一种高纯度盐酸万古霉素的分离纯化方法

摘要

本发明提供了一种高纯度盐酸万古霉素的分离纯化方法，所述方法包括下列步骤：（1）万古霉素粗品通过离子交换层析法得到盐酸万古霉素溶液，并通过纳滤脱盐浓缩得到浓缩液；（2）先用盐酸溶液调节浓缩液，再将调节后的浓缩液通过反相色谱层析柱进行柱层析；（3）收集万古霉素B的层析液以得到混合层析液；（4）用盐酸调节混合层析液，然后经过纳滤浓缩脱除溶剂和盐，以得到浓缩液；（5）进行脱水干燥步骤（4）的浓缩液，或者通过溶剂结晶或盐析法结晶以得到色谱纯度达到99%，外观纯白的盐酸万古霉素粉。本发明的方法不仅提高了产品品质，而且适合于扩大的商业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高纯度盐酸万古霉素的分离纯化方法。该方法以 色谱纯度为90%左右的万古霉素粗品为原料，首先通过以含盐-水为 流动相的葡聚糖凝胶柱进行层析，收集色谱纯度大于95%的盐酸万古 霉素并进行纳滤脱盐浓缩至100mg/ml-200mg/ml，然后经过反相C18 硅胶色谱柱或反相聚合物色谱柱，用含铵盐的甲醇水溶液或乙醇水溶 液作为流动相进行洗脱，收集色谱纯度大于98.5%的盐酸万古霉素， 再通过纳滤脱去溶剂，然后浓缩至150mg/ml-250mg/ml进行冷冻干 燥，得到色谱纯度达到99%，外观纯白的盐酸万古霉素。

背景技术

盐酸万古霉素是放线菌属东方拟无枝酸菌在控制发酵条件下产 生的一种两性糖肽类抗生素，其化学式为C₆₆H₇₅C_l2N₉O₂₄·HCl，分子 量为1.486。已知盐酸万古霉素与黏肽的前质末端D-Ala-D-Ala结合， 抑制细菌细胞壁的合成。此外，盐酸万古霉素还可以改变细胞膜的渗 透性和RNA的合成。盐酸万古霉素特别用于由抗β-乳胺抗生素的葡 萄球菌引起的严重或重症感染的初步治疗，也用于治疗对青霉素过敏 或使用青霉素和头孢菌素没有效果的患者。早期有文献报道认为盐酸 万古霉素有严重的肾、耳毒性，故在临床上未被广泛使用，但近来由 于抗生素的大量使用，导致临床上耐甲氧西林金葡菌（MASA）感染 病例日益增多，使得盐酸万古霉素的使用量逐年增长。因此，降低盐 酸万古霉素的使用毒性，增加用药的安全性变得非常重要，而其中提 高药用盐酸万古霉素的纯度是其中的一种有效的手段。近年来，随着 科学技术的不断发展，技术人员不断的提高了盐酸万古霉素的纯度， 过去认为盐酸万古霉素所具有的严重的肾、耳毒性在不断的减少。基 于以上原因，开发一种更高纯度、简易可行、适于工业化生产的盐酸 万古霉素精制工艺有着十分重要的意义。

万古霉素分子由两个基本结构组成，即糖基部分 α-o-vancosamine-β-o-glucosyl和肽基部分中心七肽核，其结构决定了 它的不稳定性，万古霉素分子在酸碱或高温条件下会降解产生降解产 物，同时结构还带有多个游离酚羟基，导致其易氧化成醌式。已有文 献报道了，万古霉素在酸性条件和高温条件下会发生水解，脱去一个 糖基或二个糖基生成单糖万古霉素或无糖万古霉素（desvancosaminyl  vancomycin and aglucovancomycin），在弱酸环境下，也可能脱去一 个酰胺基降解成去氨基万古霉素，它有两个异构体。基于万古霉素化 学结构的这些特点，给制造高纯度盐酸万古霉素带来了一定的困难。

盐酸万古霉素产品开发已有几十年的历史，早期的制备工艺普遍 采用如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等溶剂进行结晶，也有通过加入氯 化铵或氯化钠进行盐析法沉淀的方式制备成品，但由于万古霉素发酵 液中存在较多的杂质，尤其是万古霉素结构类似物较多，使得纯度普 遍不高，要达到色谱纯度大于93%的欧洲药典标准有一定的难度。

近些年随着各种介质的色谱分离技术的发展，该技术在盐酸万古 霉素分离纯化上得到了广泛的应用。CN200710187300.5采用离子交 换填料葡聚糖凝胶Sephadex CM-25、琼脂糖SP Sepharose或琼脂糖 CM Sepharose进行色谱层析，流动相为4-6%的碳酸氢铵，得到色谱 纯度大于95%，小于98%的盐酸万古霉素，再通过加入氯化钠溶液进 行盐析沉淀，分离并用乙醇顶洗，烘干得到盐酸万古霉素成品。该工 艺能得到纯度较高的盐酸万古霉素霉素，回收率不高，另外离子交换 色谱方法对于去除色素不太理想，因此该工艺产品在外观颜色和溶液 吸光度上不是十分理想。

专利WO2006061166中的实例采用粒径5um的反相硅胶 （Octadecyl silica gel）作为色谱介质，含5mM醋酸铵且pH调节为 4.0的3%甲醇溶液作为流动相，在流动相中加入2%的戊醇作为解析 剂，收集色谱纯度大于97.5%的盐酸万古霉素，然后通过真空浓缩收 集液浓度至140mg/ml，加入甲醇，用氨水调节pH8.5-9.0，冷却料液 温度至0度，分离沉淀物，并用甲醇顶洗，将分离物用水溶解并调节 pH至3.2，然后用异丙醇进行结晶，真空烘干，最终得到纯度达到 97-99.3%的盐酸万古霉素成品。该专利所涉及的工艺存在一些缺陷， 尤其对于商业化扩大生产有一定的难度，首先，该方法中流动相和洗 脱剂使用了不同溶剂，对于溶剂回收存在一定的困难；其次，由于该 工艺通过反相纯化，色谱纯度并不能一次性达到99%以上，因此需要 有两步溶剂结晶操作，最后通过真空干燥获得成品，而溶剂结晶存在 的普遍问题是残留溶剂不能有效去除，达不到ICH对残留溶剂的要 求；最后，该方法由于步骤较多，在产品收率上并不理想。

因此，从目前的文献资料看，由于存在种种的缺陷，市面上还没 有一种制备高纯度（色谱纯度达到99%以上）的适用于商业化生产的 盐酸万古霉素生产方法，而鉴于盐酸万古霉素用药安全性，需要一种 制备高纯度盐酸万古霉素的方法。

发明内容

本发明提供了一种高纯度（色谱纯度达到99%以上）、低杂质、 高效率的适用于商业化生产的盐酸万古霉素的分离纯化方法，所述分 离纯化方法包括如下步骤：（1）万古霉素粗品通过离子色谱交换层析 法制备得到盐酸万古霉素溶液，并通过纳滤脱盐浓缩，得到第一盐酸 万古霉素浓缩液；（2）用盐酸溶液调节第一盐酸万古霉素浓缩液 pH=3.5-4.5，再将调节后的第一盐酸万古霉素浓缩液通过反相色谱层 析柱进行柱层析，其中，固定相为C18硅胶或聚苯乙烯聚合物，流动 相为含有铵盐的甲醇水溶液或乙醇水溶液；（3）收集万古霉素B含量 大于98.5%的层析液；（4）用盐酸调节上述层析液pH=2.5-3.5，再用 纳滤浓缩脱除溶剂和盐，以得到第二盐酸万古霉素浓缩液；以及（5） 将步骤（4）的第二盐酸万古霉素浓缩液精制脱水以得到色谱纯度达 到99%，纯白的盐酸万古霉素粉。

优选地，步骤（1）中所述盐酸万古霉素溶液为通过离子交换色 谱层析法获得的万古霉素色谱纯度大于95%的盐酸万古霉素溶液。上 述制备万古霉素色谱纯度不低于95%的盐酸万古霉素溶液是通过如 下现有技术方法制得。（1）首先，按照中国专利CN01132048.6所述 的方法，采用发酵菌种为东方拟无枝酸（Amycolatopsis Oriertalis） SIPI43491，经过接种体的培养，接种至一级种子罐，经二级种子扩 大培养后，进入发酵罐培养，控制温度24-34℃，培养压力 0.01-0.08MPa，过程中控制溶解氧和pH，发酵周期为4-6天，得到万 古霉素发酵液。（2）其次，按照中国专利CN200710198599.4所述， 将万古霉素发酵液通过大孔吸附树脂，用含乙醇的酸性水溶液将万古 霉素洗脱，然后在洗脱液中加入活性炭脱色，在脱色液中加入碳酸氢 铵，并用氨水调节pH至7.5-8.5搅拌静置后分离得到色谱纯度不低于 80%的万古霉素粗品（该万古霉素粗品指的是步骤（1）中的万古霉 素粗品）。（3）万古霉素粗品在纯化水里溶解后用0.01～0.5μm孔径的 陶瓷膜过滤，获得澄清的万古霉素滤液。澄清万古霉素滤液经过离子 交换层析柱层析纯化得到万古霉素B含量95%以上的有效层析液 （即，万古霉素色谱纯度不低于95%的盐酸万古霉素溶液）。这里， 所说的离子交换层析柱所用填料阳离子交换葡聚糖凝胶（Sephadex） 或琼脂糖凝胶（Sepharose）。上柱的万古霉素滤液需在酸性条件下上 层析柱，在碱性条件下加入碱性金属盐或铵盐层析，一般我们采用 NH₄⁺盐和Na⁺盐，如NaCl、NH₄HCO₃、（NH₄）₂CO₃等；层析时收集 万古霉素B含量在93%以上的部分可以使混合有效层析液中万古霉 素B含量在95%以上。

该万古霉素色谱纯度不低于95%的有效层析液经过纳滤后得到 含盐酸万古霉素10-20%浓缩液（即，浓度为100mg/ml-200mg/ml）， 该浓缩液优选在2-8℃下保存。采用分子量为100-800Da的纳滤膜进 行钠滤。其中，所述浓缩的温度为≤20℃。

将上述浓缩液用4N盐酸溶液调节pH=3.5-4.5经过反相色谱柱优 选C18硅胶或反相聚合物填料，硅胶粒径优选为5μm-60μm，聚合物 如聚苯乙烯粒径优选为20μm-40μm。以甲醇或乙醇作为流动相并加 入铵盐作为调节pH的缓冲剂，优选用盐酸或醋酸将调节pH=3.5-5.5， 这里优选的铵盐主要为氯化铵或醋酸铵进行等度梯度洗脱，其中，在 含有铵盐的甲醇水溶液或乙醇水溶液中所述铵盐的浓度在 0.1%-1wt%。收集万古霉素B含量在98.5%以上的部分，并使得混合 洗脱液中万古霉素B组分含量在99%以上。

将混合洗脱液用4N的盐酸进行酸化调节pH=2.5-3.5，然后经过 纳滤脱除溶剂和盐，优选地，采用分子量为100-800Da的纳滤膜进行 钠滤。其中，所述浓缩的温度为≤20℃。再浓缩得到含盐酸万古霉素 15-25%浓缩液，放入冷冻干燥机或喷雾干燥机进行精制脱水（其中， 精制脱水的方法为冷冻干燥、或喷雾干燥法、盐析结晶法或溶剂结晶 法，所述精制脱水的方法属于常规现有技术）干燥得到盐酸万古霉素 粉的色谱纯度大于99%，该盐酸万古霉素粉在10%浓度，波长450nm 下，吸光度小于0.02，白度大于88%。

本发明的制备方法相比以往的专利有如下优势：通过离子交换层 析和反相硅胶色谱层析，使得最终的盐酸万古霉素纯度大于99%，产 品颜色外观得到了很大的提升；本方法仅通过离子交换和反相两部层 析即可达到万古霉素含量大于99%的目标，方法简易；本方法采用铵 盐、乙醇或甲醇作为反相色谱的流动相，与以往专利相比，更易于后 续的处理和溶剂的回收，可以通过纳滤膜简单的进行浓缩处理，操作 方便；因此该工艺不仅提高了产品品质，而且适合于扩大的商业化生 产。

附图说明

图1表示实施例1中万古霉素粗品色谱图，万古霉素B含量 90.2%；

图2表示实施例1中盐酸万古霉素浓缩液色谱图，万古霉素B 含量95.3%；

图3表示实施例2中盐酸万古霉素成品色谱图，万古霉素B含量 99.1%；

图4表示实施例4-6盐酸万古霉素浓缩液色谱图，万古霉素B含 量95.8%；

图5表示实施例4中盐酸万古霉素成品色谱图，万古霉素B含量 99.0%；

图6表示实施例5中盐酸万古霉素成品色谱图，万古霉素B含量 99.2%；

图7表示实施例6中盐酸万古霉素成品色谱图，万古霉素B含量 99.0%；

图8表示实施例7-9盐酸万古霉素浓缩液色谱图，万古霉素B含 量95.9%；

图9表示实施例7盐酸万古霉素成品色谱图，万古霉素B含量 99.0%；

图10表示实施例8盐酸万古霉素成品色谱图，万古霉素B含量 99.2%；

图11表示实施例9盐酸万古霉素成品色谱图，万古霉素B含量 99.3%。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明 限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

通过以下实施例来对本发明作进一步具体说明，但并不仅限于以 下实施例和实施例中的工艺参数范围。

实施例1：制备万古霉素B含量不低于95%的盐酸万古霉素溶液

在烧杯中将万古霉素粗品250g溶于2.0L的纯化水中，搅拌充分， 待完全溶解后用孔径为0.2um的滤膜过滤，然后加水稀释，最后得到 盐酸万古霉素粗品溶解液3.0L，浓度为43.6mg/ml，色谱纯度为90.2%， 参见图1。

取上述盐酸万古霉素粗品溶解液3000ml，通过装有葡聚糖 Sephadex CM-25的8cm*60cm的玻璃层析柱，上柱量为层析柱体积 的4%左右，吸附方法为将上柱液和1/5的层析填料混合，然后将混 合液直接上柱，再用纯化水以1.5倍柱体积/小时的流速冲洗，洗涤6 倍柱体积后，用0.3%(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗，预洗流速为 1倍柱体积/小时，预洗体积为15-20倍柱体积，预洗结束时洗脱液中 万古霉素B含量大于90%以上，然后用5%（w/v）NH₄HCO₃水溶液 将万古霉素洗脱下来，分段收集，用HPLC检测万古霉素B的含量 大于95%的部分进行混合，然后用4N的盐酸调节pH=3.1，得到有效 洗脱液5600ml，浓度为18.6mg/ml，色谱纯度为96.5%，参见图2。

然后将上述有效洗脱液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱 盐和浓缩，其中加入5次纯化水，最后透出液电导率为1255μs/cm, 然后将料液浓缩以得到盐酸万古霉素浓缩液的浓度156mg/ml， pH=3.8，色谱纯度为95.3%（见图2），体积680ml，所述浓缩液在2-8℃ 下保存以备用。

实施例2：制备高纯度盐酸万古霉素成品

取例1中制备的浓缩液680ml，通过装有粒径为30μm的C18硅 胶填料的制备柱(15cm*30cm)，用盐酸调节pH=4.0，含0.2%的 NH₄Cl(W/V)和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim， 流速为5BV/h，然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速 为5BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收 集洗脱液，每2.5L收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古霉素 B含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液 12.5L，浓度为6.8mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至240mg/ml，体 积338ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品68.5g，收率为64.6%， 色谱纯度99.1%（见图3），10%溶液吸光度A_450nm=0.012。

实施例3：不同孔径纳滤膜浓缩效果对比

选取不同孔径的纳滤膜管，孔径分别为100Da、200Da、400Da 和800Da，过滤面积均为0.32m²，轮流安装在实验室小型纳滤膜设备 上（型号LNG-NF-101），取含10%盐酸万古霉素的浓缩液8000ml， 分成4份，先取其中一份进行纳滤浓缩，循环泵压力控制在10bar， 浓缩开始时取透析样进行效价检测，并记录透出流速，待浓缩至循环 液体积为1000ml时结束取透析样进行效价检测，并记录透出流速， 每次使用完后清洗设备，并更换下一根纳滤膜管，使用另一份浓缩液 进行试验。试验结果如下：

如上表，孔径不同的纳滤膜对于透析液效价影响不大，因此对于 浓缩盐酸万古霉素都适用，但不同孔径的膜管对于流速有影响，孔径 大于200Da的膜管流速较为合适。

实施例4：不同粒径C18硅胶对比

取浓缩液330ml，浓度150mg/ml，色谱纯度95.8%（见图4）， 用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH=4.0，通过装有粒径为5μm的C18硅 胶填料的制备柱(15cm*30cm)，用盐酸调节pH=4.0，含0.1%的 NH₄Cl(W/V)和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim， 流速为5BV/h，然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速 为5BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收 集洗脱液，每2.5L收集一瓶，共收集约8瓶，检测每瓶的万古霉素B 含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液10L， 浓度为3.8mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至150mg/ml，体 积248ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品30.8g，收率为62.2%， 色谱纯度99.0%（见图5），10%溶液吸光度A=0.014。

实施例5：不同粒径C18硅胶对比

取浓缩液330ml，浓度150mg/ml，色谱纯度95.8%，用盐酸或氢 氧化钠溶液调节pH=4.0，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的 制备柱(15cm*30cm)，用盐酸调节pH=4.0，含0.1%的NH₄Cl(W/V)和 8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为5BV/h， 然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为5BV/h，在线 检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集洗脱液，每2.5L 收集一瓶，共收集约8瓶，检测每瓶的万古霉素B含量情况，色谱纯 度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液10L，浓度为4.1mg/ml， 用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至150mg/ml，体 积265ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品32.5g，色谱纯度99.2% （见图6），收率65.6%，10%溶液吸光度A=0.015。

实施例6：不同粒径C18硅胶对比

取浓缩液330ml，浓度150mg/ml，色谱纯度95.8%，用盐酸或氢 氧化钠溶液调节pH=4.0，通过装有粒径为60μm的C18硅胶填料的 制备柱(15cm*30cm)，用盐酸调节pH=4.0，含0.1%的NH₄Cl(W/V)和 8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为5BV/h， 然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为5BV/h，在线 检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集洗脱液，每2.5L 收集一瓶，共收集约8瓶，检测每瓶的万古霉素B含量情况，色谱纯 度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液10L，浓度为3.8mg/ml， 用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至150mg/ml，体 积245ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品29.8g，色谱纯度99.0% （见图7），收率为60.2%，10%溶液吸光度A=0.012。

通过对比实施例4、实施例5和实施例6可以发现，不同粒径 的C18硅胶填料反相层析效果在色谱纯度、产品收率及产品吸光度方 面影响不大，但对于操作压力来说，粒径越小压力越大，因此适用于 大规模生产最好选用30μm-60μm的C18硅胶。

实施例7：流动相中CH₃COONH₄和NH₄Cl的对比

取浓缩液330ml，浓度152mg/ml，色谱纯度95.9%（见图8）， 用盐酸调节pH=4.0，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备 柱(15cm*30cm)，用醋酸调节pH=4.0，含0.1%的CH₃COONH₄(W/V) 和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为 5BV/h，然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为 5BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集 洗脱液，每2.5L收集一瓶，共收集约8瓶，检测每瓶的万古霉素B 含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液10L， 浓度为4.0mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至150mg/ml，体 积252ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品31.1g，色谱纯度99.0% （见图9），10%溶液吸光度A=0.017。

通过和实施例5对比可以发现，用含有NH₄Cl的流动相组分和 收率与用含有CH₃COONH₄的流动相区别不大。

实施例8：流动相中不同比例NH₄Cl对比

取浓缩液330ml，浓度152mg/ml，色谱纯度95.9%，用盐酸调节 pH=4.0，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备柱 (15cm*30cm)，用盐酸调节pH=4.0，含0.5%的NH₄Cl(W/V)和8%的 甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为5BV/h， 然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为5BV/h，在线 检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集洗脱液，每2.5L 收集一瓶，共收集约9瓶，检测每瓶的万古霉素B含量情况，色谱纯 度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液12.5L，浓度为3.2mg/ml， 用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至150mg/ml，体 积260ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品32.1g，收率为64.0%， 色谱纯度99.2%（见图10），10%溶液吸光度A=0.016。

实施例9：流动相中不同比例NH₄Cl对比

取浓缩液330ml，浓度152mg/ml，色谱纯度95.9%，用盐酸调节 pH=4.0，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备柱 (15cm*30cm)，用盐酸调节pH=4.0，含1%的NH₄Cl(W/V)和8%的甲 醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为5BV/h，然 后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为5BV/h，在线检 测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集洗脱液，每2.5L 收集一瓶，共收集约9瓶，检测每瓶的万古霉素B含量情况，色谱纯 度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液12.5L，浓度为3.1mg/ml， 用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至150mg/ml，体 积258ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品32.0g，收率为63.8%， 色谱纯度99.3%（见图11），10%溶液吸光度A=0.014。

通过对比实施例5、实施例8和实施例9可以发现，不同含量的 NH₄Cl(W/V)和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相对于产品收率、 色谱组分及吸光度影响不大，但对于收集的体积会有影响。

实施例10：上柱液和流动相不同pH对比

取浓缩液670ml，浓度146mg/ml，色谱纯度96.4%，用盐酸调节 pH=3.5，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备柱 (15cm*30cm)，用盐酸调节pH=3.5，含0.5%的NH₄Cl(W/V)和8%的 甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为5BV/h， 然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为5BV/h，在线 检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集洗脱液，每2.5L 收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古霉素B含量情况，色谱 纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液12.5L，浓度为 6.3mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积380ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品63.1g，收率为64.5%， 色谱纯度99.2%，10%溶液吸光度A=0.015。

实施例11：上柱液和流动相不同pH对比

取浓缩液670ml，浓度146mg/ml，色谱纯度96.4%，用盐酸调节 pH=4.5，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备柱 (15cm*30cm)，用盐酸调节pH=4.5，含0.5%的NH₄Cl(W/V)和8%的 甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为5BV/h， 然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为5BV/h，在线 检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集洗脱液，每2.5L 收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古霉素B含量情况，色谱 纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液15L，浓度为 5.1mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积360ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品58.2g，收率为59.5%， 色谱纯度99.0%，10%溶液吸光度A=0.018。

通过对比实施例7、实施例10和实施例11可以发现，上柱液和 流动相pH=3.5和pH=4.0的产品收率和组分影响不大，上柱液pH=4.5 会导致收集的体积增大，收率和组分略有影响。

实施例12：流动相中不同浓度的CH₃COONH₄对比

取浓缩液330ml，浓度154mg/ml，色谱纯度95.9%，用盐酸或氢 氧化钠调节pH=4.0，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备 柱(15cm*30cm)，用醋酸调节pH=4.0，含0.5%的CH₃COONH₄(W/V) 和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为 5BV/h，然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为 5BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集 洗脱液，每2.5L收集一瓶，共收集约8瓶，检测每瓶的万古霉素B 含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液10L， 浓度为4.1mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至150mg/ml，体 积260ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品32.5g，收率为64.0%， 色谱纯度99.1%，10%溶液吸光度A=0.013。

实施例13：流动相中不同浓度的CH₃COONH₄对比

取浓缩液330ml，浓度154mg/ml，用盐酸或氢氧化钠调节pH=4.0， 通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备柱(15cm*30cm)，用醋 酸调节pH=4.0，含1%的CH₃COONH₄(W/V)和8%的甲醇水溶液 （V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为5BV/h，然后将流动 相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为5BV/h，在线检测波长 λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集洗脱液，每2.5L收集一 瓶，共收集约9瓶，检测每瓶的万古霉素B含量情况，色谱纯度大于 98.5%的进行混合，共得到混合层析液12.5L，浓度为3.2mg/ml，用 4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至150mg/ml，体 积265ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品33.0g，收率65.0%，色 谱纯度99.0%，10%溶液吸光度A=0.015。

通过对比实施例7、实施例12和实施例13可以发现，不同浓度 的CH₃COONH₄(W/V)和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相对于成 品含量、收率及吸光度影响不大，高浓度CH₃COONH₄对于收集体积 有影响。

实施例14：流动相为CH₃COONH₄体系下不同pH的对比

取浓缩液670ml，浓度145mg/ml，色谱纯度96.6%，用盐酸调节 pH=3.5，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备柱 (15cm*30cm)，用醋酸调节pH=3.5，含0.5%的CH₃COONH₄(W/V) 和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为 5BV/h，然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为 5BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集 洗脱液，每2.5L收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古霉素B 含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液 12.5L，浓度为6.2mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积370ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品60.6g，收率为62.4%， 色谱纯度99.2%，10%溶液吸光度A=0.016。

实施例15：流动相为CH₃COONH₄体系下不同pH的对比

取浓缩液650ml，浓度156mg/ml，色谱纯度95.7%，用盐酸或氢 氧化钠调节pH=4.0，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备 柱(15cm*30cm)，用醋酸调节pH=4.0，含0.5%的CH₃COONH₄(W/V) 和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为 5BV/h，然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为 5BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集 洗脱液，每2.5L收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古霉素B 含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液 12.5L，浓度为6.4mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积385ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品63.9g，收率为63.0%， 色谱纯度99.0%，10%溶液吸光度A=0.014。

实施例16：流动相为CH₃COONH₄体系下不同pH的对比

取浓缩液670ml，浓度145mg/ml，色谱纯度96.6%，用氢氧化钠 调节pH=4.5，通过装有粒径为30μm的C18硅胶填料的制备柱 (15cm*30cm)，用醋酸调节pH=4.5，含0.5%的CH₃COONH₄(W/V) 和8%的甲醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗100mim，流速为 5BV/h，然后将流动相中甲醇比例提高至12%进行洗脱，流速为 5BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时，开始收集 洗脱液，每2.5L收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古霉素B 含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析液 12.5L，浓度为6.1mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积370ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品61.0g，收率为62.8%， 色谱纯度99.1%，10%溶液吸光度A=0.018。

通过对比实施例14、实施例15和实施例16可以发现，上柱液 和流动相的pH控制在3.5-4.5之间，对于制备产品的收率和质量影响 不大。

实施例17：聚合物填料PS树脂反相制备实施例

取浓缩液680ml，浓度148mg/ml，色谱纯度95.9%，用盐酸调节 pH=4.0，通过装有粒径为20μm的PS吸附树脂的制备柱(15cm*30cm)， 用盐酸调节pH=4.0，5%的乙醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗 60mim，流速为2BV/h，然后将流动相中乙醇比例提高至10%进行洗 脱，流速为2BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时， 开始收集洗脱液，每2L收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古 霉素B含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析 液12L，浓度为6.4mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积365ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品60.6g，收率为60.2%， 色谱纯度99.3%，10%溶液吸光度A=0.016。

实施例18：聚合物填料PS树脂反相制备实施例

取浓缩液680ml，浓度148mg/ml，色谱纯度95.9%，用盐酸调节 pH=3.5，通过装有粒径为20μm的PS吸附树脂的制备柱(15cm*30cm)， 用盐酸调节pH=3.5，5%的乙醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗 60mim，流速为2BV/h，然后将流动相中乙醇比例提高至10%进行洗 脱，流速为2BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时， 开始收集洗脱液，每2L收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古 霉素B含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析 液12L，浓度为6.2mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积370ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品61.2g，收率为60.8%， 色谱纯度99.0%，10%溶液吸光度A=0.015。

实施例19：聚合物填料PS树脂反相制备实施例

取浓缩液650ml，浓度158mg/ml，色谱纯度96.2%，用盐酸调节 pH=3.5，通过装有粒径为40μm的PS吸附树脂的制备柱(15cm*30cm)， 用盐酸调节pH=3.5，5%的乙醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗 60mim，流速为2BV/h，然后将流动相中乙醇比例提高至10%进行洗 脱，流速为2BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时， 开始收集洗脱液，每2L收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古 霉素B含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析 液12L，浓度为7.1mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积400ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品64.7g，收率63.0%，色 谱纯度99.0%，10%溶液吸光度A=0.012。

实施例20：聚合物填料PS树脂反相制备实施例

取浓缩液650ml，浓度158mg/ml，色谱纯度96.2%，用盐酸调节 pH=4.0，通过装有粒径为40μm的PS吸附树脂的制备柱(15cm*30cm)， 用盐酸调节pH=4.0，5%的乙醇水溶液（V/V）作为流动相进行预洗 60mim，流速为2BV/h，然后将流动相中乙醇比例提高至10%进行洗 脱，流速为2BV/h，在线检测波长λ=280，待吸收值开始快速上升时， 开始收集洗脱液，每2L收集一瓶，共收集约10瓶，检测每瓶的万古 霉素B含量情况，色谱纯度大于98.5%的进行混合，共得到混合层析 液12L，浓度为6.8mg/ml，用4N的盐酸调节pH=2.8。

将上述层析液通过孔径为400分子量的纳滤膜进行脱溶剂，待透 出液没有溶剂产生则开始浓缩，将混合液浓度浓缩至200mg/ml，体 积380ml，然后将浓缩液经过0.45μm滤膜进行过滤，放入冷冻干燥 机进行冻干，得到盐酸万古霉素冻干粉成品63.5g，收率61.8%，色 谱纯度99.1%，10%溶液吸光度A=0.018。

实施例17-20，使用两种规格的聚合物反相填料PS进行了制备 层析，并分别利用不同的pH条件进行制备，结果显示制备的成品组 分、收率及吸光度差异不大，效果较好。

需要说明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所 提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本 领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、 或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。