任何组合。

在另一实施方案中，本发明提供了用于衍生NSC的试剂盒。所述试剂盒包 括检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、鉴定神经干细胞标 志物的试剂和由hPSC生成NSC的说明书。一方面，CK1抑制剂为SB218078 并且BMP抑制剂为Dorsomorphin、LD-193189或DMH-1。在某些方面，CK1 抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomorphin；CK1抑制剂为SB218078 而BMP抑制剂为LD-193189；CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。 所述试剂盒可以包括鉴定BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、FOXA2、 FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋白、OTX2、PAX6、TUBB3、 SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5神经干细胞标志物的试剂。

在另一实施方案中，本发明提供了用于生成多巴胺能神经元的试剂盒。所述 试剂盒包括检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂；鉴定神经 干细胞标志物的试剂；至少一种多巴胺能神经元诱导化合物；鉴定多巴胺能神经 元干细胞标志物的试剂；和由hPSC生成多巴胺能神经元的说明书。一方面，CK1 抑制剂为SB218078，BMP抑制剂为DMH-1并且多巴胺能神经元诱导化合物为 没药甾酮。所述试剂盒可以包括鉴定BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、 FABP7、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋白、OTX2、 PAX6、TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5神经干细胞标志物的 试剂。所述试剂盒还可以包括鉴定TUJ1、TH、Dat、Foxa2、Nurr-1、Girk2、 MAPT、SYT4、FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、 NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1或VMAT2 多巴胺能神经元细胞标志物的试剂。

另一实施方案中，本发明提供了神经疾病和病症的治疗方法。所述方法包括 向有神经疾病或病症的受试者施用NSC。

再一实施方案中，本发明提供了治疗神经疾病或病症的方法。所述方法包括 向有神经疾病或病症的受试者施用NSC或DA神经元。

附图简述

图1描绘了高通量神经诱导小分子筛选测定。将未分化的无饲养层hPSC接 种在96孔板中，用小分子处理，然后固定并对PAX6表达染色。

图2为显示对经小分子处理的hPSC筛选PAX6表达的图。用与Dorsomorphin 组合的SB218078处理产生PAX6的高表达。

图3为显示通过RT-PCR在经SB218078和Dorsomorphin、DMH-1或 LD193189处理的hPSC上表达Sox1、Sox2、Pax6、Otx2、Lmx1和Fox2A的图。

图4显示在第7代时对hPSC衍生的NSC的FAC分析，证明了巢蛋白和 musashiI的表达。

图5A-F显示通过小分子生成hPSC衍生的NSC。(A)显示hPSC神经诱导 的小分子筛选策略的图解。(B)用SB218078和DMH1处理7天并且对PAX6染 色的hPSC。比例尺为100μm。(C)对巢蛋白、Musashi和PAX6染色的扩增 hPSC-NSC。比例尺为100μm。(D)对Musashi、巢蛋白、PAX6和OCT4染色 的hPSC-NSC群的FACS分析。(E)显示从hPSC到NSC成倍表达诱导神经标志 物的基因表达微阵列分析；n＝2。(F)通过RT-PCR对hPSC和hPSC-NSC的基因 表达分析。平均数±平均数标准误差，双尾学生t检验：n＝3-5；α＝0.05；**P<0.01； *P<0.05。

图6A-K显示没药甾酮促进DA神经元的生成。(A)显示hPSC衍生的 NSC(hPSC-NSC)分化为DA神经元的小分子筛选策略的图解。(B)没药甾酮(GS) 处理30天后对多巴胺能标志物的染色。比例尺为100μm。(C)对TH染色的衍 生DA神经元的FACS分析。(D)通过基因表达微阵列分析测定，多巴胺能标志 物从NSC到DA神经元的成倍诱导；n＝2(E)通过RT-PCR分析的DA神经元、 NSC和未分化hPSC中的相对基因表达。平均数±平均数标准误差，单因素 ANOVA，用Dunnett检验将DA神经元和NSC的表达与hPSC对照比较：n＝3-5； α＝0.05；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。(F)经GS处理的神经元与对照细胞(用 100ng/ml FGF8和2μM嘌吗啡胺(purmorphamine)处理1周并且用0.1％DMSO代 替GS处理2周的NSC)的多巴胺释放测定。平均数±平均数标准误差，双尾学生 t检验：n＝3；α＝0.05；**P<0.01。(G)全细胞膜片钳制GS处理神经元的代表性 相衬图像。比例尺为10μm。(H)在电压钳模式中对(G)中的细胞应用从-60到 +50mV的电压斜升引起的钠电流。斜升参数和波形叠加在电流轨迹上以红色示 出。蓝色箭头指刺激斜升跨过0mV值的点。(I)在电流钳模式中，通过注射500pA， 200ms，由(g)中的细胞引起的动作电位。在20个膜片钳细胞中的7个发现动作 电位。(J)经GS处理的神经元的细胞外微电极阵列(MEA)记录，显示3个代表 性电极的10s电压轨迹。在右边扩增了每个电极的单个峰。(K)(j)中电极的峰峰 间隔直方图，显示：(↓↓)与爆发中峰间间隔相关的峰值；(↓)爆发间期或非爆发 电极上单个峰之间的较长间隔的峰值。进行记录，一式两份。

发明详述

本发明部分基于由人多能干细胞(hPSC)生成神经干细胞(NSC)和多巴胺能 (DA)神经元的方法。本发明的所述DA神经元可衍生自hPSC和NSC。本发明还 提供了用于由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元的试剂和试剂盒。

在描述本组合物和方法之前，应理解本发明不限于描述的特定组合物、方法 和实验条件，正因如此组合物、方法和条件可能不同。还应理解，本文使用的术 语仅仅是为了描述特定实施方案，而非旨在限制，因为只在所附权利要求中限制 本发明的范围。

如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文明确另外指出，单数形式“一 种”、“一个”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，提到“所述方法”包括一种 或多种方法，和/或对于本领域的技术人员而言在阅读本公开后将变得显而易见 的本文所述类型的步骤等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域 中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然在本发明的实践或试验中可使用与 本文所述相似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选方法和材料。

本发明提供通过用至少一种神经干细胞诱导化合物处理hPSC并且测定所述 细胞的神经干细胞标志物衍生神经干细胞(NSC)。本发明还提供经由稳定的NSC 期以稳健且可重现的方式由hPSC衍生高纯度DA神经元群，其中可使用新研发 的化学定向分化法扩增和冷藏细胞。

由人多能干细胞(hPSC)，包括但不限于人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干 细胞(hpSC)、诱导型多能干细胞(iPSC)生成神经干细胞(NSC)是基于细胞的用于 治疗神经疾病的策略的重要组成部分。然而，可在治疗方式中施用hPSC衍生的 NSC之前，必须研发可重现且稳健地诱导NSC生成的化学定义的培养条件。此 处，进行高通量筛选以鉴定诱导hPSC分化为NSC的小分子。由筛选鉴定出小 分子SB218078，报道的检测点激酶1(CK1)抑制剂，并且用于研发使hPSC分化 为NSC的化学定义的分化法。

本文报道的化学方法提供由可进一步分化成成熟神经元，用于细胞疗法或药 物发现的hPSC生成同源NSC群体。

由人多能干细胞(hPSC)，包括但不限于人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干 细胞(hpSC)、诱导型多能干细胞(iPSC)生成多巴胺能细胞(DC)是基于细胞的用于 治疗帕金森氏症的策略的重要组成部分。然而，可在治疗方式中施用hPSC衍生 的DC之前，必须研发可重现且稳健地诱导多巴胺能细胞分化的化学定义的培养 条件。进行高通量筛选以鉴定诱导hPSC衍生的神经干细胞(hPSC-NSC)分化为多 巴胺能(DA)神经元的小分子。由筛选鉴定出小分子，然后用于研发使hPSC-NSC 分化为多巴胺能细胞的化学定义的分化法。

本文报道的化学方法提供了由hPSC生成可用于神经疾病细胞疗法(例如帕 金森氏症)或药物发现的多巴胺能神经元的说明。另外，发现本文报道为多巴胺 能细胞分化的诱导剂的小分子具有有效的体外人多巴胺神经元神经保护作用并 且可用于预防神经疾病(例如帕金森氏症)和/或神经疾病(例如帕金森氏症)的进 展。

已经鉴定了调节人多能干细胞向DA神经元的逐步分化的新的小分子。发现 类固醇，没药甾酮，为神经干细胞向DA神经元最有效的诱导剂。这些神经元受 广泛表征并且证实具功能性。这种新方法提供了产生用于治疗神经疾病患者的足 够质量的神经元的实用途径。

本文公开了衍生神经干细胞(NSC)、多巴胺能(DA)神经元的方法并且所得干 细胞和本文所述的神经元由人多能干细胞(hPSC)，例如胚胎干细胞生成。如本文 所使用，“胚胎”指以单合子开始而以不再包含除已发育配子细胞外的多能或全能 细胞的多细胞结构结束的一系列生物发育期。除通过配子融合衍生的胚胎外，术 语“胚胎”指通过体细胞核转移衍生的胚胎。可使用本领域已知的方法在培养中将 人干细胞维持在无实质性分化的多能状态。例如，在美国专利第5,453,357、 5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806和6,251,671号中描述了此类方法， 其公开内容通过引用整体并入本文。

如本文所使用，“专能”或“专能细胞”指可产生数量有限的其它特定细胞类型 的细胞类型。专能细胞的实例包括可产生数量有限的其它细胞的外胚层细胞、内 胚层细胞、中胚层细胞和神经干细胞。

如本文所使用，“多能干细胞”指可在体外更长、理论上无限的时期维持呈未 分化状态，可产生不同分化组织类型，即外胚层、中胚层和内胚层的细胞。人多 能干细胞(hPSC)包括但不限于人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC) 和诱导型多能干细胞(iPSC)。获得此类hPSC的方法在本领域中众所周知。

获得hPSC的一种方法为通过孤雌生殖。“孤雌生殖”(“单性生殖激活”和“孤 雌生殖激活”在本文中可交换使用)指在没有精子穿入时发生卵母细胞激活的过 程，并且指包含滋养外胚层和内细胞群的早期胚胎发育，早期胚胎通过激活卵母 细胞或胚胎细胞，例如包含全部雌性来源的DNA的卵裂球获得。在一个相关方 面，“单性生殖生物”指通过这样激活获得的所得细胞。在另一个相关方面，“胚 泡”指包含由外滋养层细胞和内细胞群(ICM)构成的空心细胞球的受精或激活卵 母细胞的卵裂阶段。再一相关方面，“胚泡形成”指卵母细胞受精或激活后，随后 在培养基中将卵母细胞培养一段时间以使其能够发育成由外滋养层细胞和ICM 构成的空心细胞球的过程(例如，5至6天)。

获得hPSC的另一种方法为通过核转移。如本文所使用，“核转移”指供体细 胞或来自供体细胞的DNA向适合受体细胞的融合或移植，受体细胞通常为移植 或融合之前、同时或之后经处理以去除或灭活其内源性核DNA的相同或不同物 种的卵母细胞。用于核转移的供体细胞包括胚胎细胞和分化细胞，例如体细胞和 生殖细胞。供体细胞可能处于增殖细胞周期(G1、G2、S或M)或非增殖(G0或静 止)期。优选地，供体细胞或来自供体细胞的DNA源自增殖哺乳动物细胞培养物， 例如成纤维细胞培养物。供体细胞可任选经转基因，即，其可能包含一个或多个 基因添加、取代或缺失修饰。

获得hPSC的另一种方法是通过细胞重编程以获得诱导型多能干细胞。 Takahashi等(Cell 131,861-872(2007))已经公开了用于不使用任何胚胎或ES(胚 胎干)细胞重编程分化细胞，并且建立具有与ES细胞相似的多能性和生长能力的 诱导型多能干细胞的方法。Takahashi等描述了已分化成纤维细胞的各种不同核 重编程因子，其包括以下4个基因的产物：Oct家族基因；Sox家族基因；Klf 家族基因；和Myc家族基因。

优选通过在适当条件下培养细胞，例如通过在成纤维细胞饲养层或包括白血 病抑制因子(LIF)的另一饲养层或培养物上培养维持细胞的多能状态。这样培养 的细胞的多能状态可通过各种方法确认，例如(i)确认多能细胞特有的标志物的 表达；(ii)产生含有表达多能细胞基因型的细胞的嵌合动物；(iii)将细胞注入动 物，例如SCID小鼠体内，在体外产生不同分化细胞类型；和(iv)观察体外细胞 (例如，当在没有饲养层或LIF培养的情况下时)向胚状体和其它分化细胞类型的 分化。

用于本发明的细胞的多能状态可通过各种方法确认。例如，可测试细胞的特 有ES细胞标志物的存在或缺乏。就人ES细胞而言，以上鉴定了此类标志物的 实例，并且包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT 4，并且在本 领域中已知。

同样，可通过将所述细胞注入适合动物例如SCID小鼠体内，并且观察分化 细胞和组织的产生确认多能性。确认多能性的另一种方法是使用主题多能细胞生 成嵌合动物并观察引入细胞对不同细胞类型的贡献。

确认多能性的再一种方法是当在有利于分化的条件下(例如，去除成纤维细 胞饲养层)培养时，观察ES细胞向胚状体和其它分化细胞类型的分化。已经利用 了这种方法并且已经确认主题多能细胞在组织培养中产生胚状体和不同分化细 胞类型。

所得多能细胞和细胞系，优选人多能细胞和细胞系，具有许多治疗和诊断应 用。此类多能细胞可在许多疾病状况的治疗中用于细胞移植疗法或基因疗法(如 果经遗传修饰)。

人多能干细胞(hPSC)包括但不限于人胚胎干细胞、人孤雌生殖干细胞、诱导 型多能干细胞和由此类细胞产生的细胞系。在培养中通过常规传代维持hPSC呈 多能状态，直至需要衍生神经干细胞。

“NSC”(也称为“专能神经干细胞”)展现出下列一种或多种性质：1)表达巢蛋 白；2)表达Sox2；3)表达Musashi1；4)作为单层细胞或在悬浮培养中作为神 经球，进行自我更新的能力；5)分化成神经元、神经元的特定亚型、星形细胞 和少突胶质细胞的能力；和6)NSC典型的形态特征。

NSC为产生神经系统的主要表现型的自我更新、专能细胞。NSC主要分化 成神经元、星形细胞和少突胶质细胞。

神经外胚层(Neuroectoderm)(或神经外胚层(neural ectoderm)或神经管上皮) 是从蛋白质例如诺金(noggin)接收骨形态发生蛋白抑制信号，导致来自该组织的 神经系统发育的外胚层的术语。从外胚层募集后，神经外胚层经历3个发育阶段： 转化成神经板、转化成神经沟(与神经褶相关)和转化成神经管。所述管形成后， 大脑形成3个部分：后脑、中脑和前脑。

可通过检测神经干细胞标志物的表达增强鉴定神经干细胞，神经干细胞标志 物包括但不限于：ABCG2、ASCL1/Mash1、β-III微管蛋白、BMI-1、Brg1、BRN2、 CDCP1、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP、FABP7/B-SLAIN1、 FABP8/M-FABP、FGF R4、FOXA2、FOXO4、Frizzled-9、GFAP、Glut1、HOXB1、 LMX1A、MAP2、Musashi-1、Musashi-2、巢蛋白、NeuroD1、诺金、Notch-1、 Notch-2、核干因子(Nucleostemin)、少突胶质细胞标志物O4、OTX2、PAX6、PDGF Rα、凸素2(Prominin 2)、SOX1、SOX2、SOX3、SOX9、SOX11、SOX21、SSEA-1、 ST6GALNAC5、TUBB3、TRAF-4和/或波形蛋白(Vimentin)。

巢蛋白是有用的标志物，因为虽然其主要在中枢神经系统(CNS)的干细胞中 表达，但是在几乎所有成熟CNS细胞中不存在其表达。已知转录因子SOX2在 发育CNS的神经上皮中高水平表达并且认为对神经干细胞增殖和分化非常重 要。

本发明提供了通过用至少一种神经干细胞诱导化合物处理hPSC并且测定所 述细胞的神经干细胞标志物衍生神经干细胞(NSC)的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了一种生成神经干细胞(NSC)的方法。所述 方法包括用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多 能干细胞(hPSC)并且分析所述细胞的神经干细胞标志物。一方面，CK1抑制剂为 SB218078。另一方面，BMP抑制剂可能为Dorsomorphin、LD-193189或DMH-1。 在特定方面，CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomorphin；CK1抑 制剂为SB218078而BMP抑制剂为LD-193189；和CK1抑制剂为SB218078而 BMP抑制剂为DMH-1。

一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导型 多能干细胞(iPSC)或由其衍生的细胞系。

一方面，神经干细胞标志物包括BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、 FABP7、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋白、OTX2、 PAX6、TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5或其组合。

如实施例中所证明，本发明提供了表达BRN2、CD113、CD15、CXCR4、 DCX、FABP7、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋 白、OTX2、PAX6,TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3和ST6GALNAC5的NSC。

如本文所使用，“神经干细胞诱导化合物”为诱导hPSC变成NSC的化合物。 此类化合物包括但不限于检测点激酶抑制剂和骨形态发生蛋白抑制剂。

检测点激酶1(Chk1)在细胞周期G2过渡的调节中起重要作用。响应于DNA 损伤激活G1、S和G2的3个检测点。可用一些化学试剂或通过辐射或在DNA 复制期间诱导DNA损伤。检测点的作用是在发生DNA损伤时延迟细胞周期进 程，以便为DNA修复提供时间。G1/S检测点依赖于p53。在DNA损伤的存在 下，发生对p53活性的快速诱导，诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制和细胞周期 阻滞以防止S期期间复制受损DNA。在缺乏G1检测点的p53突变细胞中，仅 G2检测点能够提供允许激活DNA修复途径的细胞周期进程延迟。Chk1抑制剂 消除了G2检测点。

CK1抑制剂的实例包括但不限于SB-218078、己炔二醇(Hymenialdisine)、脱 溴己炔二醇(Debromohymenialdisine)、PD0166285、13-羟基-15-oxozoapat系、 granulatimide、isogranulatimide和S27888。

骨形态发生蛋白(BMP)是属于转化生长因子β(TGFβ)超家族的多功能生长因 子。最初通过其诱导骨和软骨形成的能力发现，现在认为BMP构成了一组关键 的形态发生信号，编排整个身体的组织架构。BMP与细胞表面称为骨形态发生 蛋白受体(BMPR)的特定受体相互作用。通过BMPR的信号转导导致SMAD蛋 白家族的成员活动。牵涉BMP、BMPR和Smad的信号通路在心脏、中枢神经 系统和软骨的发育以及产后骨发育中是重要的。它们在胚胎发育期间对胚胎模式 和早期骨骼形成具有重要作用。BMP信号在心脏、神经和软骨发育中起关键作 用。

BMP抑制剂的实例包括但不限于Dorsomorphin、LD-193189和DMH-1。

可使用本领域中技术人员众所周知的方法容易地鉴定由hPSC衍生的NSC。 这些方法包括使用免疫组织化学法、FACS分析和RNA表达水平的测量鉴定神 经干细胞标志物。

在一个实施方案中，本发明提供神经干细胞。通过用检测点激酶1(CK1)抑 制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)并且分析所述细 胞的神经干细胞标志物生成主题NSC。一方面，CK1抑制剂为SB218078。另一 方面，BMP抑制剂可能为Dorsomorphin、LD-193189或DMH-1。在特定方面， CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomorphin；CK1抑制剂为 SB218078而BMP抑制剂为LD-193189；和CK1抑制剂为SB218078而BMP抑 制剂为DMH-1。

一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导型 多能干细胞(iPSC)或由其衍生的细胞系。

一方面，NSC表达可为BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、 FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋白、OTX2、PAX6、 TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3和ST6GALNAC5或其任何组合的神经干细胞标 志物。

另一方面，用SB218078和DMH-1处理hPSC。所得NCS表达LMX1A和 FOX2A并且是中脑腹侧神经外胚层细胞。中脑腹侧神经外胚层细胞为多巴胺能 神经元的前体。

一旦衍生NSC，就可在体外维持所述细胞更长、理论上无限的时期，保持 其分化成其它神经细胞类型，例如星形细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。如 实施例中所述，可使hPSC衍生的NSC在基质胶涂层板上于NSC培养基中生长 至少7代。

如实施例中所示，使用高通量筛选策略鉴定了两种有效的神经诱导剂， SB218078和DMH-1(图5A)。hPSC衍生的NSC(hPSC-NSC)群体对巢蛋白、 Musashi-1、PAX6、FABP7、BRN2、SOX3、ST6GALNAC5、CXCR4、DCX、 NES、MSI、CD113、CD15、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、MAP2、OTX2、 TUBB3、SOX1、SOX2和ST6GALNAC5神经干细胞标志物呈阳性而对OCT4 和NANOG多能性标志物呈阴性(图3、5B、5C、5D和5F)。FABP7编码CNS 发育中牵涉的脑脂肪酸结合蛋白并且在NSC中高度表达。ST6GALNAC5编码介 导细胞通过血脑屏障的通道的α2,6-唾液酸转移酶。进一步地，使用SB218078 和DMH-1衍生的NSC表达LMX1A和FOX2A。在为多巴胺能神经元前体的中 脑腹侧神经外胚层细胞上表达LMX1A和FOX2A。这些NSC适于进一步扩增、 冷藏和分化，使其成为DA神经元的实用来源。正因如此，本发明证明公开的方 法由hPSC生成NSC。

本发明还提供在限定化学条件下由hPSC生成多巴胺能神经元。

如本文所使用，“分化”指细胞中发生的使那些细胞呈现某些特化功能并且失 去变成某些其它特化功能单元的能力的变化。能够分化的细胞可能为全能细胞、 多能细胞或专能细胞的任一种。就成熟的成体细胞而言，分化可能是部分或完全 的。

“分化细胞”指具有特定分化(即，非胚胎)状态的非胚胎细胞。三种最早分化 的细胞类型为内胚层、中胚层和外胚层。

由hPSC衍生的NSC为专能性并且可分化成几种神经细胞类型，包括神经 元、星形细胞和少突胶质细胞。

星形细胞，也统称为星形神经胶质，是大脑和脊髓中的特有星形胶质细胞。 它们是人大脑最丰富的细胞。它们执行许多功能，包括对形成血脑屏障的内皮细 胞的生物化学支持，为神经组织提供营养，维持细胞外离子平衡和在跌打损伤后 在大脑和脊髓的修复和瘢疤形成过程中的作用。

神经元是通过电和化学信号加工并传递信息的电可兴奋性细胞。化学信号经 由突触，与其它细胞的特化连接产生。神经元相互连接形成神经网络。神经元是 神经系统的核心组分，神经系统包括大脑、脊髓和外周神经节。存在许多特化类 型的神经元：感觉神经元对触摸、声音、光和影响感觉器官的细胞的许多其它刺 激响应，然后感觉器官的细胞向脊髓和大脑发送信号。运动神经元接收来自大脑 和脊髓的信号，使肌肉收缩并影响腺体。中间神经元将神经元连接到大脑或脊髓 相同区域内的其它神经元。存在几种类型的神经元：胆碱能、GABA能、谷氨酸 能、多巴胺能和血清素能(Serotonergic)。

胆碱能神经元。乙酰胆碱从突触前神经元释放到突触间隙。其用作配体门控 离子通道和代谢型(GPCR)蕈毒碱受体的配体。烟碱受体是由结合烟碱的α和β 亚基构成的五聚体配体门控离子通道。配体结合打开引起Na⁺流去极化的通道并 且增加了突触前神经递质释放的可能性。

GABA能神经元-γ氨基丁酸。GABA是CNS中两种神经抑制剂之一，另一 种是甘氨酸。GABA具有ACh，允许Cl-离子进入突触后神经元的门控阴离子通 道的同源功能。Cl-离子在神经元中引起超极化，降低了当电压变为更大负值时， 动作电位放电的可能性(记得对于放电的动作电位而言，必须达到正电压阈值)。

谷氨酸能神经元。谷氨酸是两种主要兴奋性氨基酸之一，另一种为天冬氨酸。 谷氨酸受体是4大类之一，其中3类为配体门控离子通道而另一类为G蛋白偶 联受体(常常称为GPCR)。AMPA和红藻氨酸(Kainate)受体均起到对介导快速兴 奋性突触传递的Na+阳离子通道有渗透性的阳离子通道的作用。NMDA受体是 对Ca²⁺更有渗透性的另一种阳离子通道。NMDA受体的功能取决于通道孔内作 为协同激动剂的甘氨酸受体结合。NMDA受体在没有两种配体存在时不起作用。 代谢型受体，GPCR调节突触传递和突触后兴奋性。当阻断进入大脑的血流时， 谷氨酸可引起兴奋性中毒，导致脑损伤。当压制血流时，谷氨酸从突触前神经元 释放，使NMDA和AMPA受体比在没有应力条件时通常如此的激活程度更高， 导致进入突触后神经元的Ca²⁺和Na⁺增多和细胞损伤。

多巴胺能神经元。多巴胺是对增加cAMP和PKA的D1类型(D1和D5)Gs 偶联受体和激活减少cAMP和PKA的Gi偶联受体的D2类型(D2、D3和D4)受 体起作用的神经递质。多巴胺与情绪和行为相关联，并且调节突触前和突触后神 经传递。已经将黑质中多巴胺神经元的缺失与帕金森氏症联系起来。

血清素能神经元。血清素，(5-羟色胺，5-HT)可作为兴奋性或抑制性。四个 5-HT受体类别中，三类为GPCR而一类为配体门控阳离子通道。通过色氨酸羟 化酶由色氨酸合成血清素，然后进一步通过芳香酸脱羧酶合成。已经将突触后神 经元处5-HT的缺乏与抑郁联系起来。阻滞突触前血清素转运体的药物用于治疗， 例如百优解(Prozac)和左洛复(Zoloft)。

少突胶质细胞是另一类型的脑细胞。少突胶质细胞的主要功能是提供支持和 隔离一些脊椎动物的中枢神经系统(大脑和脊髓)中的轴突(神经细胞的长突出部 分)。少突胶质细胞通过产生为80％脂质和20％蛋白质的髓鞘这样做。单个少突 胶质细胞可将其突出延伸到50个轴突，将约1μm髓鞘包裹在每个轴突周围。每 个少突胶质细胞为几个相邻轴突形成一段髓磷脂。

在恰当培养条件下，可诱导主题NSC表达特定神经基因，例如中脑多巴胺 能谱系的基因，例如Nurr1和Pitx3。

可诱导主题NSC分化成表达酪氨酸羟化酶(TH)的神经元。TH是多巴胺能神 经元的已知标志物。在一些实施方案中，主题NSC分化成运动神经元，其中运 动神经元对HB9呈阳性。在一些实施方案中，主题NSC分化成GABA能神经 元，其中GABA能神经元对GAD67呈阳性。在一些实施方案中，主题诱导型 NSC分化成多巴胺能神经元，其中多巴胺能神经元为TH阳性。

可通过表达神经元标志物Tuj1(β-III-微管蛋白)；MAP-2(微管相关蛋白2，也 可使用其它MAP基因例如MAP-1或-5)；抗轴突生长克隆系；ChAT(胆碱乙酰转 移酶)；CgA(抗嗜铬粒蛋白A)；DARRP(多巴胺和cAMP调节磷蛋白)；DAT(多 巴胺转运体)；GAD(谷氨酸脱羧酶)；GAP(生长相关蛋白)；抗HuC蛋白；抗HuD 蛋白；.α.-互联蛋白；NeuN(神经元特异性核蛋白)；NF(神经丝)；NGF(神经生长 因子)；.γ.-SE(神经元特异性烯醇化酶)；外周蛋白；PH8；PGP(蛋白质基因产物)； SERT(血清素转运体)；突触蛋白；Tau(神经原纤维缠结蛋白)；抗Thy-1；TRK(酪 氨酸激酶受体)；TRH(色氨酸羟化酶)；抗TUC蛋白；TH(酪氨酸羟化酶)；VRL(辣 椒素受体样蛋白)；VGAT(囊泡GABA转运体)、VGLUT(囊泡谷氨酸转运体)鉴定 神经元。

可根据功能标准测试通过诱导主题NSC分化生成的神经元。例如，可通过 任何标准技术，响应于神经递质或已知影响体内神经元的其它环境条件测量钙流 量。首先，按形态标准，或通过标志物例如NCAM鉴定群体中的神经元样细胞。 然后将所述神经递质或条件施加于所述细胞，并监测反应。还使所述细胞经受标 准膜片钳技术，以确定是否存在动作电位的证据，和外加电位与反应之间存在何 种滞后时间。主题NSC的分化可产生含有具有呈NCAM或MAP-2阳性的神经 元的形态特征并且对GABA、乙酰胆碱、ATP和高钠浓度、谷氨酸、甘氨酸、 抗坏血酸、多巴胺或去甲肾上腺素的一种或多种显示出反应的亚种群的培养物。 在一些实施方案中，主题分化NCAM或MAP-2阳性细胞还在膜片钳系统中展现 出动作电位。

多巴胺能神经元的标志物包括但不限于TUJ1、TH、Dat、Foxa2、Nurr-1、 Girk2、MAPT、SYT4、FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、 NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1或VMAT2 或其任何组合。

可通过表达星形细胞标志物GFAP(胶质纤维酸性蛋白)、S100.β.等鉴定星形 细胞。

可由主题诱导型NSC生成少突胶质细胞。可通过表达少突胶质细胞标志物 GC(半乳糖脑苷脂，也称为GalC)；MBP(髓磷脂碱性蛋白)；CNP酶(2',3'-环核苷 酸3'-磷酸二酯酶[或-磷酸水解酶])；或少突胶质细胞标志物神经内分泌特异性蛋 白-4(NSP4；也称为浆膜蛋白-4(reticulon-4)或RTN4)、RIP(2',3'-环核苷酸3'-磷酸 二酯酶)、髓磷脂/少突胶质细胞特异性蛋白(MOSP)、少突胶质细胞谱系转录因子 2(Olig2)、少突胶质细胞标志物O1、NogoA或少突胶质细胞标志物O4鉴定少突 胶质细胞。

本发明提供了由NSC分化DA神经元的高通量筛选测定。

在另一实施方案中，本发明提供了一种生成多巴胺能神经元的方法。所述方 法包括用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能 干细胞(hPSC)，通过测定经处理hPSC的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞，用 至少一种多巴胺能神经元诱导化合物处理NSC并且分析细胞的多巴胺能神经元 细胞标志物。在某些方面，CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为 Dorsomorphin、LD-193189或DMH-1。在一个优选方面，CK1抑制剂为SB218078 而BMP抑制剂为DMH-1。

一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导型 多能干细胞(iPSC)或由其衍生的细胞系。

在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、 CXCR4、DCX、FABP7、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、 巢蛋白、OTX2、PAX6、TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5或其 任何组合。

在所述方法的另一方面，多巴胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、L- 半胱亚磺酸、犬尿喹啉酸、(R)-(+)-HA-966、间氯苯基双胍盐酸盐、钙蛋白酶抑 制剂、Dimaprit二盐酸盐、8-羟基-DPAT-氢溴酸盐、反式-4-羟基巴豆酸、盐酸法 舒地尔、噻普酰胺、视黄酸、AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI 215,001盐 酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺哌隆、肯泡隆、CL 218872、CV 1808、Ro 15-4513、 二盐酸利诺吡啶、没药甾酮、Ch 55、3-MATIDA、SEW 2871、Immethridine二 氢溴酸盐、LY 364947、反苯环丙胺盐酸盐、(-)-野靛碱或尼鲁米特或其任何组合。 在一个优选方面，多巴胺能神经元诱导化合物为没药甾酮。

在所述方法的另一方面，多巴胺能神经元细胞标志物可能为TUJ1、TH、Dat、 Foxa2、Nurr-1、Girk2、MAPT、SYT4、FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、 LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、 PITX1或VMAT2或其任何组合。

再一实施方案中，本发明提供多巴胺能神经元。通过用检测点激酶1(CK1) 抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)，通过测定经处 理hPSC的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞，用至少一种多巴胺能神经元诱导 化合物处理NSC并且分析细胞的多巴胺能神经元细胞标志物生成主题DA神经 元。在某些方面，CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomorphin、 LD-193189或DMH-1。在一个优选方面，CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制 剂为DMH-1。

一方面，hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导型 多能干细胞(iPSC)或由其衍生的细胞系。

在所述方法的一方面，神经干细胞标志物可能为BRN2、CD113、CD15、 CXCR4、DCX、FABP7、FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、 巢蛋白、OTX2、PAX6、TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5或其 任何组合。

在所述方法的另一方面，多巴胺能神经元诱导化合物可能为高奎宁酸、L- 半胱亚磺酸、犬尿喹啉酸、(R)-(+)-HA-966、间氯苯基双胍盐酸盐、钙蛋白酶抑 制剂、Dimaprit二盐酸盐、8-羟基-DPAT-氢溴酸盐、反式-4-羟基巴豆酸、盐酸法 舒地尔、噻普酰胺、视黄酸、AM580、TTNPB、盐酸瑞莫比利、ICI 215,001盐 酸盐、盐酸咪洛克生、盐酸螺哌隆、肯泡隆、CL 218872、CV 1808、Ro 15-4513、 二盐酸利诺吡啶、没药甾酮、Ch 55、3-MATIDA、SEW 2871、Immethridine二 氢溴酸盐、LY 364947、反苯环丙胺盐酸盐、(-)-野靛碱或尼鲁米特或其任何组合。 在一个优选方面，多巴胺能神经元诱导化合物为没药甾酮。

在所述方法的另一方面，多巴胺能神经元细胞标志物可能为TUJ1、TH、Dat、 Foxa2、Nurr-1、Girk2、MAPT、SYT4、FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、 LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、 PITX1或VMAT2或其任何组合。

如实施例中所示，公开的方法导致全功能性多巴胺能神经元生成。DA神经 元显示出神经突生长和多巴胺释放(图6A)。没药甾酮(GS)经鉴定为多巴胺能分化 的最佳诱导剂之一(图6A)。经GS处理的细胞显示出神经突延伸并且表达TUJ1、 TH、Dat、Foxa2、Nurr-1和Girk2(图6B)、MAPT、FOXA2、SYT4、FOXA1、 DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR1、LMX1A、EN1、 GIRK2、DDC和VMAT2(图6B、6D和6E)。此外，FACS分析显示超过97％的 门控细胞为TH阳性(图6C)。SYT4(突触结合蛋白4)在突触可塑性和多巴胺释放 中起重要作用。ASCL1在腹侧中脑表达并且表明衍生细胞具有适当表现型。全 细胞膜片钳电生理学(图6G、图6H和图6I)显示，DA神经元在电压钳模式中显 示出内向Na+电流(图6H)，并且在电流钳模式中注入电流时显示出放电动作电 位(图6I)。这证明使用公开方法由hPSC生成了全功能性多巴胺能神经元。

NSC可能在神经疾病和病症的治疗中起重要作用。神经变性是神经元结构 或功能逐渐丧失，包括神经元死亡的涵盖性术语。由于神经变性过程发生许多神 经变性疾病，包括帕金森氏症、阿尔茨海默病(Alzheimer’s)和亨廷顿氏病 (Huntington’s)并且特征在于进行性神经系统功能障碍。神经疾病和病症包括但不 限于阿尔茨海默病和其它痴呆、脑癌、神经退行性疾病、脑炎、癫痫、遗传性大 脑紊乱、头和脑部畸形、脑积水、中风、帕金森氏症、多发性硬化、肌萎缩侧索 硬化(ALS或路格里克氏病(Lou Gehrig's Disease))、亨廷顿氏病、朊病毒病、中风 等。

已经证实神经干细胞参与了垂死神经元的迁移和替换。另外，已经阐明了小 鼠中风期间海马干细胞的作用。这些结果证明由于损伤，NSC可加入成人脑部。 此外，已经证明NSC以定向方式迁移到脑部肿瘤中。进一步地，已经研究了NSC 对损伤反应的分子机制。损伤期间释放的趋化因子，例如SDF-1a，负责人和小 鼠NSC向小鼠损伤区域的定向迁移。寻找另外在损伤环境下起作用的机制和在 急慢性疾病期间它们如何影响NSC的反应是研究热点。

另一实施方案中，本发明提供了治疗神经疾病和病症的方法。所述方法包括 向有神经疾病或病症的受试者施用NSC。

再一实施方案中，本发明提供了治疗神经疾病和病症的方法。所述方法包括 向有神经疾病或病症的受试者施用NSC或DA神经元。

另一实施方案中，本发明提供了用于生成NSC的试剂盒。所述试剂盒可包 括检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、鉴定神经干细胞标 志物的试剂和由hPSC生成NSC的说明书。一方面，CK1抑制剂为SB218078 而BMP抑制剂为Dorsomorphin、LD-193189或DMH-1。在某些方面，CK1抑 制剂为SB218078而BMP抑制剂为Dorsomorphin；CK1抑制剂为SB218078而 BMP抑制剂为LD-193189；CK1抑制剂为SB218078而BMP抑制剂为DMH-1。 所述试剂盒可包括鉴定BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、FOXA2、 FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋白、OTX2、PAX6、TUBB3、 SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5神经干细胞标志物的试剂。

另一实施方案中，本发明提供了用于生成多巴胺能神经元的试剂盒。所述试 剂盒包括检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、鉴定神经干 细胞标志物的试剂、至少一种多巴胺能神经元诱导化合物、鉴定多巴胺能神经元 细胞标志物的试剂和由hPSC生成多巴胺能神经元的说明书。一方面，CK1抑制 剂为SB218078，BMP抑制剂为DMH-1并且多巴胺能神经元诱导化合物为没药 甾酮。所述试剂盒可包括鉴定BRN2、CD113、CD15、CXCR4、DCX、FABP7、 FOXA2、FOXO4、GFAP、LMX1A、Musashi-1、MAP2、巢蛋白、OTX2、PAX6、 TUBB3、SOX1、SOX2、SOX3或ST6GALNAC5神经干细胞标志物的试剂。所 述试剂盒还可包括鉴定TUJ1、TH、Dat、Foxa2、Nurr-1、Girk2、MAPT、SYT4、 FOXA1、DDC、ASCL1、PINK1、PAX5、LMX1B、PITX3、NURR-1、LMX1A、 EN1、PAX2、TFF3、PITX2、DCX、MAP2、PITX1或VMAT2多巴胺能神经元 细胞标志物的试剂。

下列实施例旨在说明，而非限制本发明。

实施例1

hPSC的生长

使用高通量筛选策略鉴定了两种有效的神经诱导剂，SB218078和DMH-1(图 5A)。SB218078是stauprimide的结构同系物，已经证实其使胚胎干细胞对分化 初免，并且DMH-1是dorsomorphin的同系物，其有效诱导hPSC中的神经转换。 为衍生NSC，通过将基质胶上生长的hPSC从StemPro转移到补充了5μM  SB218078和1μM DMH-1的N2B27培养基中诱导初生神经上皮。在这些神经诱 导剂的存在下6天后，Pax6，一种神经诱导的早期标志物明显上调(图3和5B)。 第7天，将中和hPSC转移到NSC培养基中，然后分离以衍生增生NSC。4次 传代后，hPSC衍生的NSC(hPSC-NSC)群体98％对巢蛋白呈阳性，96％对 Musashi-1呈阳性，95％对PAX6呈阳性，0％对OCT4呈阳性(图5C和图5D)。 基因表达微阵列分析显示假定的NSC标志物，包括FABP7、BRN2、SOX3、 ST6GALNAC5、CXCR4、DCX、NES和MSI上调(图5E)。FABP7编码CNS发 育所牵涉的脑脂肪酸结合蛋白并且在NSC中高度表达。ST6GALNAC5编码介导 细胞通过血脑屏障的通道的α2,6-唾液酸转移酶。实时PCR(RT-PCR)数据进一步 确认了NSC标志物的上调，并且最重要的是，显示多能性标志物OCT-4和 NANOG完全下调(图5F)，得出的结论是已经获得了神经干细胞的高度富集群体。 这些NSC适于进一步扩增、冷藏和分化，使其成为DA神经元的实用来源。

具体地，首先将hPSC系[人胚胎干细胞系WA-09和人孤雌生殖干细胞系L LC2P和LLC12PH(国际干细胞公司)]维持在胚胎干细胞培养基的丝裂霉素-C灭 活小鼠胚胎成纤维细胞(Millipore)饲养层上：敲除DMEM/F12(Life Technologie s)、2mM L-谷氨酰胺(GlutaMax-I,Invitrogen)、0.1mM MEM非必需氨基酸(Life  Technology)、0.1mMβ-巯基乙醇(Life Technologies)、青霉素/链霉素/两性霉素 B(100U/100μg/250ng)(MP Biomedicals)和5ng/ml bFGF(Peprotech)。每5-7天 按1:4或1:6的分流比，用分散酶(dispase)(Life Technologies)使细胞传代。然后 将hPSC转移到基质胶(BD Biosciences)涂层板上并用Stem Pro hESC SFM培养 基(Invitrogen)生长：具有GlutaMAX、1X STEMPRO hESC SFM生长补充物、1. 8％牛血清白蛋白、8ng/mL bFGF和0.1mM 2-巯基乙醇的DMEM/F12。

实施例2

hPSC的无饲养层生长

然后将hPSC系LLC12PH转移到基质胶(BD Biosciences)涂层板上并用Stem  Pro hESC SFM培养基(Invitrogen)生长：具有GlutaMAX、1X STEMPRO hESC  SFM生长补充物、1.8％牛血清白蛋白、8ng/mL bFGF和0.1mM 2-巯基乙醇的 DMEM/F12。

实施例3

高通量神经诱导hPSC筛选测定

通过用于N2B27培养基[敲除DMEM/F12、1X GlutaMax、1X N2/B27补充 物(Invitrogen)]中由SB218078(5μM)加上DMH-1(1μM)组成的化学组合处理在无 饲养层培养条件下生长的未分化hPSC7天，衍生hPSC-NSC。然后用 Accutase(Sigma)分离中和hPSC并且在基质胶涂层板上于NSC培养基中[敲除 DMEM/F12、2％StemPro神经补充物、1X GlutaMAX、20ng/ml bFGF和20ng/ml  EGF]生长≥4代以生成并高纯度且同源的hPSC-NSC群体。

实施例4

高通量多巴胺神经元细胞分化筛选测定

为获得DA神经元，首先用100ng/mL FGF8和2μM嘌吗啡胺(Purmorphamine) 经7天将hPSC-NSC初免为DA前体，然后用于筛选诱导终末多巴胺能分化的小 分子(图6A)。按96孔板2000个细胞/孔接种DA前体并且按2.5μM用小分子库 (Tocris 1120生物活性化合物)处理2周(图6A)。通过神经突生长测定多巴胺能分 化并且通过ELISA分析测定多巴胺释放(图6A)。从这种筛选，在多巴胺能分化 最佳诱导剂中鉴定了天然存在的类固醇，没药甾酮(GS)(图6A)。分化30天后， 经GS处理的神经元看起来精细的神经突延伸成熟。在这个阶段，衍生化细胞不 但表达主要神经元标志物β-III-微管蛋白(TUJ1)，而且表达重要的DA神经元标 志物酷氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体(Dat)、Foxa2、Nurr-1和Girk2(图6B)。 此外，FACS分析显示97％以上的门控细胞为TH阳性(图6C)。基因表达微阵列 分析指出多巴胺能和神经元相关标志物例如MAPT、FOXA2、SYT4、FOXA1、 DDC、ASCL1和PINK1上调(图6D)。SYT4(突触结合蛋白4)在突触可塑性和多 巴胺释放中起重要作用。ASCL1在腹侧中脑表达并且表明衍生细胞具有适当表 现型。对来自黑质的hPSC、NSC、DA神经元和组织的基因表达的进一步分析 显示hPSC衍生的DA神经元已获得具有经历朝向SN中存在的细胞的神经分化 特有的基因表达特征的元件，并且它们在NSC之后和SN期之前发育定位。 RT-PCR用标志物例如PAX5、LMX1B、PITX3、NURR1、LMX1A、EN1、GIRK2、 DDC和VMAT2的特征表达进一步确认了DA神经元一致性(图6E)。最重要的 是，与对照细胞(用FGF8和嘌吗啡胺处理1周并用0.1％DMSO代替GS处理2 周的NSC)相比，通过ELISA测定，经GS处理的细胞展现出多巴胺分泌增加5 倍(图6F)。全细胞膜片钳电生理学(图6G、图6H和图6I)显示，在GS处理90 天后，DA神经元在电压钳模式中显示出内向Na+电流(图6H)，并且在电流钳模 式中注入电流时显示出放电动作电位(图6I)。使用微电极阵列(MEA)系统在经 GS处理的神经元的完全培养物中记录到自发性动作电位(图6J)。MEA培养皿中 总共64个电极的约三分之一显示出中等活性(>5个峰/min)。这些神经元的特征 在于两个基本放电表现型：周期性波峰爆发放电的表现型和定期单峰放电的表现 型(图6J和6K)。

所述方法具体牵涉在NB培养基[NeuroBasal培养基、1X GlutaMAX、1X  N2/B27补充物(Invitrogen)]中用嘌吗啡胺(2μM)和FGF8(100ng/mL)将 hESC-H9-NSC(Invitrogen)和hPSC-NSC处理7天。在嘌吗啡胺和FGF8处理7天 后，用Accutase(Sigma)分离NSC并且按20,000个细胞/mL接种到基质胶涂层96 孔板上并按2.5μM最终浓度用小分子库(Torcris 1120生物活性化合物)处理两周 (图6A)。用小分子处理两周后，在视觉上观察所有孔并基于神经突密度评分。 用小分子处理两周后，在视觉上观察所有孔并基于神经突密和多巴胺释放评分。 为测量神经突密度，用4％多聚甲醛固定细胞并且使用Cellavista细胞成像系统 (Roche Applied Science)从随机选取的视野获得相衬图像。使用Cellavista密度软 件图像处理程序测量神经突密度。每种实验条件在两个孔中进行，并且进行至少 3次独立实验以获得最终结果。

收集来自上部神经突诱导剂(表1)的条件培养基(与0.1％DMSO处理的对照 相比，含有高密度神经突的孔)并且使用多巴胺ELISA测定(Cosmo Bio)分析。从 每孔含有50,000个细胞的样品收集条件培养基并且在3000RPM下离心以去除细 胞碎片。然后收集上清液并分析，以使用商业多巴胺ELISA测定试剂盒 (CusaCosmo Bio)进行多巴胺的定量测定。使用微量滴定板酶标仪(BIO-TEK  Synergy 2)进行数据分析。呈现的结果来自于三个独立实验(n＝3)并且表示为平均 数±平均数标准误差(s.e.m.)并且使用双尾学生t检验进行统计分析，置信水平为 95％(α＝0.05)，统计显著性为P<0.05。另外，收集来自每个孔的总RNA并通过 RT-PCR分析来自hPSC-NSC的TuJ1、MAP2、TH、GRK2、EN1、DAT、AADC、 PAX2、NURR1、PITX3和LMX1B的表达(表2)。RT-PCR数据分析表明，处理 两周后，所有最佳命中表达与成熟多巴胺神经元相关的基因。ELISA数据分析表 明上部小分子神经突诱导剂生成比对照非处理细胞更高水平的多巴胺 (1.5ng/mL)。没药甾酮处理的hPSC-NSC诱导最高水平的多巴胺自发性释放(图 5A)。通过用肯泡隆(33％)、没药甾酮(35％)、犬尿喹啉酸(19％)、Immethridine二 氢溴酸盐(21％)和Dimaprit二盐酸盐(18％)化学处理产生的TH阳性细胞的百分比 高于从使用标准多巴胺能分化培养基(BDNF 20ng/mL、GDNF 20ng/mL、cAMP 200μM、抗坏血酸200μM、TGFβ3 2ng/mL和DAPT)分化≥1个月的hPSC-NSC 获得的TH阳性细胞的15％。

全细胞膜片钳电生理学法。对于电生理记录，将细胞转移到固定在倒置 Olympus显微镜上的记录槽中。记录期间，将温度维持在31-32℃，并且在pH 7.30 和315mOsm下按1ml/min.恒定流量，用150mM NaCl、4mM KCl、1.8mM CaCl₂、 1mM MgCl₂、10mM HEPES、10mM葡萄糖灌注细胞。在pH 7.30和290mOsm 下使用尖端电阻为2-3MΩ，填充了130mM K-葡糖酸、5mM NaCl、5mM KCl、 10mM HEPES、20mM蔗糖、0.3mM EGTA、3mM MgATP的硼硅酸盐电极获得 全细胞记录。使用HEKA EPC-10数字转换器/放大器获得数据。一旦实现全细胞 进入，就立即记录静止膜电位；然后使细胞平衡3-5min。然后从-70mV的静止 膜电位，在电流钳模式下经200ms电流注入使细胞去极化，在0.2Hz.下输送，并 且幅度从50pA增加到高达1000pA以诱导动作电位。通过施加电压斜升测定内 向或外向电流的存在。将记录配置不稳定或串联电阻变得大于15MΩ的细胞从 研究中排除。记录了二十个不同的细胞并且从7个膜片钳细胞获得动作电位。

微阵列分析方法。根据生产商的方案从重复样品团粒(RNeasy；Qiagen)提取 并收集总RNA。进一步加工之前对每个样品确定RNA量(Qubit RNA BR测定试 剂盒；Invitrogen)和质量(RNA6000 Nano试剂盒；Agilent)为最佳。使用Illumina  Total Prep RNA扩增试剂盒根据生产商的方案扩增每份样品200ng RNA并且如 以上量化。使每份样品750ng生物素化RNA与Illumina HT-12v4表达微珠芯片 杂交，用Illumina iScan微珠阵列扫描仪扫描并且在GenomeStudio和lumi生物 导体包中控制质量。所有RNA加工和微阵列杂交均根据生产商的方案进行。在 GenomeStudio中，过滤在至少一份样品中检测出P值为0.01的探针并且输出用 于在R中标准化。转化原始探针表达值并且使用lumi R/生物导体包中执行的鲁 棒样条标准化法(robust spline normalization)(RSN)标准化。为获得维恩图(Venn  Diagram)，使用Qlucore Omni Explorer。使用双尾学生t检验鉴定在成对细胞类 型之间差异性表达的转录产物(hPSC与黑质、hPSC与NSC和hPSC与多巴胺能 神经元)，P值截断值<0.05而方差截断值>0.005。然后将差异性表达探针组相互 比较。基因表达阵列数据在NCBI GEO数据库中，在存取指定号GSE42265下可 用。

统计分析。结果表示为平均数±平均数标准误差(s.e.m.)并且使用95％置信水 平(α＝0.05)进行统计分析，用双尾学生t检验比较两个组或用Dunnett检验的单 因素ANOVA将多个组与对照比较。对于所有试验而言统计显著性的标准为 P<0.05。

另外的方法

RT-PCR分析

使用QIAsymphony自动纯化系统或RNeasy Plus Mini试剂盒，根据生产商 的说明(Qiagen)分离来自各具约1百万个细胞的至少三份样品的总RNA。总RNA 用于用iScript cDNA合成试剂盒(Biorad)和Px2热循环仪(Thermo Scientific)反转 录。为分析基因表达，每次反应使用1/25的cDNA和QuantiTect引物测定与 Quantitest SYBR绿色混合液(Qiagen)进行PCR反应，一式两份。在95℃下使用 Rotor-Gene Q(Qiagen)进行qPCR，5min，在92℃下进行5s并且在60℃下进行 20s，循环37次，接着融解以检查从50到99℃，每个步骤升高1℃，扩增子的 特异性。对标准曲线进行相对定量并且对通过PPIG测定的输入标准化量化值。 在补充表S1中列出了用于分析的引物。结果表示为平均数±s.e.m.并且使用95％ 的置信水平(α＝0.05)进行统计分析，用双尾学生t检验比较两个组或用Dunnett 检验的单因素ANOVA将多个组与对照比较并且将P<0.05视为显著。

免疫细胞化学

在室温下将每份样品大约100,000个细胞用4％多聚甲醛固定10min，用PBS 洗涤，并且在室温下在于PBS中的0.3％Triton X-100、5％常规驴血清和1％BSA 中透性化和封闭1小时。在4℃下在于PBS中的0.3％Triton X-100、2％BSA中 用一级抗体孵育细胞整夜。用PBS洗涤细胞三次并且在室温下在于PBS中的 0.3％Triton X-100、5％常规驴血清和1％BSA中用二级抗体孵育1小时。用DAPI 为细胞核染色。在补充表S2中列出使用的所有抗体。显示来自至少三次独立实 验的代表性图像。

流式细胞术

对于流式细胞术分析，用Accutase收获每份样品1百万个细胞，用PBS洗 涤并且在室温下用4％多聚甲醛固定30min。用PBS洗涤细胞两次并且在室温下 用于PBS中的0.3％Triton X-100、5％常规驴血清和1％BSA封闭1小时。然后 在4℃下在于PBS中的0.3％Triton X-100、5％常规驴血清和1％BSA中用一级 抗体孵育细胞整夜。用PBS洗涤细胞两次并且在室温下在于PBS中的.3％Triton X-100、5％常规驴血清和1％BSA中用二级抗体孵育1小时。使样品在Becton  Dickinison FACSCalibur^TM4色流式细胞仪上运行并且用CellQuest Pro^TM软件 (v6.0)分析数据。在补充表S2中列出使用的所有抗体。显示来自三次独立实验的 代表性结果。

微电极阵列(MEA)系统

在分化第95天，在37℃下使用Muse微电极阵列(MEA)系统(Axion  Biosystems)在补充了2.5μM没药甾酮的NB培养基[NeuroBasal培养基、1X GlutaMAX、1X N2/B27补充物(Invitrogen)]中进行来自培养的hPSC衍生DA神 经元的细胞外电压记录。MEA培养皿表面在由极间间距为200μm的纳米多孔铂 构成的细胞外电极周围含有直径为30μm的8×8个格栅(总共64个电极)。

通过在无菌去离子水中冲洗3次，在70％乙醇中冲洗1次和在100％乙醇中 冲洗1次为MEA培养皿灭菌。然后为培养皿加盖并且倒置于加盖培养皿(petri  dish)中，并且在50℃下烘烤4-5小时。通过向每个培养皿添加500ml于硼酸钠 缓冲液(15mM；pH 8.4)中的过滤(0.22μm过滤器)0.1％PEI并且在室温下孵育1 小时沉积聚乙烯亚胺(PEI)基底涂层。吸入PEI溶液后立即用1ml去离子水洗涤 培养皿4×，并且在组织培养罩内风干整夜。直接在电极栅上添加75μl的1:30稀 释于敲除DMEM/F12中的无菌基质胶溶液，并且在37℃下在组织培养箱中孵育 1小时。然后去除基质胶溶液并且将50μl于含有约100,000个细胞的NB培养基 中的2.5μM没药甾酮涂到MEA表面并且在37℃下孵育30min以使细胞附着。 先前已经在于NB培养基中的2.5μM没药甾酮中，在基质胶上培养了DA神经元 65天并且通过机械研磨从板上移除。孵育30min后，向MEA孔内添加550μl的 NB培养基并且在37℃下孵育24小时。更换培养基，此后每3-4天更换一次。

同时在所有电极上，在12.5kHz下以200-5000Hz硬件滤波器带宽对电压数 据取样，并且保存到具有AxIS软件(Axion Biosystems)的计算机上。为了在神经 元峰值检测之前去除高频电噪声，在软件中用200-2500Hz单阶Butterworth带通 滤波器处理原始信号。用设为基线电噪声标准偏差的±5倍的检测阈值鉴定动作 电位峰值。该阈值通常等于7.5-11.25μV。用AxIS制作彩色编码峰值率图。对于 峰值光栅图和峰峰间隔直方图而言，向Neuroexplorer(NEX Technologies)输出受 检峰值的时间标记。进行两次独立记录。

表1

表2

虽然已经参考以上实施例描述了本发明，但是应理解修改和变化涵盖在本发 明的精神和范围内。因此，本发明仅受下列权利要求限制。