一种基于表面等离子体共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法

摘要

本发明提供了一种基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法，该方法通过建立用于蛋白质固定的模型，根据模型来优化芯片表面的化学修饰，控制活性位点之间的距离，从而能够在表面等离子共振成像生物传感器芯片上固定蛋白质。通过本发明的方法保证了蛋白质的单点固定，从而避免了因蛋白质被多点固定而导致的失活，并且通过表面等离子共振成像技术确认了通过此方法固定蛋白质能够获得优化的检测信号。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质芯片阵列领域，涉及一种基于表面等离子体共振成像生 物传感器芯片的蛋白质固定方法。

背景技术

在免疫检测领域，包被抗体(一抗)的定向排列引起了广泛的兴趣和关注。 在传统检测中，包被抗体被动地吸附在基底(通常是热塑性聚合物，例如聚苯 乙烯)表面，使得仅仅20～30％的包被抗体获得了理想的取向而拥有检测活性。 在典型的免疫检测中，对包被抗体的非有效固定问题一直少有关注。通常包被 抗体被过量地固定在固相表面，以保证有足够多的抗体吸附在表面时具有合适 的取向，用以产生可靠的检测信号。然而，当扩展到微米或纳米层面的应用时， 固定在表面的抗体需要将一定浓度的Fc端暴露在外面来保证获得足够的检测信 号，此时包被抗体错误的取向固定会产生更大的问题。直接取向固定包被抗体 是提升检测性能的有效手段，据Wilson DS和Knock S报道，通过直接取向固定 包被抗体使信号提高可达10倍，这在微纳米层面的应用中体现更为突出。将抗 体固定在基底表面有多种方法，包括吸附固定、共价固定和亲和固定，对于取 向固定抗体也有一些相应的技术。目前，大多数直接固定抗体的工作主要集中 在抗体Fc端的化学修饰以及其他化学修饰方法，这些方法都可以提高固定抗体 的有效活性。然而，特定基团固定的策略，尤其是由于固定使抗体变性，或当 抗体的Fab段由于固定的取向被埋藏，可能导致抗体生物活性的丧失。

对于商业化治疗性抗体的质量控制来说，最好有一种无标记或者对抗体没 有预先化学修饰的技术进行检测。在这类案例当中，过去报道过的取向固定方 法由于必须在固定抗体之前进行化学改性，带来一些不便。另一方面，随机共 价固定的方式对某些商业化的治疗性抗体有时也可能无效，原因是被固定的基 团很有可能在抗体的结合位点附近，而且这些抗体更有可能在表面上被多点固 定，从而导致抗体失活。

因此，在本领域需要开发一种能够单点固定蛋白质并获得较优化的检测信 号的蛋白质固定方法。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于表面等离子体共振 成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方 法，所述方法包括以下步骤：

(1)建立用于蛋白质固定的模型；

(2)根据所述模型优化芯片表面的化学修饰；

(3)在芯片上固定蛋白质；

(4)利用表面等离子共振成像来检测固定的蛋白质的信号。

本发明所述基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法中 步骤(1)所述用于蛋白质固定的模型为：

$r=1*\sqrt{D_F},$

其中l为硫醇直径，r为活性末端之间的平均距离，D_F为活性末端硫醇溶液 被同浓度非活性末端硫醇溶液稀释的倍数；

所述用于蛋白质固定的模型的推导过程如下：

A＝a*D_F  (I)

考虑a≈l²并且代入式(I)得到：

A＝l²*D_F  (II)

考虑活性末端硫醇在有效区域的中心，有效区域假设为正方形，所以r可以 如下计算：

$r\approx \sqrt{A}---\left(\mathrm{III}\right)$

将式(II)代入式(III)得出所述模型，

其中a为硫醇面积，A为平均一个活性末端硫醇分子所占的有效面积。

本发明所述基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法中 步骤(2)所述优化芯片表面的化学修饰包括以下步骤：

(A)根据所述模型确定活性末端硫醇溶液被同浓度非活性末端硫醇溶液稀 释的倍数D_F；

(B)清洗芯片，氮气吹干，放入等离子体清洗仪中清洗3分钟；

(C)配制混合硫醇溶液：将活性末端硫醇溶液用同浓度非活性末端硫醇溶 液稀释D_F倍，制成混合硫醇溶液；

(D)将芯片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4℃恒温孵育过夜，取出芯片， 清洗芯片表面，氮气吹干，备用。

本发明所述活性末端硫醇为一端带有活性基团的有机硫醇化合物，活性末 端可以是羧基、醛基、酰基、环氧基、氰基、卤代烃基、酯基等便于进行化学 修饰的基团。在本发明中所述活性末端硫醇与非活性末端硫醇是一对相互对应 的概念，其中所述活性与非活性是相对于硫醇末端进行化学修饰时要连接的物 质而言的，例如，如果待连接的物质是蛋白质，则硫醇末端可与蛋白质的氨基 反应的定义为活性末端硫醇，硫醇末端不能与蛋白质的氨基反应的定义为非活 性末端硫醇，例如此时可将羧基末端硫醇称为活性末端硫醇，而将烷氧基末端 硫醇称为非活性末端硫醇；再如，对于复杂的芯片表面三维修饰，要在二维修 饰基础上再次进行修饰，此时所利用的例如硫醇引发剂末端可能带有卤代烃基 引发端，此时将卤代烃基末端硫醇称为活性末端硫醇，而可利用不与修饰物基 团反应的羟基末端硫醇为非活性末端硫醇，但是如果待连接的物质是可以与羟 基反应达到化学修饰目的时，羟基末端硫醇则被称为活性末端硫醇。

在本发明中所述活性末端硫醇可以为但不限于羧基末端硫醇、醛基末端硫 醇、酰基末端硫醇、环氧基末端硫醇、卤代烃基末端硫醇、氰基末端硫醇和酯 基末端硫醇中的任意一种；本发明所述非活性末端硫醇可以为但不限于烷基末 端硫醇、烷氧基末端硫醇和羟基末端硫醇中的任意一种。

在本发明方法的步骤(2)所述优化芯片表面的化学修饰的步骤(B)和步 骤(D)中在氮气吹干前所述清洗芯片独立地为用乙醇和去离子水交替清洗。

本发明方法的步骤(2)所述优化芯片表面的化学修饰包括优化芯片表面的 二维化学修饰和/或三维化学修饰。芯片表面的二维化学修饰是指在芯片表面用 直链化学修饰物进行修饰，从而在芯片表面形成二维化学结构；所述三维化学 修饰是指利用支化或超支化化学修饰物(如支化或超支化聚合物)来修饰芯片 表面，或者在芯片表面形成二维化学结构之后，利用二维化学结构的活性末端 再与支化或超支化化学修饰物反应，使表面形成支化或超支化的三维化学结构。

本发明所述基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法中 步骤(3)所述在芯片上固定蛋白质包括以下步骤：

(a)将表面化学修饰优化的芯片浸入芯片表面上活性末端的活化试剂的溶 液中活化；

(b)用去离子水清洗芯片，氮气吹干，将目标蛋白质溶液在芯片表面打印 形成蛋白质阵列；

(c)用2％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在室温下封闭20分钟，完 成芯片上蛋白质的固定。

本发明所述在芯片上固定蛋白质的步骤(a)中所述芯片表面上活性末端的 活化试剂是指能够使经修饰的芯片表面的活性末端活化的试剂，在本发明中该 活化试剂可以根据活性末端基团的不同选择1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.4M/0.1M)混合溶液或者N,N'- 琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的二甲基甲酰胺 (DMF)溶液。

在本发明所述在芯片上固定蛋白质的步骤(b)中所述将目标蛋白质溶液在 芯片表面打印为手动点样或利用蛋白质打印机进行。

本发明所述在芯片上固定蛋白质不局限于在芯片上固定一种蛋白质，还可 以在第一种蛋白质固定之后，通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用将第二种或 两种以上的其他蛋白质固定在芯片上，例如，可以先将链霉亲和素固定在芯片 上，而后通过链霉亲和素与生物素标记蛋白之间的特异结合将生物素标记蛋白 固定在芯片上。

本发明所述基于表面等离子共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方法中 步骤(4)所述利用表面等离子体共振成像(SPRi)来检测固定蛋白质的信号包 括以下步骤：清洗表面打印有蛋白质阵列的芯片，吹干后装入表面等离子体共 振成像仪，向系统中加入缓冲溶液，调整光学位置以选定点样点，待基线稳定 之后，用重生液将芯片表面重生5次，通入待检测溶液，重生，依次通入校正 液1和校正液2，检测蛋白质的信号。

在本发明所述利用表面等离子体共振成像来检测固定的蛋白质的信号中所 述清洗为用PBS缓冲液和去离子水依次清洗；优选地，所述缓冲溶液为含0.05％ 吐温20的1xPBS，pH＝7.4；优选地，所述重生液为溶质磷酸与溶剂水的体积比 为1:400的磷酸溶液；优选地，所述待检测溶液为能够与所述芯片上固定的蛋白 质发生相互作用而产生可检测信号的蛋白质溶液，例如当芯片上固定的蛋白质 为抗体hR3或生物素标记蛋白时，检测溶液可以是EGFR溶液，当芯片上固定 的蛋白质为His标签的抗体，检测溶液可以是细胞裂解液(全蛋白浓度)；优选 地，所述校正液1为1xPBS，校正液2为2xPBS。

本发明所述PBS是指磷酸盐缓冲溶液，所述1xPBS的1L配方为：氯化钠 (NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.44g，磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)0.24g；所述2xPBS的溶质浓度为1xPBS中溶质浓度的2倍。

在本发明所述基于表面等离子体共振成像生物传感器芯片的蛋白质固定方 法中所述芯片以金或银为基底。

本发明提供了一种固定蛋白质的方法，简单地说，可以通过控制活性位点 之间的距离，来控制抗体或者其他蛋白质被单点固定在表面，从而避免蛋白质 被多点固定而导致的失活，同时使得活性位点暴露在溶液中，即使被固定的基 团在活性位点周围，也能够保证获得抗原与抗体相互作用的检测信号。本发明 在金或银表面上实现了治疗性抗体阵列的制备，并利用表面等离子体共振成像 技术对抗体进行了确认。

本发明具有以下有益效果：本发明通过建立模型来优化芯片表面的化学修 饰，从而达到控制活性位点之间的距离，使得能够在表面等离子体共振成像传 感器芯片上固定蛋白质，保证了蛋白质的单点固定，从而避免了因蛋白质被多 点固定而导致的失活，并且通过表面等离子体共振成像技术确认了通过此方法 固定蛋白质能够获得优化的检测信号，因此本发明方法在保证蛋白质被固定在 表面的同时使得活性位点暴露在溶液中，即使被固定的基团在活性位点周围， 也能够保证获得抗原与抗体相互作用的较高检测信号。

附图说明

图1是本发明中用于蛋白质固定模型的建立过程图。

图2是hR3抗体Fc端的赖氨酸(粗线标出)。

图3是利用表面等离子体成像检测芯片上蛋白质得到的在不同硫醇稀释倍 数下的信号强度随时间的变化图。

图4是利用表面等离子体成像检测芯片上蛋白质得到的不同硫醇稀释倍数 下信噪比的图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员 应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

建立用于蛋白质固定的模型并对模型进行验证

模型的建立：

目的在于建立一个基于羧基/氨基偶联共价固定蛋白的模型，该模型可以反 映出二维芯片表面羧基密度(距离)与两种硫醇溶液混合比例的关系。在芯片 表面，利用两种末端基团(羧基、烷氧基)的硫醇在金表面形成自组装单分子 层，其一，可以保护芯片表面，起到抗非特异性吸附的作用；其二，可以提供 末端基团(主要利用羧基)，与抗体残留氨基反应，共价偶联，将抗体固定在 芯片表面。利用该模型，就可以相对精确地控制表面羧基的密度(距离)，避 免因羧基过多导致的抗体被多点固定而失活的现象，又可以避免羧基过少引起 的抗体固定量不足，导致信号下降的现象。

建立的模型(图1)如下：

$r=1*\sqrt{D_F},$

其中l为硫醇直径，r为羧基末端之间的平均距离，D_F为羧基末端硫醇溶液 被同浓度烷氧基末端硫醇溶液稀释的倍数；

所述用于蛋白质固定的模型的推导过程如下：

A＝a*D_F  (I)

考虑a≈l²并且代入式(I)得到：

A＝l²*D_F  (II)

考虑羧基末端硫醇(活性末端硫醇)在有效区域的中心，有效区域假设为 正方形(如图1所示)，所以r可以如下计算：

$r\approx \sqrt{A}---\left(\mathrm{III}\right)$

将式(II)代入式(III)得出

其中a为硫醇面积，A为平均一个羧基末端硫醇分子所占的有效面积。

对于需要提供动力学信息的研究来说，由于实验过程中需要对样品进行多 次重生，所以共价固定是最理想的一种方法。单克隆抗体的平均长度是15nm左 右。对于精确固定来说，当活性位点(即硫醇的活性末端)的间距r在15nm以 上才能发挥固定抗体的活性。r的值与硫醇稀释倍数D_F相关，由所建立的模型 计算得出稀释倍数D_F与活性位点间距离r的关系，如表1所示：

表1 稀释倍数D_F与活性位点间距离r的关系

D_Fr(nm) 100 5 500 11 1000 16 5000 35

根据以上模型确定的硫醇稀释倍数D_F与活性位点间距离r的关系，来制备 表面等离子体共振成像生物传感器芯片，在芯片上固定蛋白质，步骤如下：

(1)将芯片用乙醇、去离子水交替清洗，氮气吹干；放入等离子体清洗仪 中清洗3分钟；

(2)配制自组装单分子层所需混合硫醇溶液，将1mM的HS-PEG₆-COOH 乙醇溶液用1mM的HS-PEG₄-OCH₃乙醇溶液稀释100、500、1000和5000倍， 分别配置4种混合硫醇溶液；

(3)将4个芯片分别浸入配制好的4种混合硫醇溶液中，4℃恒温孵育过 夜(12h)。取出芯片，用乙醇和去离子水交替清洗芯片表面，氮气吹干备用。

(4)将芯片分别浸入EDC/NHS(0.4M/0.1M)混合溶液中孵育30分钟；

(5)将芯片用去离子水清洗，氮气吹干，将0.2mg/mL hR3抗体在4个芯 片表面上分别打印4个点；

(6)用2％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在室温下封闭20分钟，完 成芯片上蛋白质的固定。

对于此模型，采用了一种商业化的治疗性单克隆抗体(hR3)的阵列来验证 此模型。hR3抗体在与EGFR的结合位点附近存在大量的赖氨酸(图2，粗线表 示赖氨酸)。遵循共价固定的标准流程，即EDC/NHS活化方法。简单地说，用 EDC/NHS将表面的羧基基团活化成为活性酯，进一步与氨基(在蛋白质分子中， 这些自由的氨基主要是赖氨酸贡献的)进行反应形成酰胺键，从而将抗体固定 于芯片上。而后利用表面等离子体共振成像来检测芯片表面抗体hR3与EGFR 结合的信号，结果如图3和图4所示。

根据建立的模型分析：如果活性位点(羧基)间距r小于hR3的长度，那 么hR3很有可能在表面上被多点固定(蛋白上多个氨基残留)，这样会对EGFR 的结合产生位阻。增加稀释倍数D_F，活性位点间距r会增大，但是会导致蛋白 固定量减少。最理想的状态是，活性位点的平均间距r略大于蛋白的长度。对于 此模型来说，稀释倍数Df＝1000，即活性位点间距r＝16nm，略大于hR3的平 均长度(15nm)，此时应该为检测效率最高的时候。

从实验结果来看(图3和图4)，在D_F＝1000处，蛋白检测的信号强度最高， 信噪比最高，与模型预测结果一致。而传统的方法，稀释倍数D_F为10，即r为 1.5nm左右，也许这就是为什么许多抗体在此固定方法上无法检测的原因。

实施例1：治疗性抗体hR3在芯片二维表面上的固定

根据上述模型得出最佳稀释倍数D_F＝1000，根据以下步骤将治疗性抗体hR3 在芯片二维表面上进行固定并通过表面等离子体共振成像检测：

(1)将芯片用乙醇、去离子水交替清洗，氮气吹干；放入等离子体清洗仪 中清洗3分钟；

(2)配制自组装单分子层所需混合硫醇溶液，将1mM的HS-PEG₆-COOH 乙醇溶液用1mM的HS-PEG₄-OCH₃乙醇溶液稀释1000倍；

(3)将芯片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4℃恒温孵育过夜(12小时)。 取出芯片，用乙醇和去离子水交替清洗芯片表面，氮气吹干备用。

(4)将芯片分别浸入EDC/NHS(0.4M/0.1M)混合溶液中孵育30分钟；

(5)将芯片用去离子水清洗，氮气吹干，将0.2mg/mL hR3抗体在芯片表 面上打印4个点；

(6)用2％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在室温下封闭20分钟，完 成芯片上hR3抗体的固定；

(7)SPRi检测：用PBS缓冲液和去离子水依次清洗表面打印有hR3抗体 阵列的芯片，吹干后装入表面等离子体共振成像仪，向系统中加入缓冲溶液 1xPBS(含0.05％吐温20，pH＝7.4)，调整光学位置以选定点样点，待基线稳定 之后，用重生液(溶质磷酸与溶剂水的体积比为1:400的磷酸溶液)将芯片表面 重生5次，通入150nM的EGFR溶液，重生，依次通入校正液1xPBS和2xPBS， 检测信号。

实施例2：治疗性抗体在芯片三维表面上的共价固定

基于表面生长的三维表面都是在二维表面基础上开发的，其方法都是先在 二维表面上固定引发剂，再进行聚合生长。一种典型的例子就是表面自组装单 硫醇末端的超支化聚乙二醇结构(HPGs)。这些表面已经被应用在表面等离激 元共振成像上，特别是应用于蛋白阵列和小分子微阵列的检测。在一些案例中， 体积较大的蛋白如抗体，表面上的空间位阻会直接影响表面的检测功能。如果 表面的引发剂密度过高，会导致在垂直空间中，超支化聚乙二醇分子间的距离 太短，会产生相当的空间位阻。当通入大的蛋白质时，就会导致蛋白无法扩散 到三维表面的底部，影响检测信号。

对于SPRi检测时，此问题尤为严重，因为检测灵敏度随着与金表面距离的 增大而显著降低，当蛋白因为表面空间位阻无法扩散到底部时，信号的质量就 大打折扣。为了很好地控制表面超支化聚乙二醇分子间的距离，需要从二维底 部层面进行引发剂密度的调控。在此，可以利用上述模型，引发剂可以作为活 性连接体，在底层进行调控。在蛋白固定的实验中，引发剂之间的平均距离至 少为抗体蛋白直径(约15nm)的2倍，即合适距离在30nm左右。利用所建立 的模型得出，理想的稀释倍数D_F在3600左右。

确定了最佳稀释倍数D_F后，可根据以下步骤将治疗性抗体在芯片三维表面 上进行共价固定并通过表面等离子体共振成像检测：

(1)将芯片用乙醇、去离子水交替清洗，氮气吹干，将芯片放入等离子体 清洗仪中清洗3分钟；

(2)将1mM引发剂硫醇BrC(CH₃)₂COO(CH₂)₁₁SH的乙醇溶液用1mM  EG₃-(CH₂)₁₁-SH(EG代表乙二醇)的乙醇溶液稀释3600倍，配置成混合硫醇溶 液；

(3)将芯片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4℃恒温孵育过夜(12小时)， 取出芯片，用乙醇和去离子水交替清洗芯片表面，氮气吹干备用；

(4)制备超支化聚乙二醇聚合溶液，64mg二联吡啶，0.04M的CuCl₂(10mL)， 2.6g甲基丙烯酸二乙二醇酯(HEMA)，7.2g甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯 (OEGMA526)，20mL去离子水以及20mL甲醇。氮气保护下脱气搅拌30分 钟；

(5)向聚合溶液中加入10mL抗坏血酸水溶液(0.04M)，将芯片浸入混 合聚合溶液中，氮气环境下反应16小时。达到反应时间后，取出芯片，乙醇和 水清洗，氮气吹干；

(6)将芯片浸入1M DSC和1M DMAP的DMF溶液中，反应16小时；

(7)将芯片用去离子水清洗，氮气吹干，将0.2mg/mL hR3抗体在表面上 打印4个点；

(8)用2％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在室温下封闭20分钟，完 成芯片上hR3抗体的固定；

(9)SPRi检测：用PBS缓冲液和去离子水依次清洗表面打印有hR3抗体 阵列的芯片，吹干后装入表面等离子体共振成像仪，向系统中加入缓冲溶液 1xPBS(含0.05％吐温20，pH＝7.4)，调整光学位置以选定点样点，待基线稳定 之后，用重生液(溶质磷酸与溶剂水的体积比为1:400的磷酸溶液)将芯片表面 重生5次，依次通入300nM、150nM和75nM的EGFR溶液，重生，依次通入 校正液1xPBS和2xPBS，检测信号。

实施例3：带有His标签的抗体在芯片上的固定

因为许多蛋白在纯化的时候都是采用过NTA/Ni²⁺层析柱的方法，蛋白上通 常会带有His标签。在一些研究中，如对细胞裂解液总生物标记物的识别，定量 结合信息很重要，而NTA表面对这类蛋白固定是一个很好的选择。对于必要使 用的Ni²⁺离子，它会在表面引起非特异性吸附，所以，在保证蛋白固定量的前 提下，Ni²⁺的含量越少越好，这就转化成了控制表面NTA量的问题。

对于His标记的抗体，在共价固定的方法中，最理想的状态就是一个NTA 结合一个带有His标签的蛋白，过多只会增加非特异性吸附。正如之前讨论的那 样，单克隆抗体平均长度为15nm，相对应的最佳稀释倍数为D_F＝1000。

确定了最佳稀释倍数D_F后，可根据以下步骤将带有His标签的抗体固定在 芯片上并通过表面等离子体共振成像检测：

(1)将芯片用乙醇和去离子水交替清洗，氮气吹干，将芯片放入等离子体 清洗仪中清洗3分钟；

(2)配制自组装单分子层所需混合硫醇溶液，将1mM的HS-PEG₆-COOH 乙醇溶液用1mM的HS-PEG₄-OCH₃乙醇溶液稀释1000倍；

(3)将芯片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4℃恒温孵育过夜(12小时)， 取出芯片，用乙醇和去离子水交替清洗芯片表面，氮气吹干备用；

(4)将芯片浸入EDC/NHS(0.4M/0.1M)混合溶液中孵育30分钟；

(5)将芯片浸入0.1mg/mL NH₂-NTA溶液中，室温孵育30分钟；

(6)将芯片浸入NiCl₂溶液中室温孵育5分钟；

(7)将芯片用去离子水清洗，氮气吹干。在芯片表面打印带有His标签的 抗体阵列，制备成抗体芯片；

(8)用2％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在室温下封闭20分钟，完 成芯片上带有His标签的抗体的固定；

(9)SPRi检测：用PBS缓冲液和去离子水依次清洗表面打印有His标签 的抗体阵列的芯片，吹干后装入表面等离子体共振成像仪，向系统中加入缓冲 溶液1xPBS(含0.05％吐温20，pH＝7.4)，调整光学位置以选定点样点，待基 线稳定之后，用重生液(溶质磷酸与溶剂水的体积比为1:400的磷酸溶液)将芯 片表面重生3次，通入0.2mg/mL的细胞裂解液(全蛋白浓度)，重生，依次通 入校正液1xPBS和2xPBS，检测信号。

实施例4：生物素标记蛋白的固定

生物素标记的蛋白质主要用于取向固定并应用于蛋白质阵列中。由于生物 素和链霉亲和素极强的亲和力，与共价结合水平相当，一旦蛋白质以此形式被 固定在表面，便可以经受住表面的多次重生。这样，被固定的蛋白与流动相蛋 白相互作用的动力学就可以被SPRi检测出来，例如对特定抗原在抗体库中进行 筛选。

这里，通过减少表面活性位点的数量(活性位点用来共价固定链霉亲和素)， 就可能减少表面的非特异性吸附。对于生物素标记的抗体来说，根据上述模型 确定D_F＝1000时，一个链霉亲和素上只连接一个抗体分子。

确定了最佳稀释倍数D_F后，可根据以下步骤将链霉亲和素固定在芯片上， 而后通过链霉亲和素与生物素标记蛋白特异性结合，从而将生物素标记蛋白固 定在芯片上并通过表面等离子体共振成像进行检测：

(1)将芯片用乙醇和去离子水交替清洗，氮气吹干，将芯片放入等离子体 清洗仪中清洗3分钟；

(2)配制自组装单分子层所需混合硫醇溶液，将1mM的HS-PEG₆-COOH 乙醇溶液用1mM的HS-PEG₄-OCH₃乙醇溶液稀释1000倍；

(3)将芯片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4℃恒温孵育过夜(12小时)， 取出芯片，用乙醇和去离子水交替清洗芯片表面，氮气吹干备用；

(4)将芯片浸入EDC/NHS(0.4M/0.1M)混合溶液中孵育30分钟；

(5)将0.2mg/mL的链霉亲和素溶液铺在芯片表面，使之固定在芯片上；

(6)用2％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在室温下封闭20分钟；完 成芯片上链霉亲和素的固定；

(7)将芯片用去离子水清洗，氮气吹干，在芯片表面打印带有生物素标签 的蛋白(如hR3抗体的突变体库)形成抗体微阵列芯片；

(8)SPRi检测：用PBS缓冲液和去离子水依次清洗表面打印有带有生物 素标签的蛋白质阵列的芯片，吹干后装入表面等离子体共振成像仪，向系统中 加入缓冲溶液1xPBS(含0.05％吐温20，pH＝7.4)，调整光学位置以选定点样 点，待基线稳定之后，用重生液(溶质磷酸与溶剂水的体积比为1:400的磷酸溶 液)将芯片表面重生3次，通入300nM的EGFR溶液，重生，依次通入校正液 1xPBS和2xPBS，检测信号。

对本发明实施例1-4中所述蛋白质固定后的芯片进行表面等离子体共振成 像检测时都可以检测到较高的信号强度并产生较强的信号信噪比。这也证明本 发明通过建立蛋白质固定模型，进而优化芯片表面化学修饰，控制活性位点间 距离，从而可以将蛋白质相对精确地固定在表面等离子体共振成像生物传感器 芯片上。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的蛋白质固定方法，但 本发明并不局限于上述具体步骤，即不意味着本发明必须依赖上述具体方法步 骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本 发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本 发明的保护范围和公开范围之内。